Name: fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00
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इस काम को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 320030-184713) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक बीबीटी और केसी को वेलक्स फाउंडेशन (परियोजना एन 1123) द्वारा समर्थित किया जाता है। लेखक एसटी को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अर्ली पोस्ट-डॉक मोबिलिटी स्कॉलरशिप, नं। P2GEP3_191446), प्रोफेसर डॉ मैक्स क्लोएटा फाउंडेशन (क्लिनिकल मेडिसिन प्लस छात्रवृत्ति), और जीन और मैडेलीन वाचोक्स फाउंडेशन।

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को जिनेवा के कैंटन के मानव और पशु प्रयोग के लिए नैतिकता समिति, अनुसंधान नैतिकता के लिए कैंटोनल कमीशन (सीसीईआर), और जिनेवा (स्विट्जरलैंड) के कैंटन के स्वास्थ्य की सामान्य दि?...

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	<li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+Alzheimer's+disease+and+other+dementias,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li><li>Kinney, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding.">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer's+disease.">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li></ol>

हमारे ज्ञान के लिए, यह तकनीक एक दृष्टिकोण का वर्णन करने वाली पहली थी जो सेलुलर स्तर पर एक रेडियोट्रेसर के विवो बाध्यकारी परिवर्तनों में बेहतर समझ की अनुमति देती है। प्रोटोकॉल उदाहरण के रूप में [125 आई]...

