Analytisk bestämning av mitokondriell funktion av strukna fasta tumör homogenater

Detta protokoll beskriver en enkel och snabb metod för att mäta tumör mitokondriell funktion. Protokollet är i stort sett tillämpligt på klinisk translationell onkologi och kommer att bidra till att förbättra diagnostisk och mekanistisk tolkning av mitokondriernas roll vid uppkomsten och progressionen av cancer. Den största fördelen med denna teknik är tillämpningen av vävnad homogenisering för att förenkla beredningen och maximera utbytet av mitokondrier samtidigt som begränsningarna av diffusion.

Denna teknik erbjuder potentiella tillämpningar i kliniska och diagnostiska inställningar med en kvantitativ bedömning av tumör mitokondriell funktion med hjälp av nybiopsied eller strukits tumör vävnad. Börja med att placera en glas homogenisator som innehåller en milliliter mitokondriellt andningsmedium, eller MiR05, i en tätt passande glasplåga på våt is. Placera vävnaden i en milliliter biopsikonserveringslösning, eller BIOPS, i en iskall Petri-skål.

Skär tumören i små bitar på cirka 5 till 10 milligram vardera och placera de återstående tumörbitarna tillbaka i 10 milliliter BIOPS som hålls på is. Efter att ha blottat vävnadssektionerna försiktigt på ett filterpapper, placera dem på en liten plasttjärad vägbåt och registrera den ursprungliga våta vikten. Placera tillbaka de oanvända bitarna i BIOPS 10-milliliter koniska rör för fortsatt konservering.

Sänk ner vävnadssektionerna i en iskall homogenisator som innehåller MiR05 och registrera den återstående vikten på vägningsbåten. Använd en glasplåga med ett clearance-intervall på 0,09 till 0,16 millimeter, stör försiktigt tumörvävnaden genom att slutföra fem till sju ner- och uppslag. För varje slag, rotera pesteln i en medurs/moturs rörelse tre gånger medan du trycker ner pesteln och tre ytterligare gånger medan du drar upp pesteln igen.

Låt vävnaden sätta sig till botten av homogenisatorn mellan slag, men undvik att föra pesteln helt över vätskevolymen för att förhindra skumning. Häll homogenatet i ett 15-milliliter koniskt rör och placera det på is. Pipettera en till tre milliliter färsk MiR05 över pesteln och in i homogenisatorn för att tvätta eventuell återstående vävnadshomogenat.

Häll MiR05-tvätten i det koniska röret som innehåller homogenatet. Upprepa detta steg två till tre gånger för att säkerställa fullständig överföring av homogenatet. För att noggrant beräkna vävnad homogenatkoncentrationen, inspektera noggrant homogenisatorn och homogenatet för återstående icke-homogeniserat material, vilket inkluderar bindväv.

För att avlägsna det icke-homogeniserade materialet från homogenisatorn som inte kan nås med pincett, efter att ha tillsatt MiR05 till homogenisatorn, aspirera volymen, inklusive vävnaden, med en pipett och flytta innehållet till en Petri-maträtt. Ta bort det icke-homogeniserade materialet som är avgjort i stora bitar längst ner på det koniska röret från homogenatet genom att aspirera dem med en pipett och placera dem på locket på det koniska röret. Ta bort vävnaden från Petri-skålen eller koniska rörlocket med pincett och fläcka den på filterpapper.

Tillsätt det återstående homogenatet från koniskt rörlock tillbaka i koniska röret. Kapa röret och vänd sedan för att blanda. Rekta homogenisatorerna och homogenisera för ytterligare icke-homogeniserat material och upprepa stegen för att avlägsna icke-homogeniserat material om det behövs.

Väg och registrera massan av det icke-homogeniserade materialet som återvinns från homogenisatorn. Inspektera homogenpreparatet för eventuell grovt intakt vävnad som överförs och avlägsna de icke-homogeniserade bitarna och väg vid behov. Subtrahera vävnadsvikten som återvinns från vägningsbåten, homogenisatorn och homogenatet från den ursprungliga våta vikten för att beräkna den slutliga provvikten.

Använd den slutliga provvikten och tillsätt ytterligare MiR05 för att ge homogenitet till önskad koncentration. När homogenatet har vägts och beretts, fortsätt att analysera så snart som möjligt. Förvara provet lagrat på våt is tills det överförs till instrumentet.

När instrumentet är kalibrerat och provet har förberetts, ta bort propparna med en vridande rörelse och aspirera MiR05 från kamrarna och undvik membranet som exponeras inuti kammaren. Blanda homogenisbrunnen och tillsätt 2,25 milliliter homogenat i kammaren. Anta att en homogenat tillsätts i flera kammare, pipettera en milliliter homogenatet i taget i varje kammare samtidigt som homogenatet blandas för att säkerställa jämn vävnadsfördelning.

Klicka på F4 för att namnge och tidsstämpel händelsen och klicka sedan på Okej. Fyll en 50-milliliter spruta med syre från en syretank med en regulator och gasrör med en trubbig 18-gauge nål. Injicera syret direkt i kamrarna för att hyperoxygenera dem till cirka 500 mikromolärt syre.

