Name: fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (المنحة رقم 320030-184713). يتم دعم المؤلفين BBT و KC من قبل مؤسسة Velux (المشروع رقم 1123). تلقى المؤلف ST الدعم من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (منحة التنقل المبكرة بعد الدكتوراه ، لا. P2GEP3_191446) ، ومؤسسة البروفيسور الدكتور ماكس كلويتا (منحة الطب السريري بلس) ، ومؤسسة جان ومادلين فاتشو.

وأجريت جميع الإجراءات التجريبية بالاتفاق مع لجنة أخلاقيات التجارب البشرية والحيوانية في كانتون جنيف، ولجنة الكانتون لأخلاقيات البحوث، والإدارة العامة للصحة في كانتون جنيف (سويسرا)، على التوالي. يتم الإبلاغ عن البيانات وفقا لإرشادات البحوث الحيوانية: الإبلاغ عن التجارب داخل الجسم الح...

<ol>
	<li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+Alzheimer's+disease+and+other+dementias,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li><li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer's+disease.">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 4, 575-590 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer's+disease:+Translating+basic+science+into+clinical+practice.">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer's+disease:+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans.">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques,+tau+pathology,+behavioral+impairment,+oligomeric+a&#946;,+and+frank+neuronal+loss.">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric a&#946;, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li><li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+Alzheimer's+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-&#946;+attenuation.">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-&#946; attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li><li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer's+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task.">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).</li><li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer's+disease:+A+preliminary+approach.">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).</li><li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyz&#233;riat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[11C]raclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2/3+receptors.">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346 (2020).</li><li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dopamine+D(2/3)+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+[18F]Fallypride+images.">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li><li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2/3+receptors+with+[18F]Fallypride+images.">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding.">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer's+disease.">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li></ol>

على حد علمنا ، كانت هذه التقنية هي الأولى التي تصف نهجا يسمح بفهم أفضل لتعديلات الربط في الجسم الحي للمقتفي الإشعاعي على المستوى الخلوي. يصف البروتوكول طريقة متعددة المقاييس لقياس ارتباط المقتفي الإشعاعي على المستوى الخلوي باستخدام [125 I] CLINDE (TSPO) أو [125I]R91150 (5HT2AR) كأمثل...