न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, जैसे अल्जाइमर रोग (एडी), बढ़े हुए लक्षणों से जुड़े न्यूरोनल नुकसान की विशेषता है। एडी, मनोभ्रंश का सबसे आम कारण, 60% -70% मामलों में लेखांकन, दुनिया भर में लगभग 50 मिलियन लोगों को प्रभावित करताहै 1. एक न्यूरोपैथोलॉजिकल स्तर पर, एडी की दो प्रमुख विशेषताएं बाह्य अमाइलॉइड-β (ए) सजीले टुकड़े और इंट्रासेल्युलर ताऊ न्यूरोफिब्रिलरी टैंगल्स का संचय हैं। ग्लियल सेल परिवर्तन भी एडी2 और कई न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम 3,4 के संभावित व्यवधान के साथ जुड़े हुए हैं।
टीजीएफ 344-एडी चूहा लाइन को मानव एपीपी और पीएस 1ई 9 ट्रांसजेनेस को व्यक्त करके एडी मॉडल करने के लिए संशोधित किया गया है, जिससे घुलनशील और अघुलनशील ए -40 और ए -42 अभिव्यक्ति और अमाइलॉइड पट्टिका गठन5 हो जाता है। यह ताऊ प्रोटीन के हाइपरफॉस्फोरिलेटेड रूपों के संचय को भी प्रस्तुत करता है जो टौपैथी के लिए अग्रणी है। 9-24 महीने की उम्र से, चूहों ने उत्तरोत्तर एडी के पैथोलॉजिकल हॉलमार्क और एक संज्ञानात्मक हानि 5,6,7,8,9 विकसित की।
पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), एकल-फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (एसपीईसीटी), और ऑटोरेडियोग्राफी γ किरणों के उत्सर्जन और मात्रा का ठहराव के आधार पर तकनीकें हैं। रेडियोट्रेसर या तो विवो (पीईटी और एसपीईसीटी) या पूर्व विवो / इन विट्रो (ऑटोरेडियोग्राफी) में मात्रा निर्धारित किए जाते हैं। उन संवेदनशील तकनीकों ने एडी जैसे कई मस्तिष्क रोगों के तंत्र की समझ में योगदान दिया है। दरअसल, न्यूरोइन्फ्लेमेशन के संदर्भ में, 18 केडीए ट्रांसलोकेटर प्रोटीन (टीएसपीओ) का आकलन करने वाले बहुत सारे अध्ययन हैं, जो एक इन विवो न्यूरोइन्फ्लेमेशन मार्कर है, जिसमें रेडियोलेबल ट्रेसर्स जैसे [11सी] - (आर) -पीके 111 9 5 या [11सी] पीबीआर 28 (समीक्षा के लिए10 देखें)। इसके अलावा, न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम के परिवर्तन ों का अध्ययन रेडियोट्रेसर 11,12,13 का उपयोग करके किया गया है।
हालांकि, वे तकनीकें रेडियोधर्मी संकेत की सेलुलर उत्पत्ति को निर्धारित नहीं करती हैं। यह पीईटी / एसपीईसीटी में रेडियोलिगैंड के बंधन में परिवर्तन के जैविक आधार की व्याख्या में बाधा डाल सकता है। उदाहरण के लिए, न्यूरोइन्फ्लेमेशन के टीएसपीओ अध्ययनों के मामले में, यह समझना कि क्या टीएसपीओ की वृद्धि या कमी एस्ट्रोसाइटिक या माइक्रोग्लियल परिवर्तनों के कारण है, सर्वोपरि महत्व का है। रेडियोलिगैंड उपचारित ऊतक (एफएसीएस-आरटीटी) तकनीक के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग इन समस्याओं को प्राप्त करने के लिए विकसित की गई थी, जिससे प्रत्येक सेल प्रकार में रेडियोलिगैंड बाइंडिंग का मूल्यांकन अलग से किया जा सकता है और प्रति सेल लक्ष्य-प्रोटीन घनत्व का ठहराव होता है। यह अभिनव तकनीक परिणामस्वरूप पूरक और पीईटी और स्पेक्ट इमेजिंग के साथ अत्यधिक संगत है।
यहां, इस तकनीक को दो अक्षों के साथ लागू किया गया था: टीएसपीओ-विशिष्ट रेडियोलिगैंड्स का उपयोग करके न्यूरोइन्फ्लेमेशन का अध्ययन और सेरोटोनर्जिक सिस्टम का आकलन करना। पहली धुरी पर, उद्देश्य एक तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया के जवाब में टीएसपीओ सिग्नल की सेलुलर उत्पत्ति को समझना था। इसलिए, एफएसीएस-आरटीटी का उपयोग चूहों के मस्तिष्क के ऊतकों पर एक लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) इंजेक्शन के माध्यम से न्यूरोइन्फ्लेमेशन के प्रेरण के बाद और विवो [125आई] क्लिंडे स्पेक्ट इमेजिंग अध्ययन के बाद किया गया था। इसके अलावा, एक ही इमेजिंग और एफएसीएस-आरटीटी प्रोटोकॉल 12- और 24 महीने के टीजीएफ 344-एडी चूहों और जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों से मेल खाने पर लागू किए गए थे। दूसरी धुरी का उद्देश्य सेल प्रकार द्वारा पूर्व विवो 5-एचटी 2 ए आर घनत्व मूल्यांकन के माध्यम से इस चूहे मॉडल में सेरोटोनिनर्जिक सिस्टमपरिवर्तनोंकी उत्पत्ति निर्धारित करना है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVet</td>
			<td>BioVet</td>
			<td></td>
			<td>Software for vitals check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bondclone C18 reverse-phase column</td>
			<td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Des-Sur</td>
			<td>University Hospital of Geneva</td>
			<td></td>
			<td>Virucide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block / anti-CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB550270</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202504</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Knauer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>321312</td>
			<td>24 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ZDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacryvisc</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2160699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore soft tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>F51DA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILabs-Uspect II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Software for SPECT Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Removal Beads II</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-733</td>
			<td>Contains beads and myelin removal buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% Sterile solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>395202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Sheet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0074-10YD</td>
			<td>40 inch width, 80 micron size mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R91150 pr&#233;cursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Concentration column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodide Na125</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tributylin precursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-SPECT Rec2.38c</td>
			<td>MILabs</td>
			<td>Version Rec2.38c</td>
			<td>Software for SPECT images reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USPECT II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Spect Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard 3&#34;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Gamma counter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal

ग्लियल कोशिकाओं में संभवतः न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के पैथोफिजियोलॉजी में काफी निहितार्थ होता है, जैसे कि अल्जाइमर रोग (एडी)। उनके परिवर्तन शायद एक समर्थक भड़काऊ राज्य से जुड़े हुए हैं। टीजीएफ 344-एडी चूहे के तनाव को मानव एपीपी और मानव पीएस 1ई 9 जीन को व्यक्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो अमाइलॉइड प्रोटीन ए -40 और ए -42 के लिए एन्कोडिंग है और उम्र बढ़ने के साथ अमाइलॉइड विकृति और संज्ञानात्मक घाटे को प्रदर्शित करता है। टीजीएफ 344-एडी चूहे मॉडल का उपयोग इस अध्ययन में 18 केडीए ट्रांसलोकेटर प्रोटीन (टीएसपीओ, ग्लियाल सेल सक्रियण का एक मार्कर) बाध्यकारी, और 5 एचटी2 ए-रिसेप्टर (5 एचटी 2एआर) सेरोटोनिन रिसेप्टर स्तर की सेलुलर उत्पत्ति का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है जो संभवतः एडी में बाधित होते हैं। यहां प्रस्तुत तकनीक रेडियोलिगैंड ट्रीटेड टिशू (एफएसीएस-आरटीटी) के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग है, जो विवो पीईटी या एसपीईसीटी या पूर्व विवो / इन विट्रो ऑटोरेडियोग्राफी तकनीकों में पूरक एक मात्रात्मक सेल-प्रकार-विशिष्ट तकनीक है। यह साइटोमेट्री सेल सॉर्टिंग के बाद एक γ काउंटर का उपयोग करके इमेजिंग के लिए पहले इस्तेमाल किए गए एक ही रेडियोलेबल ट्रेसर को मापता है। यह उच्च सेलुलर विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ रेडियोलेबल प्रोटीन की सेलुलर उत्पत्ति का निर्धारण करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, एफएसीएस-आरटीटी के साथ अध्ययन से पता चला है कि (i) टीएसपीओ बाइंडिंग में वृद्धि लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) -प्रेरित न्यूरोइन्फ्लेमेशन के चूहे मॉडल में माइक्रोग्लिया से जुड़ी हुई थी, (ii) 12- और 18-महीनों में टीएसपीओ बाइंडिंग में वृद्धि पहले एस्ट्रोसाइट्स से जुड़ी हुई थी, और फिर जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों की तुलना में टीजीएफ 344-एडी चूहों में माइक्रोग्लिया, और (iii) 5 एचटी2 ए के स्ट्रिएटल घनत्व एक ही चूहे एडी मॉडल में 18 महीने में एस्ट्रोसाइट्स में आर कम हो जाता है। दिलचस्प बात यह है कि इस तकनीक को लगभग सभी रेडियोट्रेसर्स तक बढ़ाया जा सकता है।

डब्ल्यूटी चूहों ने एक एकतरफा एलपीएस इंजेक्शन (चित्रा 2) के बाद [125आई] क्लिंडे रेडियोट्रेसर के साथ विवो स्पेक्ट स्कैन में अनुभव किया। यह स्कैन (45-60 मिनट पोस्ट रेडियोट्रैसर इंजेक्शन की छव...

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Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग-रेडियोलिगैंड उपचारित ऊतक (एफएसीएस-आरटीटी) सेलुलर पैमाने पर अल्जाइमर रोग में 18 केडीए ट्रांसलोकेटर प्रोटीन या सेरोटोनिन 5 एचटी2 ए-रिसेप्टर अभिव्यक्ति की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह प्रोटोकॉल टीजीएफ 344-एडी चूहे मॉडल में एफएसीएस-आरटीटी के पूर्व-विवो आवेदन का वर्णन करता है।

रेडियोधर्मी सिग्नल की सेलुलर उत्पत्ति निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग-रेडियोलिगैंड उपचारित ऊतक (एफएसीएस-आरटीटी)

