Name: fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע (מענק מס '320030-184713). המחברים BBT ו-KC נתמכים על ידי קרן Velux (פרויקט מס' 1123). המחבר ST קיבל תמיכה מהקרן הלאומית השוויצרית למדע (מלגת ניידות פוסט-דוקטורט מוקדמת, לא. P2GEP3_191446), קרן פרופ' מקס קלוטה (מלגת רפואה קלינית פלוס), וקרן ז'אן ומדלן ואצ'ו.

כל ההליכים הניסוייים נערכו בהסכמה עם ועדת האתיקה לניסויים בבני אדם ובבעלי חיים של קנטון ז'נבה, הוועדה הקנטונלית לאתיקה מחקרית (CCER), והכיוון הכללי של בריאות קנטון ז'נבה (שוויץ), בהתאמה. הנתונים מדווחים בעקבות הנחיות מחקר בבעלי חיים: דיווח על ניסויים In-vivo (ARRIVE).
1. הכנת וכיול מ...

<ol>
	<li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+Alzheimer's+disease+and+other+dementias,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li><li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer's+disease.">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 4, 575-590 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer's+disease:+Translating+basic+science+into+clinical+practice.">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer's+disease:+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans.">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques,+tau+pathology,+behavioral+impairment,+oligomeric+a&#946;,+and+frank+neuronal+loss.">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric a&#946;, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li><li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+Alzheimer's+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-&#946;+attenuation.">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-&#946; attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li><li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer's+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task.">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).</li><li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer's+disease:+A+preliminary+approach.">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).</li><li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyz&#233;riat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[11C]raclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2/3+receptors.">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346 (2020).</li><li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dopamine+D(2/3)+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+[18F]Fallypride+images.">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li><li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2/3+receptors+with+[18F]Fallypride+images.">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding.">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer's+disease.">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li></ol>

למיטב ידיעתנו, טכניקה זו הייתה הראשונה שתיארה גישה המאפשרת הבנה טובה יותר של שינויים מחייבי in vivo של רדיוטראקר ברמה התאית. הפרוטוקול מתאר שיטה רב-ממדית לכימות קשירת רדיו-טראקר ברמה התאית באמצעות [125I]CLINDE (TSPO) או [125I]R91150 (5HT2AR) כדוגמאות.
טכניקה זו חזקה ורגיש?...