تتميز الأمراض العصبية التنكسية ، مثل مرض الزهايمر (AD) ، بفقدان الخلايا العصبية المرتبطة بزيادة الأعراض. مرض الزهايمر ، السبب الأكثر شيوعا للخرف ، وهو ما يمثل 60٪ -70٪ من الحالات ، يؤثر على حوالي 50 مليون شخص في جميع أنحاء العالم1. على المستوى العصبي المرضي ، فإن الخاصيتين الرئيسيتين ل AD هما تراكم لويحات β أميلويد خارج الخلية (Aβ) وتشابك تاو العصبي الليفي داخل الخلايا. كما ارتبطت تغيرات الخلايا الدبقية ب AD2 واحتمال تعطيل العديد من أنظمة الناقلات العصبية 3,4.
تم تعديل خط الفئران TgF344-AD إلى نموذج AD من خلال التعبير عن الجينات المحورة البشرية APP و PS1ΔE9 ، مما يؤدي إلى تعبير Aβ-40 و Aβ-42 القابل للذوبان وغير القابل للذوبان وتكوين لوحة الأميلويد5. كما أنه يعرض تراكم أشكال فرط الفوسفوريلات من بروتين تاو مما يؤدي إلى اعتلال تاووباثي. من سن 9-24 شهرا ، تطور الفئران تدريجيا السمات المميزة المرضية لمرض الزهايمر وضعف إدراكي5،6،7،8،9.
التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) ، والتصوير المقطعي المحوسب بالإصدار أحادي الفوتون (SPECT) ، والتصوير الشعاعي الذاتي هي تقنيات تعتمد على انبعاث الأشعة γ وتحديدها كميا. يتم تحديد كميا المقتفيات الإشعاعية إما في الجسم الحي (PET و SPECT) أو خارج الجسم الحي / في المختبر (التصوير الشعاعي الذاتي). وقد ساهمت هذه التقنيات الحساسة في فهم آليات العديد من أمراض الدماغ، مثل مرض الزهايمر. في الواقع ، من حيث الالتهاب العصبي ، هناك الكثير من الدراسات التي تقيم 18 kDa Translocator Protein (TSPO) ، وهي علامة التهاب عصبي في الجسم الحي ، مع مقتفيات ذات علامات إشعاعية مثل [11 C]-(R)-PK11195 أو [11C]PBR28 (للمراجعة انظر 10). بالإضافة إلى ذلك ، تمت دراسة تعديلات أنظمة الناقلات العصبية باستخدام المقتفيات الإشعاعية11،12،13.
غير أن هذه التقنيات لا تحدد المنشأ الخلوي للإشارة المشعة. وهذا يمكن أن يعوق تفسير الأسس البيولوجية للتغيير في ربط الرباط المشع في PET/SPECT. على سبيل المثال ، في حالة دراسات TSPO للالتهاب العصبي ، فإن فهم ما إذا كانت زيادة أو نقصان TSPO ناتجة عن التغيرات النجمية أو الدبقية الدقيقة له أهمية قصوى. تم تطوير تقنية فرز الخلايا المنشطة بالفلور إلى الأنسجة المعالجة بالليغاند المشع (FACS-RTT) للتغلب على هذه المشاكل ، مما يسمح بتقييم ربط الرباط الإشعاعي في كل نوع من أنواع الخلايا على حدة وتحديد كثافة البروتين المستهدف لكل خلية. وبالتالي فإن هذه التقنية المبتكرة مكملة ومتوافقة للغاية مع التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني والتصوير التصويري بالأشعة تحت الحمراء.
هنا ، تم تطبيق هذه التقنية على طول محورين: دراسة التهاب الأعصاب باستخدام الرباط الإشعاعي الخاص ب TSPO وتقييم نظام السيروتونين. في المحور الأول ، كان الهدف هو فهم الأصل الخلوي لإشارة TSPO استجابة لتفاعل التهابي حاد. لذلك ، تم استخدام FACS-RTT على أنسجة المخ للفئران بعد تحريض الالتهاب العصبي عن طريق حقن عديد السكاريد الشحمي (LPS) وبعد دراسة تصوير في الجسم الحي [125I] Clinde Spect. علاوة على ذلك ، تم تطبيق نفس بروتوكول التصوير و FACS-RTT على الفئران TgF344-AD التي يبلغ عمرها 12 و 24 شهرا والفئران المطابقة من النوع البري (WT). يهدف المحور الثاني إلى تحديد أصل تعديلات نظام السيروتونين في نموذج الفئران هذا عن طريق تقييم كثافة الجسم الحي 5-HT2AR حسب نوع الخلية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVet</td>
			<td>BioVet</td>
			<td></td>
			<td>Software for vitals check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bondclone C18 reverse-phase column</td>
			<td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Des-Sur</td>
			<td>University Hospital of Geneva</td>
			<td></td>
			<td>Virucide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block / anti-CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB550270</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202504</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Knauer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>321312</td>
			<td>24 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ZDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacryvisc</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2160699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore soft tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>F51DA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILabs-Uspect II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Software for SPECT Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Removal Beads II</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-733</td>
			<td>Contains beads and myelin removal buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% Sterile solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>395202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Sheet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0074-10YD</td>
			<td>40 inch width, 80 micron size mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R91150 pr&#233;cursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Concentration column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodide Na125</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tributylin precursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-SPECT Rec2.38c</td>
			<td>MILabs</td>
			<td>Version Rec2.38c</td>
			<td>Software for SPECT images reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USPECT II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Spect Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard 3&#34;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Gamma counter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal

من المحتمل أن يكون للخلايا الدبقية تأثير كبير في الفيزيولوجيا المرضية للاضطرابات العصبية التنكسية ، مثل مرض الزهايمر (AD). ربما ترتبط تعديلاتها بحالة مؤيدة للالتهابات. تم تصميم سلالة الفئران TgF344-AD للتعبير عن جينات APP البشرية و PS1ΔE9 البشرية ، وترميز بروتينات الأميلويد Aβ-40 و Aβ-42 ويعرض أمراض الأميلويد والعجز المعرفي مع الشيخوخة. يستخدم نموذج الفئران TgF344-AD في هذه الدراسة لتقييم الأصل الخلوي لبروتين نقل 18 kDa (TSPO ، وهو علامة على تنشيط الخلايا الدبقية) ، ومستويات مستقبلات السيروتونين 5HT 2A (5HT2A R) التي قد تتعطل فيAD. التقنية المعروضة هنا هي فرز الخلايا المنشط بالفلور إلى الأنسجة المعالجة بالليغاند الإشعاعي (FACS-RTT) ، وهي تقنية كمية خاصة بنوع الخلية مكملة لتقنيات التصوير الشعاعي الذاتي في الجسم الحي أو SPECT أو خارج الجسم الحي / في المختبر. وهو يحدد كميا نفس المقتفي المشع المستخدم سابقا للتصوير ، باستخدام عداد γ بعد فرز خلايا قياس الخلايا. هذا يسمح بتحديد الأصل الخلوي للبروتين الموسوم إشعاعيا مع خصوصية وحساسية خلوية عالية. على سبيل المثال ، أظهرت الدراسات التي أجريت على FACS-RTT أن (i) الزيادة في ارتباط TSPO ارتبطت بالخلايا الدبقية الصغيرة في نموذج الفئران من التهاب الأعصاب الناجم عن عديد السكاريد الشحمي (LPS) ، (ii) ارتبطت الزيادة في ارتباط TSPO في 12 و 18 شهرا بالخلايا النجمية أولا ، ثم الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران TgF344-AD مقارنة بالفئران من النوع البري (WT) ، و (iii) الكثافة المخططة ل 5HT2A R ينخفض في الخلايا النجمية في 18 شهرا في نفس نموذج AD الفئران. ومن المثير للاهتمام ، يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل جميع أجهزة التتبع الإشعاعي تقريبا.

الفئران WT من ذوي الخبرة في الجسم الحي SPECT المسح الضوئي مع [125I]CLINDE المقتفي الإشعاعي بعد حقن LPS من جانب واحد (الشكل 2). أظهر هذا المسح الضوئي (باستخدام بيانات مجمعة من صور 45-60 دقيقة بعد حقن التتبع الإشعاعي) ارتباطا أعلى ل [125I]CLINDE في موقع حقن LPS (الشكل 2A) مقارنة بالمن...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

يعد النسيج المعالج بالفلور المنشط للخلايا المشعة (FACS-RTT) أداة قوية لدراسة دور بروتين نقل 18 kDa أو تعبير مستقبلات السيروتونين 5HT 2A في مرض الزهايمر على نطاقخلوي. يصف هذا البروتوكول التطبيق السابق للجسم الحي ل FACS-RTT في نموذج الفئران TgF344-AD.

الأنسجة المعالجة بالفرز الإشعاعي للخلايا المنشطة بالتألق (FACS-RTT) لتحديد الأصل الخلوي للإشارة المشعة

