Name: fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Swiss National Science Foundation (bevilling nr. 320030-184713). Forfatterne BBT og KC er støttet af Velux Fonden (projekt n. 1123). Forfatter ST modtog støtte fra Swiss National Science Foundation (Early Post-Doc Mobility Scholarship, nr. P2GEP3_191446), Prof Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus stipendium) og Jean og Madeleine Vachoux Foundation.

Alle eksperimentelle procedurer blev udført efter aftale med henholdsvis den etiske komité for forsøg på mennesker og dyr i kantonen Genève, den kantonale kommission for forskningsetik (CCER) og den generelle retning for sundheden i kantonen Genève (Schweiz). Data rapporteres efter Animal Research: Reporting In-vivo Experiments (ARRIVE) retningslinjer.
1. Forberedelse og kalibrering af SPECT-kamera
<ol><li>Tænd kameraet, læg betjeningssoftwaren i (se Materialetabel</...

<ol>
	<li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+Alzheimer's+disease+and+other+dementias,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li><li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer's+disease.">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 4, 575-590 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer's+disease:+Translating+basic+science+into+clinical+practice.">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer's+disease:+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans.">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques,+tau+pathology,+behavioral+impairment,+oligomeric+a&#946;,+and+frank+neuronal+loss.">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric a&#946;, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li><li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+Alzheimer's+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-&#946;+attenuation.">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-&#946; attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li><li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer's+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task.">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).</li><li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer's+disease:+A+preliminary+approach.">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).</li><li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyz&#233;riat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[11C]raclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2/3+receptors.">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346 (2020).</li><li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dopamine+D(2/3)+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+[18F]Fallypride+images.">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li><li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2/3+receptors+with+[18F]Fallypride+images.">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding.">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer's+disease.">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li></ol>

Så vidt vi ved, var denne teknik den første til at beskrive en tilgang, der muliggør en bedre forståelse af in vivo-bindende ændringer af en radiotracer på celleniveau. Protokollen beskriver en multiskala metode til kvantificering af radiotracerbinding på celleniveau ved hjælp af [125I] CLINDE (TSPO) eller [125I] R91150 (5HT2AR) som eksempler.
Denne teknik er robust og følsom nok til præcist at detektere den cellulære oprindelse af et bredt ...

Neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers sygdom (AD), er karakteriseret ved et neuronalt tab forbundet med øgede symptomer. AD, den mest almindelige årsag til demens, der tegner sig for 60%-70% af tilfældene, påvirker omkring 50 millioner mennesker verden over1. På et neuropatologisk niveau er de to vigtigste egenskaber ved AD akkumuleringen af ekstracellulære amyloid-β (Aβ) plaques og intracellulære Tau neurofibrillære tangles. Gliacelleændringer har også været forbundet med AD2 og mulig forstyrrelse af flere neurotransmittersystemer 3,4.
TgF344-AD rottelinjen er blevet modificeret til model AD ved at udtrykke humane APP- og PS1ΔE9-transgener, hvilket fører til opløselig og uopløselig Aβ-40 og Aβ-42-ekspression og amyloidplaquedannelse5. Det præsenterer også akkumuleringen af hyperphosphorylerede former for Tau-proteinet, der fører til tauopati. Fra en alder af 9-24 måneder udvikler rotterne gradvist de patologiske kendetegn ved AD og en kognitiv svækkelse 5,6,7,8,9.
Positronemissionstomografi (PET), enkeltfotonemission computertomografi (SPECT) og autoradiografi er teknikker baseret på emission og kvantificering af γ stråler. Radiotracere kvantificeres enten in vivo (PET og SPECT) eller ex vivo/in vitro (autoradiografi). Disse følsomme teknikker har bidraget til forståelsen af mekanismer i flere hjernesygdomme, såsom AD. Med hensyn til neuroinflammation er der faktisk mange undersøgelser, der vurderer 18 kDa Translocator Protein (TSPO), en in vivo neuroinflammationsmarkør, med radioaktivt mærkede sporstoffer såsom [11C] -(R) -PK11195 eller [11C] PBR28 (for gennemgang se10). Derudover er ændringer af neurotransmittersystemer blevet undersøgt ved hjælp af radiotracere 11,12,13.
Disse teknikker bestemmer imidlertid ikke det radioaktive signals cellulære oprindelse. Dette kan hæmme fortolkningen af det biologiske grundlag for ændringen i bindingen af en radioligand i PET/SPECT. For eksempel i tilfælde af TSPO-undersøgelser af neuroinflammation er det af afgørende betydning at forstå, om stigningen eller faldet i TSPO skyldes astrocytiske eller mikrogliale ændringer. Teknikken Fluorescensaktiveret cellesortering til radioligandbehandlet væv (FACS-RTT) blev udviklet for at omgå disse problemer, hvilket muliggør vurdering af radioligandbinding i hver celletype separat og kvantificering af målproteintætheden pr. Celle. Denne innovative teknik er derfor komplementær og yderst kompatibel med PET- og SPECT-billeddannelse.
Her blev denne teknik anvendt langs to akser: undersøgelsen af neuroinflammation ved hjælp af TSPO-specifikke radioligands og vurdering af det serotonerge system. På den første akse var målet at forstå TSPO-signalets cellulære oprindelse som reaktion på en akut inflammatorisk reaktion. Derfor blev FACS-RTT anvendt på hjernevæv hos rotter efter induktion af neuroinflammation via en lipopolysaccharid (LPS) injektion og efter en in vivo [125I] CLINDE SPECT billeddannelsesundersøgelse. Desuden blev den samme billeddannelses- og FACS-RTT-protokol anvendt på 12- og 24 måneder gamle TgF344-AD-rotter og matchende vildtyperotter (WT). Den anden akse havde til formål at bestemme oprindelsen af serotoninerge systemændringer i denne rottemodel via ex vivo 5-HT2AR-densitetsvurdering efter celletype.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVet</td>
			<td>BioVet</td>
			<td></td>
			<td>Software for vitals check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bondclone C18 reverse-phase column</td>
			<td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Des-Sur</td>
			<td>University Hospital of Geneva</td>
			<td></td>
			<td>Virucide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block / anti-CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB550270</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202504</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Knauer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>321312</td>
			<td>24 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ZDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacryvisc</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2160699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore soft tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>F51DA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILabs-Uspect II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Software for SPECT Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Removal Beads II</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-733</td>
			<td>Contains beads and myelin removal buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% Sterile solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>395202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Sheet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0074-10YD</td>
			<td>40 inch width, 80 micron size mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R91150 pr&#233;cursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Concentration column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodide Na125</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tributylin precursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-SPECT Rec2.38c</td>
			<td>MILabs</td>
			<td>Version Rec2.38c</td>
			<td>Software for SPECT images reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USPECT II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Spect Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard 3&#34;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Gamma counter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal

Gliaceller har sandsynligvis en betydelig implikation i patofysiologien af neurodegenerative lidelser, såsom Alzheimers sygdom (AD). Deres ændringer er måske forbundet med en proinflammatorisk tilstand. TgF344-AD rottestammen er designet til at udtrykke humane APP- og humane PS1ΔE9-gener , der koder for amyloidproteiner Aβ-40 og Aβ-42 og viser amyloidpatologi og kognitive underskud med aldring. TgF344-AD rottemodellen anvendes i denne undersøgelse til at evaluere den cellulære oprindelse af 18 kDa translocatorproteinet (TSPO, en markør for gliacelleaktivering) binding og 5HT2A-receptoren (5HT2AR) serotoninreceptorniveauer, der muligvis forstyrres i AD. Den teknik, der præsenteres her, er fluorescensaktiveret cellesortering til radioligandbehandlet væv (FACS-RTT), en kvantitativ celletypespecifik teknik, der supplerer in vivo PET- eller SPECT- eller ex vivo/in vitro-autoradiografiteknikker . Det kvantificerer det samme radioaktivt mærkede sporstof, der blev brugt tidligere til billeddannelse, ved hjælp af en γ tæller efter cytometricellesortering. Dette gør det muligt at bestemme den cellulære oprindelse af det radioaktivt mærkede protein med høj cellulær specificitet og følsomhed. For eksempel viste undersøgelser med FACS-RTT, at (i) stigningen i TSPO-binding var forbundet med microglia i en rottemodel af lipopolysaccharid (LPS)-induceret neuroinflammation, (ii) en stigning i TSPO-binding ved 12- og 18-måneder var først forbundet med astrocytter og derefter mikroglia i TgF344-AD-rotter sammenlignet med vildtyperotter (WT) og (iii) striataldensiteten af 5HT2A R falder i astrocytter efter 18 måneder i samme rotte AD-model. Interessant nok kan denne teknik udvides til stort set alle radiotracere.

WT-rotter oplevede in vivo SPECT-scanning med [125I]CLINDE radiotracer efter en ensidig LPS-injektion (figur 2). Denne scanning (ved hjælp af opsummerede data fra billeder af 45-60 min postradiostofinjektion) viste højere binding af [125I]CLINDE på stedet for LPS-injektionen (figur 2A) end i den kontralaterale region i hjernen (figur 2B). Ex vivo-prøverne , der gennemgik FACS-RTT, bekræft...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescensaktiveret cellesortering-radioligandbehandlet væv (FACS-RTT) er et kraftfuldt værktøj til at studere rollen som 18 kDa translocatorprotein eller Serotonin 5HT 2A-receptorekspression i Alzheimers sygdom i cellulær skala. Denne protokol beskriver ex vivo-anvendelsen af FACS-RTT i TgF344-AD-rottemodellen.