Sätt löst i propparna och vänta med att stänga tills syret når cirka 480 mikromolar. Med en vridande rörelse stänger du långsamt kammaren och låter andningen balansera i cirka 15 till 20 minuter. Fyll proppens centrala kapillär med MiR05 om det behövs.

Använd dedikerade mikrosyringer för att injicera substrat, uncouplers och inhibitorer i helt slutna kammare för att namnge och tidsstämma händelserna för varje kammare i realtid. Välj F6 för att justera syrekoncentrationen och syrelutningen negativa skalor efter behov. Efter varje injektion, tvätta sprutan tre gånger i vatten för vattenlösliga föreningar och 70% etanol för etanolupplösta föreningar.

Tillsätt fem mikroliter av 0,8 molar malat och fortsätt omedelbart till nästa injektion. Tvätta injektionssprutan tre gånger i vatten. Tillsätt omedelbart fem mikroliter av 1-molar pyruvat och vänta på att andningen stabiliseras.

Efter att ha tvättat sprutan, tillsätt 10 mikroliter av 0,5 molar ADP och vänta på att ADP-svaret stabiliseras. Tvätta sprutan och tillsätt fem mikroliter av 2-molar glutamat och vänta på att andningen stabiliseras. Tvätta sprutan, tillsätt sedan fem mikroliter av 4-millimolar cytokrom-C och vänta på att andningen stabiliseras.

Efter att ha tvättat sprutan tillsätt 20 mikroliter 1-molar succinate och vänta på att andningen stabiliseras. Titrera 0,5 till 1 mikroliter steg av 1-millimolar FCCP och vänta tills andningen stabiliseras efter varje injektion. Fortsätt tills det inte finns någon ytterligare ökning av andningen.

Tvätta injektionssprutan tre gånger i 70% etanol. Tillsätt två mikroliter av 150 mikromolar rotenon och vänta på att andningen stabiliseras. Tillsätt ytterligare en mikroliter rotenon för att säkerställa att det inte finns någon ytterligare hämning.

Om andningen minskar, fortsätt med ytterligare injektioner tills det inte finns någon minskning av andningen och tvätta sedan injektionssprutan tre gånger i 70%etanol. Tillsätt två mikroliter av 125-mikromolar antimycin A och vänta på att andningen stabiliseras. Tillsätt ytterligare en mikroliter av antimycin A för att säkerställa att det inte finns någon ytterligare hämning.

Om andningen minskar, fortsätt med ytterligare injektioner tills andningen inte minskar. Tvätta sprutan tre gånger med 70% etanol. Kontrollera kammarens syrekoncentration.

Om koncentrationen är under 125-mikromolar, reoxygenate till rumsluften eller milt hyperoxygenat för att säkerställa att syret inte begränsar andningsflödet. Tillsätt fem mikroliter av 0,8 molar ascorbate. Tvätta sprutan tre gånger i 70% etanol.

Tillsätt omedelbart 10 mikroliter av 0,2 molar TMPD och vänta på en ökning av andningen. Efter att ha tvättat sprutan med etanol, tillsätt 25 mikroliter 4-molar natriumazid omedelbart när andningsflödet av askorbatA TMPD-platåer. Avsluta genom att klicka på Arkiv, Spara och koppla från.

det observerades att 40 milligram per milliliter vävnad homogenate resulterade i snabb syre utarmning. Syreförbrukningen minskade avsevärt med 30 och 20 milligram per milliliter vävnad homogenat, men minskade fortfarande snabbt på kort tid i avsaknad av substrat eller ADP. Koncentrationen av vävnadshomogenat på 10 milligram per milliliter resulterade i optimal syreförbrukning.

Ett SUIT-protokoll användes för att utvärdera NADH- och konsennatlänkad oxidativ fosforylering och elektronöverföring, liksom komplex IV-aktivitet. Cytokrom C release bedömdes i närvaro av pyruvate och malate, eller succinate och rotenon, som båda visade att homogenate beredningen inte skadade mitokondrierna. Det konstaterades också att NADH-linked oxidativ fosforylering var försumbar i EO771 tumörer.

Titrering av FCCP att driva maximal elektron flöde visade att i EO771 tumörer, fosforylering, snarare än oxidation, var begränsande till andning. Tumör homogenate luftvägarna profiler liknade dem av icke-implanterade, digitonin-permeabilized EO771 celler, med undantag för minskad maximal elektron överföring stöds av N-och S-länkade substrat i tumör. Luftvägarna kinetik av succinate utvärderades ytterligare genom stegvis titrering av subsaturating ADP tills den maximala hastigheten uppnåddes.

Den halv-maximal koncentrationen av ADP i närvaro av succinate och rotenon var 37,5-mikromolar, medan den maximala hastigheten var cirka 10,5 picomoles per sekund, per milligram. Instrument som inrättats inom rutinvård, liksom vävnadshantering, är av avgörande betydelse för att dessa experiment ska lyckas. Efter dessa förfaranden kan andra mass- eller markörspecifika metoder för räntenormalisering tillämpas baserat på frågan om intresse.

Vanliga åtgärder inkluderar total proteinkvantifiering och enzymatisk aktivitet av citratsyntas, men varierar beroende på modellsystem, statistisk design och forskningsfråga.