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

هذا البروتوكول مكمل للتصوير في الجسم الحي. يسمح بنوع الخلية والمستوى الخلوي لتحديد كمية المقتفيات الإشعاعية ، وهو مقياس مختلف عن المقياس الذي تم الحصول عليه في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي حساسيتها والدقة الخلوية التي يوفرها استخدام الوصلات المشعة وفرز الخلايا.قم بتشغيل الكاميرا وتحميل برنامج التشغيل. انقر فوق زر المرحلة Home XYZ لأداء التوجيه الموجه. قم بإعداد التجربة المكونة من اكتساب مسح ضوئي واحد لمدة 10 دقائق.اضبط وضع الخطوة على ما يرام ووضع الاكتساب على وضع القائمة لتسجيل طيف الانبعاثات بأكمله. قم بإعداد السرير وتأكد من أن نظام الاحترار ومستشعر التنفس والتخدير وظيفي وآمن. ثم ، ضع شبحا حيث سيتم وضع رأس الحيوان.اضبط منطقة المسح الضوئي عن طريق تحريك المؤشرات للأبعاد الثلاثة بمساعدة الصور الثلاث في الجزء السفلي من الشاشة. تأكد من أن حجم المسح الضوئي للشبح والحيوان هو نفسه. ابدأ الفحص الوهمي للمعايرة اللاحقة باستخدام المعلمات المحددة مسبقا.ضمان العمل في بيئة مناسبة ، مصرح بها للتجارب التي تنطوي على نشاط إشعاعي. احتضان 100 ميكروغرام من سلائف تريبوتيلين في 100 ميكرولتر من حمض الخليك مع يوديد الصوديوم وخمسة ميكرولترات من 37٪ من حمض الباراسيتيك عند 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في دورة حرارية موضوعة في صندوق قفازات. قم بتخفيف التفاعل باستخدام 50٪ أسيتونيتريل في الماء للوصول إلى حجم 500 ميكرولتر.حقن 500 ميكرولتر من التفاعل المخفف في عمود الطور العكسي. اعزل CLINDE باستخدام HPLC متدرج خطيا يمتد من 5 إلى 95٪ ACN في حمض الفوسفوريك سبعة ملليمولار لمدة 10 دقائق. قم بتخفيف العزل في الماء للوصول إلى حجم نهائي قدره 10 ملليلتر ثم حقن التفاعل المخفف في عمود تركيز.قم بإخراج CLINDE من العمود مع 300 ميكرولتر من الإيثانول المطلق ثم تبخر الإيثانول عن طريق احتضانه في جهاز طرد مركزي فراغي في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. قم بتخفيف البقايا التي تحتوي على CLINDE في 300 ميكرولتر من المياه المالحة لإنشاء محلول مخزون. بعد قياس نشاطه الإشعاعي ، قم بتخفيف محلول المخزون في محلول ملحي للحصول على محلول 0.037 megabecquerel في 500 ميكرولتر.قم بإنشاء منحنيات المعايرة باستخدام المركبات المرجعية الباردة وحل معادلة الانحدار الخطي:Y تساوي AX زائد B للحصول على معاملات A و B. يمثل X كتلة المركب البارد ، ويمثل Y المساحة تحت المنحنيات. تحقق من المنطقة تحت منحنى الرباط الإشعاعي ، وقياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 450 نانومتر بناء على منحنى المعايرة والمنطقة تحت منحنى الرباط الإشعاعي.تقدير الكتلة وقياس نشاط الرباط الإشعاعي. تأكد من أن النشاط المحدد أكبر من 1000 جيجا بيكوريال لكل ميكرومول. انقر فوق الزر "تحديث الصورة" لتحديث موضع الحيوان.اضبط منطقة المسح الضوئي عن طريق تحريك المؤشرات بمساعدة الصور الثلاث في الجزء السفلي من الشاشة للأبعاد الثلاثة. قم بإعداد التجربة على مسح ضوئي مدته 60 دقيقة يتكون من 60 إطارا لمدة دقيقة واحدة. أعد استخدام كافة المعلمات الأخرى التي تم إعدادها في البداية.حقن 500 ميكرولتر من المقتفي الإشعاعي المشع ثم اغسل الأنبوب ب 300 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9٪. في الوقت نفسه ، انقر فوق بدء الاستحواذ لبدء الفحص. افتح برنامج إعادة بناء الفحص ثم افتح مجموعة البيانات، وابحث عن ملف معلمات اسم الملف الذي تم إنشاؤه في مجلد الفحص.حدد النظير محل الاهتمام. لاحظ أن معلمة وضع القائمة تسمح باختيار نظائر متعددة في هذه الخطوة. قم بتعيين معلمات إعادة الإعمار المختلفة مثل حجم voxel وعدد المجموعات الفرعية والتكرارات كما هو موضح في المخطوطة.حدد تنسيق الإخراج ك NIFTI ثم حدد بدء إعادة إنشاء SPECT. استخدم ملعقة معدنية مسطحة وشفرة حلاقة لتشريح المناطق التي تهم الدماغ. ضع الأنسجة في أنبوب طرد مركزي سعة مليلترين وقم بوزن الأنسجة التي تم الحصول عليها.ضع العينات في أنبوب طرد مركزي سعة مليلترين مع ملليلتر واحد من HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم ثم جهاز طرد مركزي بسرعة 300 مرة G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة وقم بإزالة المادة الفائقة دون إزعاج الكرية. أضف 1،900 ميكرولتر من الإنزيم امزج واحدا واحتضنه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية أثناء تحريك الأنابيب عن طريق الانعكاس كل خمس دقائق. أضف 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم اثنين.حرك بلطف باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ذهابا وإيابا 30 مرة. ثم ، احتضن الخليط لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية أثناء تحريك الأنابيب عن طريق الانعكاس كل خمس دقائق. اخلطي بلطف ذهابا وإيابا باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ثم ماصة سعة 10 ميكرولتر قبل احتضان الخليط لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الأنسجة.قم بتصفية الخلايا باستخدام مصفاة خلايا 70 ميكرومتر وأضف 10 ملليلتر من HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة supernatant دون إزعاج الكرية. لاستنفاد المايلين ، أعد تعليق الكريات مع 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين ثم أضف 100 ميكرولتر من حبات إزالة المايلين قبل الحضانة لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.أضف خمسة ملليلترات من المخزن المؤقت لإزالة المايلين وأجهزة الطرد المركزي 300 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين وضع الكريات المعلقة في عمود المجال المغناطيسي. اغسل العمود بملليلتر واحد من المخزن المؤقت لإزالة المايلين أربع مرات.جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة وإزالة supernatant دون إزعاج الكرية. دوامة لفترة وجيزة لفصل الخلايا وإضافة خمسة ميكرولترات من Fc Block CD32. أضف 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية واحتضنها لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.جهاز طرد مركزي عند 350 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وإزالة supernatant دون إزعاج الكرية. لطخة الأنابيب رأسا على عقب على ورق ناعم. دوامة الأنبوب لفترة وجيزة ، ثم إضافة 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية واحتضان لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لإزالة المايلين وكرر الطرد المركزي. تخلص من السوبرناتانت ولطخ الأنابيب رأسا على عقب على ورق ناعم. أعد تعليق الخلايا في 250 ميكرولتر من PBS المعقمة وانتقل مباشرة إلى فرز الخلايا.أظهر فحص SPECT في الجسم الحي للفئران من النوع البري ارتباطا أعلى ل CLINDE في موقع حقن عديد السكاريد الشحمي مقارنة بالمنطقة المقابلة الجانبية من الدماغ. كشفت العينات خارج الجسم الحي التي خضعت لفرز الخلايا المشعة بالفلور ، أو FACS-RTT ، عن وجود عدد أكبر من مواقع ربط CLINDE فقط في الخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يدل على أن الأصل الخلوي لإشارة CLINDE في الجانب الجانبي من الدماغ كان microglia. كانت الزيادة في بروتين ناقل الحركة ، أو ربط TSPO ، في 12 شهرا في الفئران TgF344-AD مقتصرة على الخلايا النجمية.في الفئران البالغة من العمر 24 شهرا ، لوحظت الزيادة في ربط TSPO بسبب كل من التغيرات النجمية والدبقية الصغيرة. في الفئران القديمة TgF344-AD ، أظهرت الخلايا النجمية المخططة كثافة منخفضة 5HT2AR بالمقارنة مع النوع البري. لوحظ وجود فرط في التعبير القشري ل TSPO في كل من الخلايا النجمية والدبقية الصغيرة لموضوعات AD مقارنة بالضوابط المتطابقة مع العمر عندما تم إجراء FACS-RTT على عينات ما بعد الوفاة البشرية AD.عند العمل مع النشاط الإشعاعي ، اتبع تعليمات الحماية من الراديو وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة. ثم ، بعد الإجراء ، تأكد من تطهير بيئة العمل. يمكن بسهولة إجراء تحديد كمية البروتين وتحليل التعبير الجيني بعد هذا الإجراء على مجموعات الخلايا المعزولة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