מחלות נוירודגנרטיביות, כגון מחלת אלצהיימר (AD), מאופיינות באובדן עצבי הקשור לתסמינים מוגברים. AD, הגורם השכיח ביותר לדמנציה, המהווה 60%-70% מהמקרים, משפיע על כ -50 מיליון אנשים ברחבי העולם1. ברמה הנוירופתולוגית, שני המאפיינים העיקריים של AD הם הצטברות של רבדים חוץ-תאיים β עמילואיד (Aβ) וסבכים נוירופיברילריים תוך תאיים של טאו. שינויים בתאי גליה נקשרו גם ל-AD2 ולהפרעה אפשרית של מספר מערכות מוליכים עצביים 3,4.
קו העכברושים TgF344-AD שונה למודל AD על ידי ביטוי טרנסג'נים אנושיים של APP ו-PS1ΔE9, מה שמוביל לביטוי Aβ-40 ו-Aβ-42 מסיסים ובלתי מסיסים ולהיווצרות רובד עמילואיד5. הוא גם מציג את הצטברות הצורות ההיפר-פוספוריות של חלבון הטאו המובילות לטאופתיה. מגיל 9-24 חודשים, החולדות מפתחות בהדרגה את סימני ההיכר הפתולוגיים של אלצהיימר ופגיעה קוגניטיבית 5,6,7,8,9.
טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET), טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT) ואוטורדיוגרפיה הן טכניקות המבוססות על פליטה וכימות של קרניים γ. רדיוטראקרים מכמתים את in vivo (PET ו-SPECT) או את ה-ex vivo/in vitro (אוטורדיוגרפיה). טכניקות רגישות אלה תרמו להבנת מנגנונים של מספר מחלות מוח, כגון אלצהיימר. ואכן, במונחים של דלקת עצבית, ישנם מחקרים רבים המעריכים 18 kDa Translocator Protein (TSPO), סמן נוירו-דלקתיות in vivo, עם עוקבים עם תווית רדיו כגון [11C]-(R)-PK11195 או [11C]PBR28 (לסקירה ראו10). בנוסף, שינויים של מערכות נוירוטרנסמיטר נחקרו באמצעות radiotracers 11,12,13.
עם זאת, טכניקות אלה אינן קובעות את המקור התאי של האות הרדיואקטיבי. זה עלול לעכב את הפרשנות של היסודות הביולוגיים של השינוי בכריכה של רדיוליגנד ב-PET/SPECT. לדוגמה, במקרה של מחקרי TSPO של דלקת עצבית, ההבנה אם העלייה או הירידה של TSPO נובעת משינויים אסטרוציטיים או מיקרוגליאליים היא בעלת חשיבות עליונה. טכניקת מיון התאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה לרקמות מטופלות של רדיוליגנד (FACS-RTT) פותחה כדי לעקוף את הבעיות הללו, ומאפשרת הערכה של קשירת רדיוליגנד בכל סוג תא בנפרד וכימות צפיפות חלבון המטרה לכל תא. טכניקה חדשנית זו היא אפוא משלימה ותואמת מאוד להדמיית PET ו-SPECT.
כאן, טכניקה זו יושמה לאורך שני צירים: חקר דלקת עצבית באמצעות רדיוליגנדים ספציפיים ל- TSPO והערכת המערכת הסרוטונרגית. בציר הראשון, המטרה הייתה להבין את המקור התאי של אות ה-TSPO בתגובה לתגובה דלקתית חריפה. לכן, FACS-RTT שימש על רקמות המוח של חולדות לאחר אינדוקציה של דלקת עצבית באמצעות הזרקת lipopolysaccharide (LPS) ובעקבות מחקר הדמיה in vivo [125I]CLINDE SPECT. יתר על כן, אותה הדמיה ופרוטוקול FACS-RTT יושמו על חולדות TgF344-AD בנות 12 ו-24 חודשים וחולדות תואמות מסוג בר (WT). הציר השני נועד לקבוע את מקורם של שינויים במערכת הסרוטונין במודל חולדה זה באמצעות הערכת צפיפות ex vivo 5-HT2AR לפי סוג התא.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVet</td>
			<td>BioVet</td>
			<td></td>
			<td>Software for vitals check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bondclone C18 reverse-phase column</td>
			<td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Des-Sur</td>
			<td>University Hospital of Geneva</td>
			<td></td>
			<td>Virucide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block / anti-CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB550270</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202504</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Knauer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>321312</td>
			<td>24 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ZDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacryvisc</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2160699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore soft tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>F51DA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILabs-Uspect II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Software for SPECT Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Removal Beads II</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-733</td>
			<td>Contains beads and myelin removal buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% Sterile solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>395202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Sheet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0074-10YD</td>
			<td>40 inch width, 80 micron size mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R91150 pr&#233;cursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Concentration column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodide Na125</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tributylin precursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-SPECT Rec2.38c</td>
			<td>MILabs</td>
			<td>Version Rec2.38c</td>
			<td>Software for SPECT images reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USPECT II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Spect Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard 3&#34;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Gamma counter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal

לתאי גליה יש כנראה השלכה ניכרת בפתופיזיולוגיה של הפרעות נוירודגנרטיביות, כגון מחלת אלצהיימר (AD). השינויים שלהם קשורים אולי למצב פרו-דלקתי. זן החולדה TgF344-AD תוכנן לבטא את הגנים האנושיים APP ו-PS1ΔE9 אנושיים, המקודדים עבור חלבוני עמילואיד Aβ-40 ו-Aβ-42 ומציג פתולוגיה של עמילואידים וליקויים קוגניטיביים עם הזדקנות. מודל החולדה TgF344-AD משמש במחקר זה כדי להעריך את המקור התאי של חלבון הטרנסלוקטור 18 kDa (TSPO, סמן להפעלת תאי גליה) הקושר, ואת רמות קולטן הסרוטונין של 5HT2A (5HT2AR) שעלולות להיות מופרעות באלצהיימר. הטכניקה המוצגת כאן היא מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה לרקמות מטופלות רדיוליגנד (FACS-RTT), טכניקה כמותית ספציפית לסוג התא המשלימה לטכניקות אוטורדיוגרפיה של IN vivo PET או SPECT או ex vivo/in vitro . הוא מכמת את אותו עקיבה עם תווית רדיו ששימשה קודם להדמיה, תוך שימוש במונה γ לאחר מיון תאי ציטומטריה. זה מאפשר לקבוע את המקור התאי של החלבון בעל התווית הרדיולית עם ספציפיות תאית גבוהה ורגישות. לדוגמה, מחקרים עם FACS-RTT הראו כי (1) העלייה בקשירת TSPO נקשרה למיקרוגליה במודל חולדה של דלקת עצבית הנגרמת על ידי ליפופוליסכריד (LPS), (ii) עלייה בקשירת TSPO ב-12 ו-18 חודשים נקשרה תחילה לאסטרוציטים, ולאחר מכן למיקרוגליה בחולדות TgF344-AD בהשוואה לחולדות מסוג בר (WT), ו-(iii) צפיפות הסטריאטים של 5HT2A R יורד באסטרוציטים לאחר 18 חודשים באותו מודל AD של חולדה. מעניין, טכניקה זו ניתן להרחיב כמעט לכל radiotracers.

חולדות WT חוו סריקת IN VIVO SPECT עם [125I]CLINDE radiotracer לאחר הזרקת LPS חד-צדדית (איור 2). סריקה זו (תוך שימוש בנתונים מסוכמים מתמונות של 45-60 דקות לאחר הזרקת רדיו-טראקר) הראתה קשירה גבוהה יותר של [125I]CLINDE באתר הזרקת ה-LPS (איור 2A) מאשר באזור הנוגד של המוח (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה-רדיוליגנד ורקמה מטופלת (FACS-RTT) הוא כלי רב עוצמה לחקר תפקידו של חלבון טרנסלוקטור 18 kDa או ביטוי קולטן סרוטונין 5HT2A במחלת אלצהיימר בקנה מידה תאי. פרוטוקול זה מתאר את יישום ex-vivo של FACS-RTT במודל חולדות TgF344-AD.

מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה-רקמה מטופלת רדיוליגנד (FACS-RTT) כדי לקבוע את המקור התאי של אותות רדיואקטיביים

