Name: fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse de la recherche scientifique (subvention n° 320030-184713). Les auteurs BBT et KC sont soutenus par la Fondation Velux (projet n. 1123). L’auteur ST a reçu le soutien du Fonds national suisse de la recherche scientifique (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), la Fondation Prof. Dr. Max Cloetta (bourse Médecine Clinique Plus), et la Fondation Jean et Madeleine Vachoux.

Toutes les procédures expérimentales ont été menées en accord avec le Comité d’éthique pour l’expérimentation humaine et animale du canton de Genève, la Commission cantonale d’éthique de la recherche (CCER) et la Direction générale de la santé du canton de Genève (Suisse), respectivement. Les données sont rapportées conformément aux lignes directrices de Recherche animale : Rapports d’expériences in vivo (ARRIVE).
1. Préparation et étalonnage de la caméra SP...

<ol>
	<li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+Alzheimer's+disease+and+other+dementias,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li><li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer's+disease.">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 4, 575-590 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer's+disease:+Translating+basic+science+into+clinical+practice.">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer's+disease:+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans.">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques,+tau+pathology,+behavioral+impairment,+oligomeric+a&#946;,+and+frank+neuronal+loss.">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric a&#946;, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li><li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+Alzheimer's+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-&#946;+attenuation.">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-&#946; attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li><li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer's+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task.">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).</li><li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer's+disease:+A+preliminary+approach.">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).</li><li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyz&#233;riat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[11C]raclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2/3+receptors.">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346 (2020).</li><li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dopamine+D(2/3)+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+[18F]Fallypride+images.">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li><li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2/3+receptors+with+[18F]Fallypride+images.">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding.">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer's+disease.">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li></ol>

À notre connaissance, cette technique a été la première à décrire une approche qui permet de mieux comprendre les altérations de liaison in vivo d’un radiotraceur au niveau cellulaire. Le protocole décrit une méthode multi-échelle pour quantifier la liaison des radiotraceurs au niveau cellulaire en utilisant [125I]CLINDE (TSPO) ou [125I]R91150 (5HT2AR) comme exemples.
Cette technique est suffisamment robuste et sensible pour détecter avec ...