وهو الإجراء الأمثل لالإسفار تنشيط عزل الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) فرز الأسلاف العصبية الاستقلال الذاتي من الجهاز التنفسي والهضمي من الفئران الجنينية

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

استخدام كاسباس المتعدد الفحص لتحديد موت الخلايا المبرمج في المهاد الخليوي نموذج

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

نشاط التيلوميراز في مناطق مختلفة من الدماغ ماوس: التيلوميراز غير المشعة كرر بروتوكول التضخيم (TRAP) الفحص

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

و<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة الفيزيولوجيا المرضية الخلوي في الخلية حثل المادة البيضاء الكروي

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

باستخدام الإسفار خلية المنشط الفرز لفحص الخلية من نوع محدد التعبير الجيني في الأنسجة دماغ الفئران

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) وجين تحليل التعبير عن فوس، معربا عن الخلايا العصبية من الطازجة والمجمدة الأنسجة دماغ الفئران

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

في الرحم النهج Electroporation لللدراسة استثارة الخلايا العصبية القطعان والربط وحيدة الخلية

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

التسامي DAN مصفوفة للكشف والتخيل من Gangliosides في الجرذ أنسجة المخ لMALDI التصوير قياس الطيف الكتلي

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

مقايسة تدرج درجة الحرارة لتحديد تفضيلات الحرارية يرقات المورفولوجية

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

الخلايا الاساسيه الثقافة المنقية جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتاميجيك أنشئت من خلال الفرز الخلية المنشطة الفلورية

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...