Fluorescensaktiveret cellesortering-radioligandbehandlet væv (FACS-RTT) til bestemmelse af den cellulære oprindelse af radioaktivt signal

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

Denne protokol supplerer in vivo-billeddannelse. Det tillader celletype og cellulær niveau kvantificering af radiotracere, hvilket er en anden skala end den, der opnås in vivo. Den største fordel ved denne teknik er dens følsomhed og den cellulære opløsning, der er givet ved brug af radioligander og cellesortering.Tænd kameraet, og indlæs betjeningssoftwaren. Klik på home XYZ-sceneknappen for at udføre homing. Konfigurer eksperimentet, der består af én 10-minutters scanningsanskaffelse.Indstil tilstanden Trin til fin og Anskaffelsestilstand til Listmode for at registrere hele emissionsspektret. Sæt sengen op og sørg for, at opvarmningssystemet, vejrtrækningssensoren og anæstesien er funktionelle og sikre. Placer derefter et fantom, hvor dyrets hoved vil blive placeret.Indstil scanningsområdet ved at skubbe markørerne for de tre dimensioner ved hjælp af de tre billeder i den nederste del af skærmen. Sørg for, at fantomets og dyrets scanningsvolumen er det samme. Start fantomscanningen for efterfølgende kalibrering med de tidligere etablerede parametre.Sørg for at arbejde i et passende miljø, der er godkendt til eksperimenter, der involverer radioaktivitet. Inkuber 100 mikrogram tributylinprækursor i 100 mikroliter eddikesyre med natriumiodid og fem mikroliter 37% paracetinsyre ved 70 grader Celsius i 20 minutter i en termocyklist placeret i en handskeboks. Fortynd reaktionen med 50% acetonitril i vand for at nå et volumen på 500 mikroliter.De 500 mikroliter af den fortyndede reaktion injiceres på en omvendt fasesøjle. Isoler CLINDE med en lineær gradient HPLC-kørsel fra 5 til 95% ACN i syv millimolær phosphorsyre i 10 minutter. Fortynd isolatet i vand for at opnå et endeligt volumen på 10 ml, og sprøjt derefter den fortyndede reaktion på en koncentrationskolonne.Eluter CLINDE fra søjlen med 300 mikroliter absolut ethanol, og fordamp derefter ethanolen ved at inkubere den i en vakuumcentrifuge ved stuetemperatur i 40 minutter. Fortynd resten indeholdende CLINDE i 300 mikroliter saltvand for at skabe en stamopløsning. Efter måling af dets radioaktivitet fortyndes stamopløsningen i saltvand for at opnå en opløsning på 0,037 megabecquerel i 500 mikroliter.Etablere kalibreringskurverne med kolde referenceforbindelser og løse den lineære regressionsligning:Y lig med AX plus B for at opnå A- og B-koefficienter. X repræsenterer massen af kold forbindelse, og Y repræsenterer området under kurverne. Kontroller området under radioligandens kurve og mål ultraviolet absorbans ved 450 nanometer baseret på kalibreringskurven og området under radioligandens kurve.Anslå massen og mål radioligandens aktivitet. Sørg for, at den specifikke aktivitet er større end 1.000 gigabecquerel pr. Mikromole. Klik på knappen Opdater billede for at opdatere dyrets position.Indstil scanningsområdet ved at skubbe markørerne ved hjælp af de tre billeder i den nederste del af skærmen for de tre dimensioner. Konfigurer eksperimentet på en 60-minutters scanning, der udgør 60 billeder på et minut. Genbrug alle andre parametre, der oprindeligt er konfigureret.Injicer 500 mikroliter af det radioaktive radiotracer, og skyl derefter røret med 300 mikroliter sterilt 0,9% natriumchlorid. Klik samtidig på Start erhvervelse for at starte scanningen. Åbn scanningsrekonstruktionssoftwaren, og åbn derefter datasættet og se efter filen med filnavneparametre, der er oprettet i mappen til scanningen.Vælg isotopen af interesse. Bemærk, at listetilstandsparameteren tillader flere isotopvalg på dette trin. Indstil de forskellige rekonstruktionsparametre som voxelstørrelse, antal delmængder og iterationer som beskrevet i manuskriptet.Vælg outputformatet som NIFTI, og vælg derefter Start SPECT-rekonstruktion. Brug en flad metalspatel og et barberblad til at dissekere hjernens områder af interesse. Anbring vævene i et centrifugerør på to milliliter, og vej det opnåede væv.Prøverne kom i et centrifugerør på to milliliter med en milliliter calcium- og magnesiumfri HBSS og centrifuger derefter ved 300 gange G i to minutter ved stuetemperatur og fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten. Tilsæt 1.900 mikroliter enzymblanding en og inkuber den i 15 minutter ved 37 grader Celsius, mens du omrører rørene ved inversion hvert femte minut. Tilsæt 30 mikroliter enzymblanding to.Omrør forsigtigt med en 1.000 