Les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer (MA), se caractérisent par une perte neuronale associée à une augmentation des symptômes. La MA, la cause la plus fréquente de démence, représentant 60% à 70% des cas, touche environ 50 millions de personnes dans le monde1. Au niveau neuropathologique, les deux principales caractéristiques de la MA sont l’accumulation de plaques extracellulaires de β amyloïde (Aβ) et d’enchevêtrements neurofibrillaires tau intracellulaires. Des altérations des cellules gliales ont également été associées à laMA 2 et à la perturbation possible de plusieurs systèmes de neurotransmetteurs 3,4.
La lignée de rats TgF344-AD a été modifiée pour modéliser la MA en exprimant les transgènes humains APP et PS1ΔE9, conduisant à l’expression soluble et insoluble d’Aβ-40 et d’Aβ-42 et à la formation de plaque amyloïde5. Il présente également l’accumulation de formes hyperphosphorylées de la protéine Tau conduisant à la tauopathie. À partir de l’âge de 9 à 24 mois, les rats développent progressivement les caractéristiques pathologiques de la MA et une déficience cognitive 5,6,7,8,9.
La tomographie par émission de positons (TEP), la tomographie par émission monophotonique (TEMP) et l’autoradiographie sont des techniques basées sur l’émission et la quantification de rayons γ. Les radiotraceurs sont quantifiés soit in vivo (TEP et TEMP), soit ex vivo/in vitro (autoradiographie). Ces techniques sensibles ont contribué à la compréhension des mécanismes de plusieurs maladies du cerveau, telles que la MA. En effet, en termes de neuroinflammation, il existe de nombreuses études évaluant la protéine translocatrice 18 kDa (TSPO), un marqueur de neuroinflammation in vivo, avec des traceurs radiomarqués tels que [11C]-(R)-PK11195 ou [11C]PBR28 (pour examen voir10). En outre, les altérations des systèmes de neurotransmetteurs ont été étudiées à l’aide de radiotraceurs 11,12,13.
Cependant, ces techniques ne déterminent pas l’origine cellulaire du signal radioactif. Cela pourrait entraver l’interprétation des fondements biologiques de l’altération de la liaison d’un radioligand dans la TEP/TEMP. Par exemple, dans le cas des études TSPO sur la neuroinflammation, il est d’une importance primordiale de comprendre si l’augmentation ou la diminution de la TSPO est due à des changements astrocytaires ou microgliaux. La technique FACS-RTT (Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue) a été développée pour contourner ces problèmes, permettant l’évaluation de la liaison radioligand dans chaque type de cellule séparément et la quantification de la densité protéique cible par cellule. Cette technique innovante est donc complémentaire et hautement compatible avec l’imagerie TEP et TEMP.
Ici, cette technique a été appliquée selon deux axes: l’étude de la neuroinflammation à l’aide de radioligands spécifiques de TSPO et l’évaluation du système sérotoninergique. Sur le premier axe, l’objectif était de comprendre l’origine cellulaire du signal TSPO en réponse à une réaction inflammatoire aiguë. Par conséquent, FACS-RTT a été utilisé sur les tissus cérébraux de rats après l’induction de la neuroinflammation par injection de lipopolysaccharide (LPS) et à la suite d’une étude d’imagerie in vivo [125I]CLINDE SPECT. De plus, la même imagerie et le même protocole FACS-RTT ont été appliqués sur des rats TgF344-AD âgés de 12 et 24 mois et sur des rats de type sauvage (WT) correspondants. Le deuxième axe visait à déterminer l’origine des altérations du système sérotoninergique dans ce modèle de rat par l’évaluation ex vivo de la densité 5-HT2AR par type de cellule.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVet</td>
			<td>BioVet</td>
			<td></td>
			<td>Software for vitals check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bondclone C18 reverse-phase column</td>
			<td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Des-Sur</td>
			<td>University Hospital of Geneva</td>
			<td></td>
			<td>Virucide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block / anti-CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB550270</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202504</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Knauer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>321312</td>
			<td>24 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ZDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacryvisc</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2160699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore soft tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>F51DA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILabs-Uspect II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Software for SPECT Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Removal Beads II</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-733</td>
			<td>Contains beads and myelin removal buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% Sterile solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>395202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Sheet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0074-10YD</td>
			<td>40 inch width, 80 micron size mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R91150 pr&#233;cursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Concentration column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodide Na125</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tributylin precursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-SPECT Rec2.38c</td>
			<td>MILabs</td>
			<td>Version Rec2.38c</td>
			<td>Software for SPECT images reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USPECT II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Spect Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard 3&#34;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Gamma counter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal

Les cellules gliales ont probablement une implication considérable dans la physiopathologie des troubles neurodégénératifs, tels que la maladie d’Alzheimer (MA). Leurs altérations sont peut-être associées à un état pro-inflammatoire. La souche de rat TgF344-AD a été conçue pour exprimer les gènes humains APP et PS1ΔE9 humains, codant pour les protéines amyloïdes Aβ-40 et Aβ-42 et présente une pathologie amyloïde et des déficits cognitifs avec le vieillissement. Le modèle de rat TgF344-AD est utilisé dans cette étude pour évaluer l’origine cellulaire de la liaison à la protéine translocatrice de 18 kDa (TSPO, un marqueur de l’activation des cellules gliales) et les niveaux du récepteur 5HT2A (5HT2AR) de la sérotonine qui sont éventuellement perturbés dans la MA. La technique présentée ici est le tri cellulaire activé par fluorescence sur les tissus traités par radioligand (FACS-RTT), une technique quantitative spécifique au type cellulaire complémentaire aux techniques d’autoradiographie in vivo TEP ou TEMP ou ex vivo /in vitro . Il quantifie le même traceur radiomarqué utilisé auparavant pour l’imagerie, en utilisant un compteur de γ après le tri cellulaire de cytométrie. Cela permet de déterminer l’origine cellulaire de la protéine radiomarquée avec une spécificité et une sensibilité cellulaires élevées. Par exemple, des études avec FACS-RTT ont montré que (i) l’augmentation de la liaison tSPO était associée à la microglie dans un modèle de rat de neuroinflammation induite par les lipopolysaccharides (LPS), (ii) une augmentation de la liaison au TSPO à 12 et 18 mois était d’abord associée aux astrocytes, puis à la microglie chez les rats TgF344-AD par rapport aux rats de type sauvage (WT), et (iii) à la densité striatale de 5HT2A R diminue dans les astrocytes à 18 mois dans le même modèle de MA de rat. Fait intéressant, cette technique peut être étendue à pratiquement tous les radiotraceurs.

Les rats WT ont subi un balayage TEMP in vivo avec le radiotraceur [125I]CLINDE après une injection unilatérale de LPS (Figure 2). Ce scan (utilisant des données additionnées provenant d’images de 45 à 60 minutes après l’injection de radiotraceur) a montré une liaison plus élevée de [125I]CLINDE dans le site de l’injection de LPS (Figure 2A) que dans la région controlatérale du cerveau (Figure ...

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Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) est un outil puissant pour étudier le rôle de la protéine translocatrice 18 kDa ou de l’expression du récepteur 5HT2A de la sérotonine dans la maladie d’Alzheimer à l’échelle cellulaire. Ce protocole décrit l’application ex vivo de FACS-RTT dans le modèle de rat TgF344-AD.

Tri cellulaire activé par fluorescence - Tissu traité par radioligand (FACS-RTT) pour déterminer l’origine cellulaire du signal radioactif

