2.2K Views
•
11:32 min
•
August 6th, 2021
DOI :
August 6th, 2021
•0:04
Introduction
0:54
Tumor Homogenate Preparation
4:27
Substrate, Uncoupler, Inhibitor Titration Protocol (SUIT)
9:00
Results: Mitochondrial Function of Excised Solid Tumors Homogenates
10:52
Conclusion
Transcript
Denne protokollen beskriver en enkel og rask metode for måling av tumor mitokondriefunksjon. Protokollen er bredt anvendelig for klinisk translasjonell onkologi, og vil bidra til å forbedre diagnostisk og mekanistisk tolkning av mitokondrienes rolle i utbruddet og progresjonen av kreft. Den største fordelen med denne teknikken er anvendelsen av vev homogenisering for å forenkle forberedelsen og maksimere utbyttet av mitokondrier samtidig som begrensningene for diffusjon reduseres.
Denne teknikken tilbyr potensielle anvendelser i kliniske og diagnostiske omgivelser med en kvantitativ vurdering av tumor mitokondriefunksjon ved hjelp av nybiopsied eller utskilt tumorvev. Begynn med å plassere en glass homogenisator som inneholder en milliliter mitokondrie respirasjonsmedium, eller MiR05, i en tettsittende glass pestle på våt is. Legg vevet i en milliliter biopsibevaringsløsning, eller BIOPS, i en iskald Petri-tallerken.
Skjær svulsten i små biter på ca. 5 til 10 milligram hver, og legg de resterende tumorbitene tilbake i 10 milliliter BIOPS holdt på is. Etter blotting vev seksjoner nøye på et filterpapir, plasser dem på en liten plast tjære veiebåt og registrere den første våte vekten. Plasser de ubrukte delene tilbake i det koniske røret med 10 milliliter BIOPS for fortsatt bevaring.
Senk vevsseksjonene ned i en iskald homogenisator som inneholder MiR05, og registrer den gjenværende vekten på veiebåten. Ved hjelp av en glass pestle med et klaringsområde på 0,09 til 0,16 millimeter, forstyrrer du forsiktig tumorvevet ved å fullføre fem til syv ned og opp slag. For hvert slag roterer du pestle i en bevegelse med urviseren / mot klokken tre ganger mens du skyver pestle ned, og tre ganger til mens du trekker pestle opp igjen.
La vevet slå seg ned til bunnen av homogenisatoren mellom slag, men unngå å bringe pestle helt over væskevolumet for å forhindre skumming. Hell homogenatet i et konisk rør på 15 milliliter og legg det på is. Pipette en til tre milliliter frisk MiR05 over pestle og inn i homogenisatoren for å vaske gjenværende vev homogenat.
Hell MiR05-vasken i det koniske røret som inneholder homogenatet. Gjenta dette trinnet to til tre ganger for å sikre fullstendig overføring av homogenatet. For å nøyaktig beregne vevshomogenatkonsentrasjonen, må du nøye inspisere homogenisatoren og homogenatet for gjenværende ikke-homogenisert materiale, som inkluderer bindevev.
For å fjerne det ikke-homogeniserte materialet fra homogenisatoren som ikke kan nås med pinsett, etter å ha lagt MiR05 til homogenisatoren, aspirerer volumet, inkludert vevet, med en pipette og flytt innholdet til en Petri-tallerken. Fjern det ikke-homogeniserte materialet som er avgjort i store stykker på bunnen av det koniske røret fra homogenatet ved å aspirere dem med en pipette, og legg dem på hetten på det koniske røret. Fjern vevet fra Petri-parabolen eller konisk rørhette med pinsett, og flekk det på filterpapir.
Tilsett det gjenværende homogenatet fra den koniske rørhetten tilbake i det koniske røret. Hette røret, og snu deretter for å blande. Reinspekt homogenisatorene og homogenate for ytterligere ikke-homogenisert materiale, og gjenta trinnene for å fjerne ikke-homogenisert materiale om nødvendig.
Vei og registrer massen av det ikke-homogeniserte materialet som er gjenopprettet fra homogenisatoren. Inspiser homogenatpreparatet for grovt intakt vev som overføres, og fjernet de ikke-homogeniserte stykkene og vei etter behov. Trekk vevsvekten som er gjenvunnet fra veiebåten, homogenisatoren og homogenat fra den opprinnelige våte vekten for å beregne den endelige prøvevekten.
Bruk den endelige prøvevekten, legg til ekstra MiR05 for å bringe homogenat til ønsket konsentrasjon. Når homogenatet er veid og forberedt, fortsett å analysen så snart som mulig. Oppbevar prøven lagret på våtis til den overføres til instrumentet.
Når instrumentet er kalibrert og prøven er forberedt, fjern stopperne med en vridningsbevegelse og aspirer MiR05 fra kamrene, og unngå membranen som er eksponert inne i kammeret. Bland homogenatbrønnen, og tilsett 2,25 milliliter av homogenatet til kammeret. Anta at ett homogenat legges til flere kamre, pipette en milliliter av homogenatet om gangen i hvert kammer mens du blander homogenatet for å sikre lik vevsfordeling.
Klikk på F4 for å navngi og tidsstempel hendelsen, og klikk deretter på OK. Fyll en 50 milliliter sprøyte med oksygen fra en oksygentank med regulator og gassrør ved hjelp av en stump 18-gauge nål. Injiser oksygenet direkte i kamrene for å hyperoksygenat dem til ca. 500 mikromolar oksygen.
Sett stopperne løst inn og vent med å lukke til oksygenet når ca. 480 mikromolar. Med en vridningsbevegelse lukker du kammeret langsomt og lar åndedrettet likevekte i ca. 15 til 20 minutter. Fyll om nødvendig proppens sentrale kapillær med MiR05.