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

פרוטוקול זה משלים להדמיית in vivo. זה מאפשר כימות סוג התא ורמת התא של רדיוטרצרים, שהוא קנה מידה שונה מזה המתקבל in vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הרגישות שלה ואת הרזולוציה התאית שניתנה על ידי שימוש רדיוליגנדים ומיון התאים.הפעל את המצלמה וטען את תוכנת ההפעלה. לחץ על כפתור הבמה Home XYZ כדי לבצע ביות. הגדר את הניסוי המורכב מרכישת סריקה אחת של 10 דקות.הגדר את מצב הצעד לקנס ואת מצב הרכישה ל- Listmode כדי לרשום את כל ספקטרום הפליטה. הגדירו את המיטה וודאו שמערכת החימום, חיישן הנשימה והרדמה מתפקדים ובטוחים. לאחר מכן, הניחו פנטום שבו יוצב ראש החיה.הגדר את אזור הסריקה על-ידי החלקת הסמנים עבור שלושת הממדים בעזרת שלוש התמונות בחלק התחתון של המסך. ודא שנפח הסריקה של הפנטום והחיה זהה. התחל את סריקת הפנטום לכיול הבא עם הפרמטרים שנקבעו בעבר.הקפידו לעבוד בסביבה מתאימה, המאושרת לניסויים המערבים רדיואקטיביות. דגירה של 100 מיקרוגרם של מבשר טריבוטילין ב-100 מיקרוליטרים של חומצה אצטית עם נתרן יודיד וחמישה מיקרוליטרים של 37% חומצה פרקטית ב-70 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות בתרמוציפלר המוצב בתא כפפות. דיללו את התגובה באמצעות 50% אצטוניטריל במים כדי להגיע לנפח של 500 מיקרוליטרים.הזריקו את 500 המיקרוליטרים של התגובה המדוללת לעמודה בעלת פאזה הפוכה. בודד את ה-CLINDE עם HPLC בעל שיפוע ליניארי הפועל מ-5 עד 95% ACN בחומצה זרחתית שבעה מילימולרים למשך 10 דקות. דיללו את הבידוד במים כדי להגיע לנפח סופי של 10 מיליליטרים ואז הזריקו את התגובה המדוללת לעמודת ריכוז.הורידו את ה-CLINDE מהעמודה עם 300 מיקרוליטרים של אתנול מוחלט ואז התאדו את האתנול על ידי דגירה שלו בצנטריפוגת ואקום בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות. דיללו את השאריות המכילות את ה-CLINDE ב-300 מיקרוליטרים של מלחים כדי ליצור תמיסת מלאי. לאחר מדידת הרדיואקטיביות שלו, דיללו את תמיסת המלאי במי מלח כדי לקבל פתרון של 0.037 מגה-באקרל ב-500 מיקרוליטרים.קבעו את עקומות הכיול עם תרכובות ייחוס קרות ופתרו את משוואת הרגרסיה הליניארית:Y שווה ל-AX פלוס B כדי לקבל מקדמי A ו-B. X מייצג את המסה של תרכובת הקור, ו-Y מייצג את השטח שמתחת לעקומות. בדוק את האזור שמתחת לעקומת הרדיוליגנד, מדידת ספיגה אולטרה סגולה ב-450 ננומטר בהתבסס על עקומת הכיול והאזור שמתחת לעקומת הרדיוליגנד.להעריך את המסה ולמדוד את הפעילות של radioligand. ודא שהפעילות הספציפית גדולה מ-1, 000 ג'יגה-באקרל לכל מיקרומול. לחץ על הלחצן עדכן תמונה כדי לעדכן את מיקום החיה.הגדר את אזור הסריקה על-ידי החלקת הסמנים בעזרת שלוש התמונות בחלק התחתון של המסך עבור שלושת הממדים. הגדר את הניסוי בסריקה של 60 דקות המהווה 60 פריימים של דקה אחת. השתמש שוב בכל הפרמטרים האחרים שהוגדרו בתחילה.להזריק 500 microliters של radiotracer רדיואקטיבי ולאחר מכן לשטוף את הצינור עם 300 microliters של סטרילי 0.9% נתרן כלורי. במקביל, לחץ על התחל רכישה כדי להתחיל את הסריקה. פתח את תוכנת שחזור הסריקה ולאחר מכן פתח את מערך הנתונים, חפש את קובץ הפרמטרים של שם הקובץ שנוצר בתיקייה של הסריקה.בחר את האיזוטופ של העניין. שים לב שפרמטר מצב הרשימה מאפשר בחירת איזוטופים מרובים בשלב זה. הגדר את פרמטרי השחזור השונים כגון גודל הווקסל, מספר תת-הקבוצות ואיטרציות כמתואר בכתב היד.בחר את פורמט הפלט כ- NIFTI ולאחר מכן בחר התחל שחזור SPECT. השתמש במרית מתכת שטוחה ובסכין גילוח כדי לנתח את אזורי העניין של המוח. מניחים את הרקמות בצינור צנטריפוגה של שני מיליליטרים ושוקלים את הרקמה המתקבלת.מכניסים את הדגימות לצינור צנטריפוגה של שני מיליליטרים עם מיליליטר אחד של HBSS ללא סידן ומגנזיום ולאחר מכן צנטריפוגה ב-300 פעמים G למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ומסירים את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדורית. הוסיפו 1, 900 מיקרוליטרים של תערובת אנזים אחד ודגירו אותו למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי התססת הצינורות על ידי היפוך כל חמש דקות. הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים שתיים.התסיסו בעדינות עם פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר הלוך ושוב 30 פעמים. לאחר מכן, דגירו את התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי תסיסה של הצינורות על ידי היפוך כל חמש דקות. מערבבים בעדינות קדימה ואחורה עם פיפטה של 200 מיקרוליטר ולאחר מכן פיפטה של 10 מיקרוליטר לפני דוגרים את התערובת במשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את הרקמות.סנן את התאים עם מסננת תאים של 70 מיקרומטר והוסף 10 מיליליטרים של HBSS ללא סידן ומגנזיום. צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant מבלי להפריע את הכדור. לצורך הידלדלות המיאלין, יש לבצע החייאה של הכדור עם 400 מיקרוליטרים של חיץ להסרת מיאלין ולאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטרים של חרוזי הסרת מיאלין לפני הדגירה למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.הוסיפו חמישה מיליליטרים של מאגר להסרת מיאלין וצנטריפוגה 300 פעמים G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מאגר להסרת מיאלין והניחו את הכדורים התלויים בעמודת השדה המגנטי. שטפו את העמוד עם מיליליטר אחד של מאגר להסרת מיאלין ארבע פעמים.צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant מבלי להפריע את הכדור. מערבולת לזמן קצר כדי לנתק את התאים ולהוסיף חמישה מיקרוליטרים של Fc Block CD32. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים ראשוניים בעלי עניין ודגירה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.צנטריפוגה ב 350 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant מבלי להפריע לכדור. מכתימים את הצינורות במהופך על נייר רך. סובבו את הצינור לזמן קצר, ואז הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תערובת הנוגדנים המשנית ודגרו במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.הוסף מיליליטר אחד של חיץ להסרת מיאלין וחזור על הצנטריפוגה. השליכו את ה-supernatant והכתימו את הצינורות במהופך על נייר רך. בצעו שימוש חוזר בתאים ב-250 מיקרוליטרים של PBS סטרילי והמשיכו ישירות למיון תאים.סריקת IN VIVO SPECT של חולדות מסוג בר הראתה קשירת CLINDE גבוהה יותר באתר של הזרקת הליפופליסכריד מאשר באזור הקונטרה-לרוחבי של המוח. דגימות ה-ex vivo שעברו מיון תאים פלואורסצנטי המופעל על ידי רקמות רדיוליגנד, או FACS-RTT, חשפו נוכחות של מספר גבוה יותר של אתרי קישור CLINDE רק במיקרוגליה, והראו כי המקור התאי של אות ה-CLINDE בצד האיפסילטרלי של המוח היה מיקרוגליה. העלייה בחלבון טרנסלוקטור, או קשירת TSPO, בגיל 12 חודשים בחולדות TgF344-AD הוגבלה לאסטרוציטים.בחולדות בנות 24 חודשים נצפתה העלייה בקשירת TSPO עקב שינויים אסטרוציטיים ומיקרוגליאליים כאחד. בחולדות TgF344-AD ישנות יותר, אסטרוציטים סטריאליים הראו ירידה בצפיפות 5HT2AR בהשוואה לסוג הבר. ביטוי יתר בקליפת המוח של TSPO נצפה הן באסטרוציטים והן במיקרוגליה של נבדקי AD בהשוואה לבקרות תואמות גיל כאשר FACS-RTT בוצע על דגימות AD אנושיות לאחר המוות.בעת עבודה עם רדיואקטיביות, בצע את ההוראות של הגנת רדיו וללבוש ציוד הגנה אישי מתאים. לאחר מכן, לאחר ההליך, הקפד לנטרל את סביבת העבודה. כימות חלבונים וניתוח ביטוי גנים יכולים להיעשות בקלות לאחר הליך זה על אוכלוסיות תאים מבודדים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

נוהל אופטימליים עבור Fluorescence המופעל בידוד מיון (FACS) תא של אבות עצביות האוטונומית מאיברים בטן של עכברים עוברית

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

שימוש בcaspase ריבוב Assay לקביעת אפופטוזיס בדגם נייד ההיפותלמוס

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP)

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם לחקר נייד פתופיזיולוגיה בLeukodystrophy הסלולרי Globoid

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

רקמות קרינה הופעלו מיון תאים (FACS) וניתוח ביטוי גנים של נוירונים Fos להביע מ טרי קפוא מוח החולדה

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

התא הראשי תרבות של מטוהרים GABAergic או Glutamatergic נוירונים הוקמה באמצעות מיון תאים פלואורסצנטית מופעל

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...