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

Ce protocole est complémentaire à l’imagerie in vivo. Il permet la quantification du type cellulaire et du niveau cellulaire des radiotraceurs, qui est une échelle différente de celle obtenue in vivo. Le principal avantage de cette technique est sa sensibilité et la résolution cellulaire donnée par l’utilisation de radioligands et le tri cellulaire.Allumez l’appareil photo et chargez le logiciel d’exploitation. Cliquez sur le bouton home XYZ stage pour effectuer le homing. Configurez l’expérience composée d’une acquisition de numérisation de 10 minutes.Réglez le mode Pas sur fine et le mode Acquisition sur le mode Liste pour enregistrer l’ensemble du spectre d’émission. Installez le lit et assurez-vous que le système de réchauffement, le capteur respiratoire et l’anesthésie sont fonctionnels et sécurisés. Ensuite, placez un fantôme à l’endroit où la tête de l’animal sera positionnée.Définissez la zone de numérisation en faisant glisser les curseurs pour les trois dimensions à l’aide des trois images dans la partie inférieure de l’écran. Assurez-vous que le volume de balayage du fantôme et de l’animal est le même. Démarrez l’analyse fantôme pour un étalonnage ultérieur avec les paramètres précédemment établis.S’assurer de travailler dans un environnement approprié, autorisé pour les expériences impliquant de la radioactivité. Incuber 100 microgrammes de précurseur de tributyline dans 100 microlitres d’acide acétique avec de l’iodure de sodium et cinq microlitres d’acide paracétique à 37% à 70 degrés Celsius pendant 20 minutes dans un thermocycleur positionné dans une boîte à gants. Diluer la réaction en utilisant 50% d’acétonitrile dans de l’eau pour atteindre un volume de 500 microlitres.Injecter les 500 microlitres de la réaction diluée sur une colonne de phase inverse. Isoler le CLINDE avec une CLHP à gradient linéaire allant de 5 à 95 % d’ACN dans de l’acide phosphorique de sept millimolaires pendant 10 minutes. Diluer l’isolat dans l’eau pour atteindre un volume final de 10 millilitres, puis injecter la réaction diluée sur une colonne de concentration.Éluez le CLINDE de la colonne avec 300 microlitres d’éthanol absolu, puis évaporez l’éthanol en l’incubant dans une centrifugeuse à vide à température ambiante pendant 40 minutes. Diluer le résidu contenant le CLINDE dans 300 microlitres de solution saline pour créer une solution mère. Après avoir mesuré sa radioactivité, diluer la solution mère dans une solution saline pour obtenir une solution de 0,037 mégabecquerel dans 500 microlitres.Établissez les courbes d’étalonnage avec des composés de référence à froid et résolvez l’équation de régression linéaire :Y égale à AX plus B pour obtenir les coefficients A et B. X représente la masse du composé froid et Y représente l’aire sous les courbes. Vérifiez la zone sous la courbe du radioligand, en mesurant l’absorbance ultraviolette à 450 nanomètres en fonction de la courbe d’étalonnage et de l’aire sous la courbe du radioligand.Estimer la masse et mesurer l’activité du radioligand. Assurez-vous que l’activité spécifique est supérieure à 1 000 gigabecquerel par micromole. Cliquez sur le bouton Mettre à jour l’image pour mettre à jour la position de l’animal.Définissez la zone de numérisation en faisant glisser les curseurs à l’aide des trois images dans la partie inférieure de l’écran pour les trois dimensions. Configurez l’expérience sur un scan de 60 minutes constituant 60 images d’une minute. Réutilisez tous les autres paramètres configurés initialement.Injecter 500 microlitres du radiotraceur radioactif, puis rincer le tube avec 300 microlitres de chlorure de sodium stérile à 0,9%. Simultanément, cliquez sur Démarrer l’acquisition pour lancer l’analyse. Ouvrez le logiciel de reconstruction de l’analyse, puis ouvrez le jeu de données, en recherchant le fichier de paramètres de nom de fichier créé dans le dossier de l’analyse.Sélectionnez l’isotope qui vous intéresse. Notez que le paramètre de mode liste permet la sélection de plusieurs isotopes à cette étape. Définissez les différents paramètres de reconstruction tels que la taille du voxel, le nombre de sous-ensembles et les itérations comme décrit dans le manuscrit.Sélectionnez le format de sortie NIFTI, puis sélectionnez Démarrer la reconstruction SPECT. Utilisez une spatule métallique plate et une lame de rasoir pour disséquer les régions d’intérêt du cerveau. Placez les tissus dans un tube centrifuge de deux millilitres et pesez le tissu obtenu.Mettez les échantillons dans un tube de centrifugeuse de deux millilitres avec un millilitre de HBSS sans calcium et magnésium, puis centrifugez à 300 fois G pendant deux minutes à température ambiante et retirez le surnageant sans perturber la pastille. Ajouter 1 900 microlitres de mélange d’enzymes un et l’incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius tout en agitant les tubes par inversion toutes les cinq minutes. Ajouter 30 microlitres de mélange d’enzymes deux.Agiter doucement avec une pipette de 1 000 microlitres d’avant en arrière 30 fois. Ensuite, incuber le mélange pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius tout en agitant les tubes par inversion toutes les cinq minutes. Mélanger doucement d’avant en arrière avec une pipette de 200 microlitres, puis une pipette de 10 microlitres avant d’incuber le mélange pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius pour dissocier les tissus.Filtrez les cellules avec une passoire cellulaire de 70 micromètres et ajoutez 10 millilitres de HBSS sans calcium et magnésium. Centrifuger à 300 fois G pendant 10 minutes à température ambiante et retirer le surnageant sans perturber la pastille. Pour l’épuisement de la myéline, remettez en suspension la pastille avec 400 microlitres de tampon d’élimination de la myéline, puis ajoutez 100 microlitres de billes d’élimination de la myéline avant d’incuber pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Ajouter cinq millilitres de tampon d’élimination de la myéline et centrifuger 300 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. Ajouter 500 microlitres de tampon d’élimination de la myéline et placer les pastilles suspendues dans la colonne de champ magnétique. Lavez la colonne avec un millilitre de tampon d’élimination de la myéline quatre fois.Centrifuger à 300 fois G pendant deux minutes à température ambiante et retirer le surnageant sans perturber la pastille. Vortex brièvement pour dissocier les cellules et ajouter cinq microlitres de Fc Block CD32. Ajouter 100 microlitres du mélange d’anticorps primaires d’intérêt et incuber pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Centrifuger à 350 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirer le surnageant sans perturber la pastille. Épongez les tubes à l’envers sur du papier souple. Vortex le tube brièvement, puis ajouter 100 microlitres du mélange d’anticorps secondaires et incuber pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Ajouter un millilitre de tampon d’élimination de la myéline et répéter la centrifugation. Jetez le surnageant et épongez les tubes à l’envers sur du papier souple. Resuspendez les cellules dans 250 microlitres de PBS stérile et procédez directement au tri cellulaire.Le scan TEMP in vivo de rats de type sauvage a montré une liaison plus élevée du CLINDE dans le site d’injection de lipopolysaccharide que dans la région contra-latérale du cerveau. Les échantillons ex vivo qui ont subi un tri cellulaire activé par fluorescence des tissus traités par radioligand, ou FACS-RTT, ont révélé la présence d’un plus grand nombre de sites de liaison CLINDE uniquement dans la microglie, montrant que l’origine cellulaire du signal CLINDE dans le côté ipsilatéral du cerveau était la microglie. L’augmentation de la protéine translocatrice, ou liaison TSPO, à 12 mois chez les rats TgF344-AD a été limitée aux astrocytes.Chez les rats âgés de 24 mois, l’augmentation de la liaison TSPO a été observée en raison d’altérations astrocytaires et microgliales. Chez les rats TgF344-AD plus âgés, les astrocytes striataux présentaient une densité de 5HT2AR diminuée par rapport au type sauvage. Une surexpression corticale de TSPO a été observée dans les astrocytes et les microglies des sujets atteints de MA par rapport aux témoins appariés selon l’âge lorsque FACS-RTT a été effectué sur des échantillons post-mortem de MA humains.Lorsque vous travaillez avec la radioactivité, suivez les instructions de radioprotection et portez un équipement de protection individuelle approprié. Ensuite, après la procédure, assurez-vous de décontaminer l’environnement de travail. La quantification des protéines et l’analyse de l’expression génique peuvent facilement être effectuées après cette procédure sur des populations cellulaires isolées.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Une procédure optimisée pour Fluorescence-activated tri cellulaire (FACS) Isolement du système nerveux autonome progéniteurs neuronaux de viscères de souris sur le fœtus

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Recherche

Neurosciences

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Utilisation d&#39;un multiplexage Caspase test destiné à déterminer l&#39;apoptose dans une cellule du modèle hypothalamique

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau de souris: la télomérase non-radioactifs Répétition protocole d&#39;amplification (TRAP) Dosage

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle pour l&#39;étude de la physiopathologie cellulaire en cellules globoïdes Leucodystrophie

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) et Gene Expression Analyse de Fos exprimant Neurones de frais et de tissus congelés cerveau de rat

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero électroporation approches pour étudier l&#39;excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimation de DAN Matrice pour la détection et la visualisation des gangliosides dans Rat Tissue Brain MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Un dosage de Gradient de température pour déterminer les préférences thermiques de larves de drosophile

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Culture de cellules primaires de neurones GABAergiques ou glutamatergiques purifiés établis par tri cellulaire activé par fluorescence

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...