Bruk dedikerte mikrosyringer for å injisere substrater, uncouplers og inhibitorer i helt lukkede kamre for å navngi og tidsstemple hendelsene for hvert kammer i sanntid. Velg F6 for å justere oksygenkonsentrasjonen og oksygenhellingens negative skalaer etter behov. Etter hver injeksjon, vask sprøyten tre ganger i vann for vannløselige forbindelser, og 70% etanol for etanoloppløsede forbindelser.
Tilsett fem mikroliter 0,8-molar malate og fortsett umiddelbart til neste injeksjon. Vask injeksjonssprøyten tre ganger i vann. Tilsett umiddelbart fem mikroliter av 1-molar pyruvat, og vent på at åndedrettet stabiliserer seg.
Etter vasking av sprøyten, tilsett 10 mikroliter 0,5-molar ADP og vent på at ADP-responsen stabiliserer seg. Vask sprøyten og tilsett fem mikroliter 2-molar glutamat og vent på at åndedrettet stabiliserer seg. Vask sprøyten, tilsett deretter fem mikroliter 4 millimolar cytokrom-C, og vent på at åndedrettet stabiliserer seg.
Etter vasking av sprøyten, tilsett 20 mikroliter 1-molar succinate og vent på at åndedrettet stabiliserer seg. Titratet trinn på 0,5 til 1 mikroliter på 1 millimolar FCCP og vent til åndedrettet stabiliserer seg etter hver injeksjon. Fortsett til det ikke er noen ytterligere økning i åndedrett.
Vask injeksjonssprøyten tre ganger i 70% etanol. Tilsett to mikroliter av 150-mikromolar rotenon og vent på at åndedrettet stabiliserer seg. Tilsett en annen mikroliter rotenon for å sikre at det ikke er ytterligere hemming.
Hvis det er en reduksjon i åndedrett, fortsett med flere injeksjoner til det ikke er noen reduksjon i åndedrett, og vask deretter injeksjonssprøyten tre ganger i 70% etanol. Tilsett to mikroliter av 125-mikromolar antimycin A og vent på at åndedrettet stabiliserer seg. Tilsett en annen mikroliter antimycin A for å sikre at det ikke er ytterligere hemming.
Hvis det er en nedgang i åndedrett, fortsett med ytterligere injeksjoner til det ikke er noen reduksjon i åndedrett. Vask sprøyten tre ganger med 70% etanol. Kontroller oksygenkonsentrasjonen av kammeret.
Hvis konsentrasjonen er under 125 mikromolar, reoksygenat til romluft, eller mildt hyperoksygenat for å sikre at oksygen ikke begrenser luftveiene. Tilsett fem mikroliter med 0,8-molar ascorbate. Vask sprøyten tre ganger i 70% etanol.
Tilsett umiddelbart 10 mikroliter 0,2-molar TMPD, og vent på en økning i åndedrett. Etter å ha vasket sprøyten med etanol, tilsett 25 mikroliter 4-molar natriumazid umiddelbart når åndedrettsfluksen til ascorbate TMPD-platåer. Avslutt ved å klikke på Fil, Lagre og koble fra.
Det ble observert at 40 milligram per milliliter vevshomogenat resulterte i rask oksygennedbrytning. Oksygenforbruket avtok betydelig med 30 og 20 milligram per milliliter vevshomogenat, men reduserte fortsatt raskt på kort tid i fravær av substrater eller ADP. 10 milligram per milliliter konsentrasjon av vev homogenat resulterte i optimal oksygenforbruk.
En SUIT-protokoll ble brukt til å evaluere NADH- og succinat-koblet oksidativ fosforylering og elektronoverføring, samt kompleks IV-aktivitet. Cytokrom C-frigjøring ble vurdert i nærvær av pyruvat og malate, eller succinate og rotenon, som begge avslørte at det homogene preparatet ikke skadet mitokondriene. Det ble også funnet at NADH-forbundet oksidativ fosforylering var ubetydelig i EO771 svulster.
Titrering av FCCP for å drive maksimal elektronstrøm viste at i EO771-svulster var fosforylering, i stedet for oksidasjon, begrenset til åndedrett. Tumor homogenate respiratoriske profiler var lik de av ikke-implanterte, digitonin-permeabiliserte EO771 celler, bortsett fra redusert maksimal elektron overføring støttet av N-og S-tilknyttede substrater i svulsten. Respiratoriske kinetikken til succinat ble ytterligere evaluert av trinnvise titrasjoner av subsaturering av ADP til maksimal hastighet ble oppnådd.
Den halvmaksimale konsentrasjonen av ADP i nærvær av succinat og rotenon var 37,5 mikromolar, mens maksimal hastighet var ca. 10,5 picomoles per sekund, per milligram. Instrumenter satt opp i rutinemessig omsorg, samt vevshåndtering, er av avgjørende betydning for suksessen til disse eksperimentene. Etter disse prosedyrene kan andre masse- eller markørspesifikke tilnærminger for å rangere normalisering brukes basert på spørsmålet om interesse.
Vanlige tiltak inkluderer total protein kvantifisering og enzymatisk aktivitet av sitratsyntase, men varierer basert på modellsystemet, statistisk design og forskningsspørsmål.
Vi utviklet en praktisk protokoll og analytisk tilnærming for å evaluere mitokondrie oksidativ fosforylering og elektronoverføringskapasitet i friske tumor homogenater. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for å kartlegge ulike mitokondriefunksjoner som bidrar til kreftinitiering, progresjon og behandlingsrespons.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved