Name: fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (Förderkennzeichen 320030-184713) unterstützt. Die Autoren BBT und KC werden von der Velux Foundation (Projekt Nr. 1123) unterstützt. Autor ST erhielt Unterstützung vom Schweizerischen Nationalfonds (Early Post-Doc Mobility Scholarship, Nr. P2GEP3_191446), die Prof. Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus Stipendium) und die Jean and Madeleine Vachoux Foundation.

Alle experimentellen Verfahren wurden in Absprache mit der Ethikkommission für Menschen- und Tierversuche des Kantons Genf, der Kantonalen Kommission für Forschungsethik (CCER) bzw. der Allgemeinen Gesundheitsdirektion des Kantons Genf (Schweiz) durchgeführt. Die Daten werden gemäß den Richtlinien von Animal Research: Reporting In-vivo Experiments (ARRIVE) gemeldet.
1. Vorbereitung und Kalibrierung der SPECT-Kamera
<ol><li>Schalten Sie die Kamera ein, laden Sie die Bediensoftwa...

<ol>
	<li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+Alzheimer's+disease+and+other+dementias,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li><li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer's+disease.">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 4, 575-590 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer's+disease:+Translating+basic+science+into+clinical+practice.">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer's+disease:+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans.">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques,+tau+pathology,+behavioral+impairment,+oligomeric+a&#946;,+and+frank+neuronal+loss.">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric a&#946;, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li><li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+Alzheimer's+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-&#946;+attenuation.">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-&#946; attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li><li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer's+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task.">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).</li><li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer's+disease:+A+preliminary+approach.">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).</li><li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyz&#233;riat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[11C]raclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2/3+receptors.">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346 (2020).</li><li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dopamine+D(2/3)+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+[18F]Fallypride+images.">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li><li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2/3+receptors+with+[18F]Fallypride+images.">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding.">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer's+disease.">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li></ol>

Unseres Wissens war diese Technik die erste, die einen Ansatz beschrieb, der ein besseres Verständnis von in vivo bindenden Veränderungen eines Radiotracers auf zellulärer Ebene ermöglicht. Das Protokoll beschreibt eine Multiskalenmethode zur Quantifizierung der Radiotracerbindung auf zellulärer Ebene am Beispiel von [125I]CLINDE (TSPO) oder [125I]R91150 (5HT2AR).
Diese Technik ist robust und empfindlich genug, um den zellulären Ursprung eines br...

Neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit (AD) sind durch einen neuronalen Verlust gekennzeichnet, der mit erhöhten Symptomen einhergeht. AD, die häufigste Ursache für Demenz, die 60% -70% der Fälle ausmacht, betrifft weltweit rund 50 Millionen Menschen1. Auf neuropathologischer Ebene sind die beiden Hauptmerkmale von AD die Ansammlung von extrazellulären Amyloid-β (Aβ) -Plaques und intrazellulären Tau-Neurofibrillenverwicklungen. Gliazellveränderungen wurden auch mit AD2 und einer möglichen Störung mehrerer Neurotransmittersysteme in Verbindung gebracht 3,4.
Die TgF344-AD-Rattenlinie wurde modifiziert, um AD zu modellieren, indem humane APP- und PS1ΔE9-Transgene exprimiert wurden, was zu einer löslichen und unlöslichen Aβ-40- und Aβ-42-Expression und Amyloid-Plaquebildungführte 5. Es zeigt auch die Anhäufung von hyperphosphorylierten Formen des Tau-Proteins, die zur Tauopathie führen. Ab dem Alter von 9-24 Monaten entwickeln die Ratten allmählich die pathologischen Merkmale von AD und eine kognitive Beeinträchtigung 5,6,7,8,9.
Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) und Autoradiographie sind Techniken, die auf der Emission und Quantifizierung von γ Strahlen basieren. Radiotracer werden entweder in vivo (PET und SPECT) oder ex vivo/in vitro (Autoradiographie) quantifiziert. Diese empfindlichen Techniken haben zum Verständnis der Mechanismen verschiedener Gehirnerkrankungen wie AD beigetragen. Tatsächlich gibt es in Bezug auf Neuroinflammation viele Studien, in denen 18 kDa Translocator Protein (TSPO), ein in vivo Neuroinflammation Marker, mit radioaktiv markierten Tracern wie [11 C]-(R)-PK11195 oder [11C]PBR28 bewertet wird (zur Überprüfung siehe 10). Darüber hinaus wurden Veränderungen von Neurotransmittersystemen mit Radiotracern11,12,13 untersucht.
Diese Techniken bestimmen jedoch nicht den zellulären Ursprung des radioaktiven Signals. Dies könnte die Interpretation der biologischen Grundlagen der Veränderung der Bindung eines Radioliganden in PET/SPECT behindern. Im Falle von TSPO-Studien zur Neuroinflammation ist es beispielsweise von größter Bedeutung zu verstehen, ob der Anstieg oder Rückgang des TSPO auf astrozytäre oder mikrogliale Veränderungen zurückzuführen ist. Die FACS-RTT-Technik (Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue) wurde entwickelt, um diese Probleme zu umgehen und die Beurteilung der Radioligandenbindung in jedem Zelltyp separat und die Quantifizierung der Zielproteindichte pro Zelle zu ermöglichen. Diese innovative Technik ist daher komplementär und hochgradig kompatibel mit PET- und SPECT-Bildgebung.
Hier wurde diese Technik entlang zweier Achsen angewendet: der Untersuchung der Neuroinflammation mit TSPO-spezifischen Radioliganden und der Beurteilung des serotonergen Systems. Auf der ersten Achse ging es darum, den zellulären Ursprung des TSPO-Signals als Reaktion auf eine akute Entzündungsreaktion zu verstehen. Daher wurde FACS-RTT am Hirngewebe von Ratten nach der Induktion einer Neuroinflammation über eine Lipopolysaccharid (LPS) -Injektion und nach einer in vivo [125I]CLINDE SPECT Bildgebungsstudie eingesetzt. Darüber hinaus wurden die gleiche Bildgebung und das FACS-RTT-Protokoll auf 12 und 24 Monate alte TgF344-AD-Ratten und passende Wildtyp-Ratten (WT) angewendet. Die zweite Achse zielte darauf ab, den Ursprung serotoninerger Systemveränderungen in diesem Rattenmodell durch ex vivo 5-HT2AR Dichtebewertung nach Zelltyp zu bestimmen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVet</td>
			<td>BioVet</td>
			<td></td>
			<td>Software for vitals check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bondclone C18 reverse-phase column</td>
			<td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Des-Sur</td>
			<td>University Hospital of Geneva</td>
			<td></td>
			<td>Virucide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block / anti-CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB550270</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202504</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Knauer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>321312</td>
			<td>24 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ZDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacryvisc</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2160699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore soft tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>F51DA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILabs-Uspect II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Software for SPECT Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Removal Beads II</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-733</td>
			<td>Contains beads and myelin removal buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% Sterile solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>395202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Sheet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0074-10YD</td>
			<td>40 inch width, 80 micron size mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R91150 pr&#233;cursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Concentration column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodide Na125</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tributylin precursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-SPECT Rec2.38c</td>
			<td>MILabs</td>
			<td>Version Rec2.38c</td>
			<td>Software for SPECT images reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USPECT II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Spect Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard 3&#34;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Gamma counter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal

Gliazellen haben wahrscheinlich eine erhebliche Bedeutung in der Pathophysiologie neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit (AD). Ihre Veränderungen sind vielleicht mit einem entzündungsfördernden Zustand verbunden. Der Rattenstamm TgF344-AD wurde entwickelt, um menschliche APP- und menschliche PS1ΔE9-Gene zu exprimieren, die für die Amyloidproteine Aβ-40 und Aβ-42 kodieren und Amyloidpathologie und kognitive Defizite mit zunehmendem Alter aufweisen. Das TgF344-AD-Rattenmodell wird in dieser Studie verwendet, um den zellulären Ursprung der Bindung des 18-kDa-Translokatorproteins (TSPO, ein Marker für die Aktivierung von Gliazellen) und der Serotoninrezeptorspiegel des5HT 2A-Rezeptors (5HT2A R) zu bewerten, die möglicherweise bei AD gestört sind. Die hier vorgestellte Technik ist Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), eine quantitative zelltypspezifische Technik, die in vivo PET oder SPECT oder ex vivo/in vitro Autoradiographietechniken ergänzt. Es quantifiziert den gleichen radioaktiv markierten Tracer, der zuvor für die Bildgebung verwendet wurde, unter Verwendung eines γ-Zählers nach der Zellsortierung der Zytometrie. Dies ermöglicht es, den zellulären Ursprung des radioaktiv markierten Proteins mit hoher zellulärer Spezifität und Sensitivität zu bestimmen. Zum Beispiel zeigten Studien mit FACS-RTT, dass (i) die Zunahme der TSPO-Bindung mit Mikroglia in einem Rattenmodell von Lipopolysaccharid (LPS)-induzierten Neuroinflammation assoziiert war, (ii) eine Zunahme der TSPO-Bindung nach 12 und 18 Monaten zuerst mit Astrozyten und dann mit Mikroglia bei den TgF344-AD-Ratten im Vergleich zu Wildtyp-Ratten (WT) assoziiert war, und (iii) die striatale Dichte von 5HT2A R nimmt in Astrozyten nach 18 Monaten im selben Ratten-AD-Modell ab. Interessanterweise kann diese Technik auf praktisch alle Radiotracer ausgedehnt werden.

WT-Ratten erlebten einen vivo SPECT-Scan mit [125I]CLINDE Radiotracer nach einer einseitigen LPS-Injektion (Abbildung 2). Dieser Scan (unter Verwendung summierter Daten aus Bildern von 45-60 min nach der Radiotracer-Injektion) zeigte eine höhere Bindung von [125I]CLINDE an der Stelle der LPS-Injektion (Abbildung 2A) als in der kontralateralen Region des Gehirns (Abbildung 2B). Die Ex-vivo-Proben</...

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Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle des 18-kDa-Translokatorproteins oder der Serotonin-5HT-2A-Rezeptorexpression bei der Alzheimer-Krankheit auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Ex-vivo-Anwendung von FACS-RTT im Rattenmodell TgF344-AD.

Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortierungs-Radioliganden-behandeltes Gewebe (FACS-RTT) zur Bestimmung des zellulären Ursprungs des radioaktiven Signals

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

Dieses Protokoll ergänzt die In-vivo-Bildgebung. Es ermöglicht die Quantifizierung von Radiotracern auf Zelltyp und zellulärer Ebene, was eine andere Skala ist als die, die in vivo erhalten wurde. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Empfindlichkeit und die zelluläre Auflösung, die durch die Verwendung von Radioliganden und die Zellsortierung gegeben ist.Schalten Sie die Kamera ein und laden Sie die Betriebssoftware. Klicken Sie auf die Schaltfläche Home XYZ-Bühne, um das Homing durchzuführen. Richten Sie das Experiment ein, das aus einer 10-minütigen Scanerfassung besteht.Stellen Sie den Schrittmodus auf fein und den Erfassungsmodus auf den Listmodus, um das gesamte Emissionsspektrum aufzuzeichnen. Stellen Sie das Bett auf und stellen Sie sicher, dass das Wärmesystem, der Atemsensor und die Anästhesie funktionsfähig und sicher sind. Platzieren Sie dann ein Phantom an der Stelle, an der der Kopf des Tieres positioniert wird.Legen Sie den Scanbereich fest, indem Sie die Cursor für die drei Dimensionen mit Hilfe der drei Bilder im unteren Teil des Bildschirms verschieben. Stellen Sie sicher, dass das Scanvolumen des Phantoms und des Tieres gleich ist. Starten Sie den Phantomscan zur anschließenden Kalibrierung mit den zuvor festgelegten Parametern.Stellen Sie sicher, dass Sie in einer geeigneten Umgebung arbeiten, die für Experimente mit Radioaktivität zugelassen ist. Inkubieren Sie 100 Mikrogramm Tributylinvorstufe in 100 Mikrolitern Essigsäure mit Natriumiodid und fünf Mikroliter 37% Paracetsäure bei 70 Grad Celsius für 20 Minuten in einem Thermocycler, der in einem Handschuhfach positioniert ist. Verdünnen Sie die Reaktion mit 50% Acetonitril in Wasser, um ein Volumen von 500 Mikrolitern zu erreichen.Injizieren Sie die 500 Mikroliter der verdünnten Reaktion auf eine Umkehrphasensäule. Isolieren Sie die CLINDE mit einem linearen HPLC-Lauf von 5 bis 95% ACN in sieben-millimolärer Phosphorsäure für 10 Minuten. Verdünnen Sie das Isolat in Wasser, um ein Endvolumen von 10 Millilitern zu erreichen, und injizieren Sie dann die verdünnte Reaktion auf eine Konzentrationssäule.Die CLINDE aus der Säule mit 300 Mikrolitern absolutem Ethanol eluieren und dann das Ethanol verdampfen, indem Sie es in einer Vakuumzentrifuge bei Raumtemperatur für 40 Minuten inkubieren. Verdünnen Sie den Rückstand, der die CLINDE enthält, in 300 Mikroliter Kochsalzlösung, um eine Stammlösung zu erhalten. Nach der Messung der Radioaktivität verdünnen Sie die Stammlösung in Kochsalzlösung, um eine Lösung von 0,037 Megabecquerel in 500 Mikrolitern zu erhalten.Legen Sie die Kalibrierkurven mit kalten Referenzverbindungen fest und lösen Sie die lineare Regressionsgleichung auf:Y gleich AX plus B, um A- und B-Koeffizienten zu erhalten. X stellt die Masse der kalten Verbindung dar, und Y stellt die Fläche unter den Kurven dar. Überprüfen Sie den Bereich unter der Kurve des Radioliganden und messen Sie die ultraviolette Absorption bei 450 Nanometern basierend auf der Kalibrierkurve und der Fläche unter der Kurve des Radioliganden.Schätzen Sie die Masse und messen Sie die Aktivität des Radioliganden. Stellen Sie sicher, dass die spezifische Aktivität mehr als 1.000 Gigabecquerel pro Mikromol beträgt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bild aktualisieren, um die Tierposition zu aktualisieren.Legen Sie den Scanbereich fest, indem Sie die Cursor mit Hilfe der drei Bilder im unteren Teil des Bildschirms für die drei Dimensionen schieben. Richten Sie das Experiment auf einem 60-minütigen Scan ein, der 60 Frames von einer Minute umfasst. Verwenden Sie alle anderen anfänglich eingerichteten Parameter wieder.Injizieren Sie 500 Mikroliter des radioaktiven Radiotracers und spülen Sie dann das Röhrchen mit 300 Mikrolitern sterilem 0,9% Natriumchlorid. Klicken Sie gleichzeitig auf Aufnahme starten, um den Scan zu starten. Öffnen Sie die Scan-Rekonstruktionssoftware und öffnen Sie dann den Datensatz, indem Sie nach der Dateinamen-Parameterdatei suchen, die im Ordner des Scans erstellt wurde.Wählen Sie das gewünschte Isotop aus. Beachten Sie, dass der Parameter Listenmodus in diesem Schritt die Auswahl mehrerer Isotopen zulässt. Legen Sie die verschiedenen Rekonstruktionsparameter wie die Voxelgröße, die Anzahl der Teilmengen und die Iterationen fest, wie im Manuskript beschrieben.Wählen Sie das Ausgabeformat als NIFTI und dann SPECT-Rekonstruktion starten aus. Verwenden Sie einen flachen Metallspatel und eine Rasierklinge, um die interessierenden Regionen des Gehirns zu sezieren. Legen Sie das Gewebe in ein Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und wiegen Sie das erhaltene Gewebe.Geben Sie die Proben in ein Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit einem Milliliter Calcium- und Magnesium-freiem HBSS und zentrifugieren Sie dann bei 300 mal G für zwei Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie 1.900 Mikroliter Enzymmischung hinzu und inkubieren Sie es für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, während Sie die Röhrchen alle fünf Minuten durch Inversion bewegen. Fügen Sie 30 Mikroliter Enzymmischung zwei hinzu.Mit einer 1.000 Mikroliter Pipette 30 Mal vorsichtig hin und her rühren. Dann inkubieren Sie die Mischung für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, während Sie die Röhrchen alle fünf Minuten durch Inversion rühren. Mischen Sie vorsichtig hin und her mit einer 200-Mikroliter-Pipette und dann einer 10-Mikroliter-Pipette, bevor Sie die Mischung für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, um das Gewebe zu dissoziieren.Filtern Sie die Zellen mit einem 70-Mikrometer-Zellsieb und fügen Sie 10 Milliliter kalzium- und magnesiumfreies HBSS hinzu. Bei 300 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören. Für den Myelinabbau suspendieren Sie das Pellet mit 400 Mikrolitern Myelinentfernungspuffer und fügen Sie dann 100 Mikroliter Myelinentfernungsperlen hinzu, bevor Sie für 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren.Fügen Sie fünf Milliliter Myelinentfernungspuffer hinzu und zentrifieren Sie 300 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie 500 Mikroliter Myelinentfernungspuffer hinzu und legen Sie die suspendierten Pellets in die Magnetfeldsäule. Waschen Sie die Säule viermal mit einem Milliliter Myelinentfernungspuffer.Bei Raumtemperatur bei 300 mal G zentrifugieren und den Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören. Vortex kurz, um die Zellen zu dissoziieren und fünf Mikroliter Fc Block CD32 hinzuzufügen. Fügen Sie 100 Mikroliter der Mischung der primären Antikörper von Interesse hinzu und inkubieren Sie für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.Zentrifugieren Sie bei 350 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Tupfen Sie die Röhrchen kopfüber auf weiches Papier. Wirbeln Sie die Röhre kurz auf, fügen Sie dann 100 Mikroliter der sekundären Antikörpermischung hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius.Fügen Sie einen Milliliter Myelinentfernungspuffer hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation. Entsorgen Sie den Überstand und tupfen Sie die Röhrchen kopfüber auf weiches Papier. Suspendieren Sie die Zellen in 250 Mikrolitern sterilem PBS und fahren Sie direkt mit der Zellsortierung fort.Der in vivo SPECT-Scan von Wildtyp-Ratten zeigte eine höhere Bindung von CLINDE an der Stelle der Lipopolysaccharid-Injektion als in der kontralateralen Region des Gehirns. Die Ex-vivo-Proben, die fluoreszenzaktiviertes Zellsortierungs-radioligandenbehandeltes Gewebe oder FACS-RTT unterzogen wurden, zeigten das Vorhandensein einer höheren Anzahl von CLINDE-Bindungsstellen nur in Mikroglia, was zeigt, dass der zelluläre Ursprung des CLINDE-Signals auf der ipsilateralen Seite des Gehirns Mikroglia war. Der Anstieg des Translokatorproteins oder der TSPO-Bindung nach 12 Monaten bei TgF344-AD-Ratten war auf Astrozyten beschränkt.Bei 24 Monate alten Ratten wurde die Zunahme der TSPO-Bindung sowohl aufgrund astrozytischer als auch mikroglialer Veränderungen beobachtet. Bei älteren TgF344-AD-Ratten zeigten striatale Astrozyten im Vergleich zum Wildtyp eine verringerte 5HT2AR-Dichte. Eine kortikale Überexpression von TSPO wurde sowohl in Astrozyten als auch in Mikroglia von AD-Probanden im Vergleich zu altersangepassten Kontrollen beobachtet, wenn FACS-RTT an humanen AD-Postmortem-Proben durchgeführt wurde.Befolgen Sie bei der Arbeit mit Radioaktivität die Anweisungen des Strahlenschutzes und tragen Sie eine geeignete persönliche Schutzausrüstung. Stellen Sie dann nach dem Eingriff sicher, dass die Arbeitsumgebung dekontaminiert wird. Die Proteinquantifizierung und Genexpressionsanalyse kann nach diesem Verfahren an isolierten Zellpopulationen problemlos durchgeführt werden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Eine optimierte Methode für Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) Isolierung von Autonomic neuralen Vorläuferzellen aus inneren Organen des Fötus Mäuse

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Verwendung eines Caspase Multiplexing-Test zur Apoptose in einer Zelle Hypothalamus Modell ermitteln

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Regionen der Maus Gehirn: Nicht-radioaktive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell für die Untersuchung der zellulären Pathophysiologie in Globoidzell- Leukodystrophie

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) und Genexpressionsanalyse von Fos-exprimierenden Neurone von Frische und Gefrorene Rattenhirngewebe

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimation von DAN Matrix für die Erkennung und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Ein Temperaturgradient Assay thermische Präferenzen der Drosophila Larven bestimmen

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primärzellkultur von gereinigten Gurified GABAergic oder Glutamatergic Neuronen, die durch Fluoreszon-Sortierung gegründet wurden

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...