Name: fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (subsidie nr. 320030-184713). Auteurs BBT en KC worden ondersteund door de Velux Foundation (projectnr. 1123). Auteur ST kreeg steun van de Swiss National Science Foundation (Early Post-Doc Mobility Scholarship, nr. P2GEP3_191446), de Prof Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus scholarship) en de Jean and Madeleine Vachoux Foundation.

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met respectievelijk de Ethische Commissie voor menselijke en dierlijke experimenten van het kanton Genève, de Kantonnale Commissie voor Onderzoeksethiek (CCER) en de Algemene Directie van het Gezondheidsgebied Genève (Zwitserland). Gegevens worden gerapporteerd volgens de richtlijnen voor dieronderzoek: rapportage in vivo experimenten (ARRIVE).
1. SPECT camera voorbereiding en kalibratie
<ol><li>Schakel de camera i...

<ol>
	<li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+Alzheimer's+disease+and+other+dementias,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li><li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer's+disease.">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 4, 575-590 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer's+disease:+Translating+basic+science+into+clinical+practice.">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer's+disease:+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans.">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques,+tau+pathology,+behavioral+impairment,+oligomeric+a&#946;,+and+frank+neuronal+loss.">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric a&#946;, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li><li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+Alzheimer's+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-&#946;+attenuation.">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-&#946; attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li><li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer's+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task.">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).</li><li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer's+disease:+A+preliminary+approach.">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).</li><li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyz&#233;riat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[11C]raclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2/3+receptors.">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346 (2020).</li><li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dopamine+D(2/3)+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+[18F]Fallypride+images.">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li><li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2/3+receptors+with+[18F]Fallypride+images.">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding.">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer's+disease.">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li></ol>

Voor zover wij weten, was deze techniek de eerste die een benadering beschreef die een beter begrip mogelijk maakt van in vivo bindingsveranderingen van een radiotracer op cellulair niveau. Het protocol beschrijft een multischaalmethode om radiotracerbinding op cellulair niveau te kwantificeren met behulp van [125I]CLINDE (TSPO) of [125I]R91150 (5HT2AR) als voorbeelden.
Deze techniek is robuust en gevoelig genoeg om nauwkeurig de cellulaire oorsprong t...

Neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer (AD), worden gekenmerkt door een neuronaal verlies geassocieerd met verhoogde symptomen. AD, de meest voorkomende oorzaak van dementie, goed voor 60% -70% van de gevallen, treft ongeveer 50 miljoen mensen wereldwijd1. Op neuropathologisch niveau zijn de twee belangrijkste kenmerken van AD de accumulatie van extracellulaire amyloïde-β (Aβ) plaques en intracellulaire Tau neurofibrillaire klitten. Gliacelveranderingen zijn ook in verband gebracht met AD2 en mogelijke verstoring van verschillende neurotransmittersystemen 3,4.
De TgF344-AD rattenlijn is aangepast naar model AD door menselijke APP- en PS1ΔE9-transgenen tot expressie te brengen, wat leidt tot oplosbare en onoplosbare Aβ-40- en Aβ-42-expressie en amyloïde plaquevorming5. Het presenteert ook de accumulatie van hyperfosforyleerde vormen van het Tau-eiwit die leiden tot tauopathie. Vanaf de leeftijd van 9-24 maanden ontwikkelen de ratten geleidelijk de pathologische kenmerken van AD en een cognitieve stoornis 5,6,7,8,9.
Positron Emission Tomography (PET), Single-Photon Emission computed Tomography (SPECT) en autoradiografie zijn technieken gebaseerd op de emissie en kwantificering van γ stralen. Radiotracers worden gekwantificeerd in vivo (PET en SPECT) of ex vivo/in vitro (autoradiografie). Die gevoelige technieken hebben bijgedragen aan het begrijpen van mechanismen van verschillende hersenziekten, zoals AD. Inderdaad, in termen van neuro-inflammatie zijn er veel studies die 18 kDa Translocator Protein (TSPO), een in vivo neuro-inflammatiemarker, beoordelen met radioactief gelabelde tracers zoals [11C] - (R) - PK11195 of [11C] PBR28 (voor beoordeling zie10). Bovendien zijn veranderingen van neurotransmittersystemen bestudeerd met behulp van radiotracers 11,12,13.
Die technieken bepalen echter niet de cellulaire oorsprong van het radioactieve signaal. Dit zou de interpretatie van de biologische onderbouwing van de verandering in de binding van een radioligand in PET/SPECT kunnen belemmeren. In het geval van TSPO-studies naar neuro-inflammatie is het bijvoorbeeld van het grootste belang om te begrijpen of de toename of afname van TSPO te wijten is aan astrocytische of microgliale veranderingen. De Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) techniek werd ontwikkeld om deze problemen te omzeilen, waardoor de beoordeling van radioligandbinding in elk celtype afzonderlijk en de kwantificering van de doeleiwitdichtheid per cel mogelijk is. Deze innovatieve techniek is bijgevolg complementair en zeer compatibel met PET- en SPECT-beeldvorming.
Hier werd deze techniek toegepast langs twee assen: de studie van neuro-inflammatie met behulp van TSPO-specifieke radioliganden en het beoordelen van het serotonerge systeem. Op de eerste as was het doel om de cellulaire oorsprong van het TSPO-signaal te begrijpen als reactie op een acute ontstekingsreactie. Daarom werd FACS-RTT gebruikt op de hersenweefsels van ratten na de inductie van neuro-inflammatie via een lipopolysaccharide (LPS) injectie en na een in vivo [125I] CLINDE SPECT beeldvormingsstudie. Verder werden dezelfde beeldvorming en hetzelfde FACS-RTT-protocol toegepast op 12- en 24 maanden oude TgF344-AD-ratten en bijpassende wild-type (WT) ratten. De tweede as was gericht op het bepalen van de oorsprong van serotoninerge systeemveranderingen in dit rattenmodel via ex vivo 5-HT2A R-dichtheidsbeoordelingper celtype.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVet</td>
			<td>BioVet</td>
			<td></td>
			<td>Software for vitals check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bondclone C18 reverse-phase column</td>
			<td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Des-Sur</td>
			<td>University Hospital of Geneva</td>
			<td></td>
			<td>Virucide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block / anti-CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB550270</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202504</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Knauer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>321312</td>
			<td>24 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ZDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacryvisc</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2160699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore soft tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>F51DA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILabs-Uspect II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Software for SPECT Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Removal Beads II</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-733</td>
			<td>Contains beads and myelin removal buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% Sterile solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>395202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Sheet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0074-10YD</td>
			<td>40 inch width, 80 micron size mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R91150 pr&#233;cursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Concentration column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodide Na125</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tributylin precursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-SPECT Rec2.38c</td>
			<td>MILabs</td>
			<td>Version Rec2.38c</td>
			<td>Software for SPECT images reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USPECT II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Spect Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard 3&#34;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Gamma counter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal

Gliacellen hebben waarschijnlijk een aanzienlijke implicatie in de pathofysiologie van neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer (AD). Hun veranderingen worden misschien geassocieerd met een pro-inflammatoire toestand. De TgF344-AD rattenstam is ontworpen om menselijke APP- en menselijke PS1ΔE9-genen tot expressie te brengen, coderend voor amyloïde eiwitten Aβ-40 en Aβ-42 en vertoont amyloïde pathologie en cognitieve tekorten bij veroudering. Het TgF344-AD rattenmodel wordt in deze studie gebruikt om de cellulaire oorsprong van de 18 kDa translocator eiwit (TSPO, een marker van gliacelactivatie) binding en de 5HT2A-receptor (5HT2AR) serotonine receptor niveaus die mogelijk verstoord zijn in AD te evalueren. De hier gepresenteerde techniek is Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), een kwantitatieve celtype-specifieke techniek die complementair is aan in vivo PET of SPECT of ex vivo/in vitro autoradiografietechnieken. Het kwantificeert dezelfde radioactief gelabelde tracer die eerder werd gebruikt voor beeldvorming, met behulp van een γ teller na cytometriecelsortering. Dit maakt het mogelijk om de cellulaire oorsprong van het radioactief gelabelde eiwit met hoge cellulaire specificiteit en gevoeligheid te bepalen. Studies met FACS-RTT toonden bijvoorbeeld aan dat (i) de toename van TSPO-binding geassocieerd was met microglia in een rattenmodel van lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde neuro-inflammatie, (ii) een toename van TSPO-binding na 12 en 18 maanden eerst geassocieerd was met astrocyten en vervolgens microglia in de TgF344-AD-ratten in vergelijking met wildtype (WT) ratten, en (iii) de striatale dichtheid van 5HT2A R neemt af in astrocyten na 18 maanden in hetzelfde rat AD-model. Interessant is dat deze techniek kan worden uitgebreid naar vrijwel alle radiotracers.

WT-ratten ondervonden in vivo SPECT-scan met [125I]CLINDE-radiotracer na een unilaterale LPS-injectie (figuur 2). Deze scan (met behulp van opgetelde gegevens van beelden van 45-60 min post radiotracer injectie) toonde een hogere binding van [125I]CLINDE op de plaats van de LPS-injectie (figuur 2A) dan in het contralaterale gebied van de hersenen (figuur 2B). De ex vivo monsters die FACS-RTT o...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) is een krachtig hulpmiddel om de rol van het 18 kDa translocator eiwit of serotonine 5HT2A-receptorexpressie bij de ziekte van Alzheimer op cellulaire schaal te bestuderen. Dit protocol beschrijft de ex-vivo toepassing van FACS-RTT in het TgF344-AD rat model.

Fluorescentie-geactiveerde celsortering-radioligand behandeld weefsel (FACS-RTT) om de cellulaire oorsprong van radioactief signaal te bepalen

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

Dit protocol is complementair aan in vivo beeldvorming. Het maakt celtype en cellulaire niveau kwantificering van radiotracers mogelijk, wat een andere schaal is dan degene die in vivo is verkregen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de gevoeligheid en de cellulaire resolutie die wordt gegeven door het gebruik van radioliganden en de celsortering.Schakel de camera in en laad de bedieningssoftware. Klik op de Home XYZ stage knop om homing uit te voeren. Stel het experiment in dat bestaat uit één scanacquisitie van 10 minuten.Stel de stapmodus in op fijn en de acquisitiemodus op de Listmode om het volledige emissiespectrum op te nemen. Stel het bed in en zorg ervoor dat het verwarmingssysteem, de ademhalingssensor en de anesthesie functioneel en veilig zijn. Plaats vervolgens een fantoom waar het hoofd van het dier zal worden geplaatst.Stel het scangebied in door de cursors voor de drie dimensies te schuiven met behulp van de drie afbeeldingen in het onderste deel van het scherm. Zorg ervoor dat het scanvolume van het fantoom en het dier hetzelfde is. Start de fantoomscan voor latere kalibratie met de eerder vastgestelde parameters.Zorg ervoor dat u werkt in een geschikte omgeving die is toegestaan voor experimenten met radioactiviteit. Incubeer 100 microgram tributylineprecursor in 100 microliter azijnzuur met natriumjodide en vijf microliter 37% paracetinezuur bij 70 graden Celsius gedurende 20 minuten in een thermocycler in een handschoenenkastje. Verdun de reactie met 50% acetonitril in water tot een volume van 500 microliter.Injecteer de 500 microliter van de verdunde reactie in een omgekeerde fasekolom. Isoleer de CLINDE met een lineaire gradiënt HPLC-run van 5 tot 95% ACN in zeven millimolair fosforzuur gedurende 10 minuten. Verdun het isolaat in water tot een eindvolume van 10 milliliter en injecteer vervolgens de verdunde reactie op een concentratiekolom.Eluteer de CLINDE uit de kolom met 300 microliter absolute ethanol en verdamp vervolgens de ethanol door deze gedurende 40 minuten in een vacuümcentrifuge bij kamertemperatuur te incuberen. Verdun het residu dat de CLINDE bevat in 300 microliter zoutoplossing om een voorraadoplossing te creëren. Verdun na het meten van de radioactiviteit de stamoplossing in zoutoplossing tot een oplossing van 0,037 megabecquerel in 500 microliter.Stel de kalibratiecurven vast met koude referentieverbindingen en los de lineaire regressievergelijking op:Y gelijk aan AX plus B om A- en B-coëfficiënten te verkrijgen. X vertegenwoordigt de massa van koude verbinding en Y vertegenwoordigt het gebied onder de krommen. Controleer het gebied onder de curve van het radioligand en meet de ultraviolette absorptie op 450 nanometer op basis van de kalibratiecurve en het gebied onder de curve van het radioligand.Schat de massa en meet de activiteit van de radioligand. Zorg ervoor dat de specifieke activiteit groter is dan 1.000 gigabecquerel per micromol. Klik op de knop Afbeelding bijwerken om de positie van het dier bij te werken.Stel het scangebied in door de cursors te schuiven met behulp van de drie afbeeldingen in het onderste deel van het scherm voor de drie dimensies. Stel het experiment in op een scan van 60 minuten die 60 frames van één minuut omvat. Gebruik alle andere parameters die in eerste instantie zijn ingesteld opnieuw.Injecteer 500 microliter van de radioactieve radiotracer en spoel de buis vervolgens met 300 microliter steriel 0,9% natriumchloride. Klik tegelijkertijd op Acquisitie starten om de scan te starten. Open de scanreconstructiesoftware en open vervolgens de gegevensset, op zoek naar het bestand met bestandsnaamparameters dat is gemaakt in de map van de scan.Selecteer de gewenste isotoop. Merk op dat de parameter list mode bij deze stap meerdere isotopenselectie toestaat. Stel de verschillende reconstructieparameters in, zoals de voxelgrootte, het aantal subsets en iteraties zoals beschreven in het manuscript.Selecteer het uitvoerformaat als NIFTI en selecteer vervolgens Spect-reconstructie starten. Gebruik een platte metalen spatel en een scheermesje om de interessegebieden van de hersenen te ontleden. Plaats de weefsels in een centrifugebuis van twee milliliter en weeg het verkregen weefsel.Doe de monsters in een centrifugebuis van twee milliliter met één milliliter calcium- en magnesiumvrij HBSS en centrifugeer vervolgens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur op 300 maal G en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Voeg 1.900 microliter enzymmix toe en incubeer het gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius terwijl je de buizen elke vijf minuten door inversie roert. Voeg 30 microliter enzymmix twee toe.Roer voorzichtig met een pipet van 1.000 microliter 30 keer heen en weer. Incubeer vervolgens het mengsel gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius terwijl u de buizen om de vijf minuten door inversie roert. Meng voorzichtig heen en weer met een pipet van 200 microliter en vervolgens een pipet van 10 microliter voordat u het mengsel gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius incubeert om de weefsels te dissociëren.Filter de cellen met een celzeef van 70 micrometer en voeg 10 milliliter calcium- en magnesiumvrij HBSS toe. Centrifugeer 300 maal G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Voor myeline-depletie, resuspend de pellet met 400 microliter myelineverwijderingsbuffer en voeg vervolgens 100 microliter myelineverwijderingsparels toe voordat u gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius broedt.Voeg vijf milliliter myelineverwijderingsbuffer toe en centrifugeer 300 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 500 microliter myelineverwijderingsbuffer toe en plaats de gesuspendeerde pellets in de magnetische veldkolom. Was de kolom vier keer met één milliliter myelineverwijderingsbuffer.Centrifugeer twee minuten bij kamertemperatuur op 300 maal G en verwijder het supernatant zonder de pellet te storen. Vortex kort om de cellen te dissociëren en vijf microliter Fc Block CD32 toe te voegen. Voeg 100 microliter van de mix van primaire antilichamen van belang toe en incubeer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.Centrifugeer bij 350 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Dep de buisjes ondersteboven op zacht papier. Vortex de buis kort, voeg dan 100 microliter van het secundaire antilichaammengsel toe en incubeer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.Voeg een milliliter myelineverwijderingsbuffer toe en herhaal de centrifugatie. Gooi het bovennatuurlijke middel weg en dep de buisjes ondersteboven op zacht papier. Resuspend de cellen in 250 microliter steriel PBS en ga direct over tot celsortering.De in vivo SPECT-scan van wild-type ratten toonde een hogere binding van CLINDE op de plaats van de lipopolysaccharide-injectie dan in het contra-laterale gebied van de hersenen. De ex vivo monsters die fluorescentie geactiveerde celsortering radioligand-behandeld weefsel, of FACS-RTT, ondergingen de aanwezigheid van een hoger aantal CLINDE-bindingsplaatsen alleen in microglia, wat aantoont dat de cellulaire oorsprong van het CLINDE-signaal in de ipsilaterale kant van de hersenen microglia was. De toename van translocatoreiwit, of TSPO-binding, na 12 maanden bij TgF344-AD-ratten was beperkt tot astrocyten.Bij 24 maanden oude ratten werd de toename van TSPO-binding waargenomen als gevolg van zowel astrocytische als microgliale veranderingen. Bij oudere TgF344-AD-ratten vertoonden striatale astrocyten een verminderde 5HT2AR-dichtheid in vergelijking met wildtype. Een corticale overexpressie van TSPO werd waargenomen in zowel astrocyten als microglia van AD-proefpersonen in vergelijking met leeftijdsgematchte controles wanneer FACS-RTT werd uitgevoerd op menselijke AD-postmortale monsters.Volg bij het werken met radioactiviteit de instructies van radiobeveiliging en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Zorg er vervolgens na de procedure voor dat u de werkomgeving ontsmet. Eiwitkwantificering en genexpressieanalyse kunnen na deze procedure eenvoudig worden uitgevoerd op geïsoleerde celpopulaties.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Een geoptimaliseerde Procedure voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) Isolatie van autonome neurale voorlopercellen uit viscerale organen van de foetus Muizen

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase activiteit in de verschillende regio&#39;s van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model voor de studie van cellulaire Pathofysiologie in globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) en genexpressie analyse van Fos expressie neuronen van verse en diepgevroren Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimatie van DAN Matrix voor de detectie en Visualisatie van gangliosiden in Rat Brain Tissue voor MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Een temperatuurgradiënt Assay thermische voorkeur van Drosophila larven bepalen

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primaire cel cultuur van gezuiverde erge of glutamaterge neuronen opgericht door fluorescentie-geactiveerde cel sorteren

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...