mikroliterpipette frem og tilbage 30 gange. Derefter inkuberes blandingen i 15 minutter ved 37 grader Celsius, mens rørene omrøres ved inversion hvert femte minut. Bland forsigtigt frem og tilbage med en 200 mikroliter pipette og derefter en 10-mikroliter pipette, før du inkuberer blandingen i 10 minutter ved 37 grader Celsius for at dissociere vævene.Filtrer cellerne med en 70 mikrometer cellesil og tilsæt 10 ml calcium- og magnesiumfri HBSS. Centrifugering ved 300 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur og fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten. Til myelinudtømning skal pelleten suspenderes med 400 mikroliter myelinfjernelsesbuffer og derefter tilsættes 100 mikroliter myelinfjernelsesperler, inden den inkuberes i 15 minutter ved fire grader Celsius.Der tilsættes fem milliliter myelinfjernelsesbuffer og centrifuge 300 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt 500 mikroliter myelinfjernelsesbuffer, og anbring de suspenderede pellets i magnetfeltsøjlen. Vask søjlen med en milliliter myelinfjernelsesbuffer fire gange.Centrifugering ved 300 gange G i to minutter ved stuetemperatur og fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten. Vortex kort for at adskille cellerne og tilføje fem mikroliter Fc Block CD32. Tilsæt 100 mikroliter af blandingen af primære antistoffer af interesse og inkuber i 20 minutter ved fire grader Celsius.Centrifugering ved 350 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten. Blot rørene på hovedet på blødt papir. Vortex røret kort, tilsæt derefter 100 mikroliter af den sekundære antistofblanding og inkuber i 15 minutter ved fire grader Celsius.Tilsæt en milliliter myelinfjernelsesbuffer og gentag centrifugeringen. Kassér supernatanten og blød rørene på hovedet på blødt papir. Resuspend cellerne i 250 mikroliter steril PBS og fortsæt direkte til cellesortering.In vivo SPECT-scanningen af vildtyperotter viste højere binding af CLINDE på stedet for lipopolysaccharidinjektionen end i den kontralaterale region i hjernen. Ex vivo-prøverne, der gennemgik fluorescensaktiveret cellesortering radioligandbehandlet væv, eller FACS-RTT, afslørede tilstedeværelsen af et højere antal CLINDE-bindingssteder kun i microglia, hvilket viste, at CLINDE-signalets cellulære oprindelse i den ipsilaterale side af hjernen var microglia. Stigningen i translocatorprotein eller TSPO-binding efter 12 måneder hos TgF344-AD-rotter var begrænset til astrocytter.Hos 24 måneder gamle rotter blev stigningen i TSPO-binding observeret på grund af både astrocytiske og mikrogliale ændringer. I ældre TgF344-AD rotter viste striatale astrocytter en nedsat 5HT2AR-tæthed sammenlignet med vildtype. En kortikal overekspression af TSPO blev observeret i både astrocytter og mikroglia af AD-forsøgspersoner sammenlignet med aldersmatchede kontroller, når FACS-RTT blev udført på humane AD postmortem-prøver.Når du arbejder med radioaktivitet, skal du følge instruktionerne om radiobeskyttelse og bære passende personlige beskyttelsesudstyr. Derefter skal du efter proceduren sørge for at dekontaminere arbejdsmiljøet. Proteinkvantificering og genekspressionsanalyse kan let udføres efter denne procedure på isolerede cellepopulationer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

En optimeret Fremgangsmåde til fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) Isolering af autonome Neurale stamceller fra indre organer af føtale Mus

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Anvendelse af en Caspase Multiplexing assay til bestemmelse af apoptose i en Hypothalamus Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomeraseaktivitet i de forskellige regioner i Mouse Brain: Ikke-radioaktivt Telomerase Gentag Amplifikationsprotokol (TRAP) Indhold

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Model for Studiet af Cellular patofysiologi i Globoid Cell Leukodystrofi

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og Gene Expression Analyse af Fos-udtrykkende neuroner fra Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

I Utero Elektroporation Approaches to Undersøgelse ophidselse af neuronale subpopulationer og Single-celle Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

En temperaturgradient Assay til at fastlægge termisk præferencer af Drosophila larver

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primær cellekultur af renset GABAergic eller Glutamatergic neuroner etableret gennem fluorescens-aktiveret celle sortering

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...