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

यह प्रोटोकॉल विवो इमेजिंग में पूरक है। यह रेडियोट्रेसर्स के सेल प्रकार और सेलुलर स्तर की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, जो विवो में प्राप्त एक से एक अलग पैमाने पर है। इस तकनीक का मुख्य लाभ इसकी संवेदनशीलता और रेडियोलिगैंड्स और सेल सॉर्टिंग के उपयोग से दिए गए सेलुलर रिज़ॉल्यूशन है।कैमरा चालू करें और ऑपरेटिंग सॉफ़्टवेयर लोड करें। होमिंग करने के लिए होम एक्सवाईजेड स्टेज बटन पर क्लिक करें। एक 10 मिनट के स्कैन अधिग्रहण से बना प्रयोग सेट करें।पूरे उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को रिकॉर्ड करने के लिए चरण मोड को ठीक करने के लिए सेट करें और अधिग्रहण मोड को लिस्टमोड पर सेट करें। बिस्तर सेट करें और सुनिश्चित करें कि वार्मिंग सिस्टम, श्वास सेंसर और संज्ञाहरण कार्यात्मक और सुरक्षित हैं। फिर, एक प्रेत रखें जहां जानवर का सिर तैनात किया जाएगा।स्क्रीन के निचले हिस्से में तीन छवियों की मदद से तीन आयामों के लिए कर्सर को स्लाइड करके स्कैन क्षेत्र सेट करें। सुनिश्चित करें कि प्रेत और जानवर की स्कैन मात्रा समान है। पहले से स्थापित मापदंडों के साथ बाद के अंशांकन के लिए प्रेत स्कैन शुरू करें।एक उपयुक्त वातावरण में काम करना सुनिश्चित करें, रेडियोधर्मिता से जुड़े प्रयोगों के लिए अधिकृत। सोडियम आयोडाइड के साथ एसिटिक एसिड के 100 माइक्रोलीटर में ट्राइब्यूटिलिन अग्रदूत के 100 माइक्रोग्राम सेते हैं और एक दस्ताने बॉक्स में स्थित थर्मोसाइक्लर में 20 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर 37% पैरासिटिक एसिड के पांच माइक्रोलीटर। 500 माइक्रोलीटर की मात्रा तक पहुंचने के लिए पानी में 50% एसिटोनिट्राइल का उपयोग करके प्रतिक्रिया को पतला करें।एक रिवर्स-चरण स्तंभ पर पतला प्रतिक्रिया के 500 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें। 10 मिनट के लिए सात मिलीमोलर फॉस्फोरिक एसिड में 5 से 95% एसीएन से चलने वाले रैखिक-ढाल एचपीएलसी के साथ क्लिंडे को अलग करें। 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए पानी में अलग-थलग पतला करें और फिर एक एकाग्रता स्तंभ पर पतला प्रतिक्रिया इंजेक्ट करें।पूर्ण इथेनॉल के 300 माइक्रोलीटर के साथ कॉलम से क्लिंडे को एल्यूट करें और फिर 40 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज में इसे इनक्यूबेट करके इथेनॉल को वाष्पित करें। स्टॉक समाधान बनाने के लिए खारा के 300 माइक्रोलीटर में क्लिंड युक्त अवशेषों को पतला करें। इसकी रेडियोधर्मिता को मापने के बाद, 500 माइक्रोलीटर में 0.037 मेगाबेक्वरेल का समाधान प्राप्त करने के लिए खारा में स्टॉक समाधान को पतला करें।ठंडे संदर्भ यौगिकों के साथ अंशांकन घटता स्थापित करें और रैखिक प्रतिगमन समीकरण को हल करें: ए और बी गुणांक प्राप्त करने के लिए एएक्स प्लस बी के बराबर वाई। एक्स ठंडे यौगिक के द्रव्यमान का प्रतिनिधित्व करता है, और वाई घटता के तहत क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। रेडियोलिगैंड के वक्र के तहत क्षेत्र की जांच करें, अंशांकन वक्र और रेडियोलिगैंड के वक्र के तहत क्षेत्र के आधार पर 450 नैनोमीटर पर पराबैंगनी अवशोषण को मापें।द्रव्यमान का अनुमान लगाएं और रेडियोलिगैंड की गतिविधि को मापें। सुनिश्चित करें कि विशिष्ट गतिविधि प्रति माइक्रोमोल 1,000 गीगाबेक्करेल से अधिक है। पशु स्थिति को अपडेट करने के लिए छवि अपडेट करें बटन पर क्लिक करें।तीन आयामों के लिए स्क्रीन के निचले हिस्से में तीन छवियों की मदद से कर्सर को स्लाइड करके स्कैन क्षेत्र सेट करें। एक मिनट के 60 फ्रेम का गठन एक 60 मिनट के स्कैन पर प्रयोग सेट करें। प्रारंभ में सेट किए गए अन्य सभी मापदंडों का पुन: उपयोग करें।रेडियोधर्मी रेडियोट्रेसर के 500 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें और फिर बाँझ 0.9% सोडियम क्लोराइड के 300 माइक्रोलीटर के साथ ट्यूब को फ्लश करें। इसके साथ ही, स्कैन शुरू करने के लिए अधिग्रहण शुरू करें पर क्लिक करें। स्कैन पुनर्निर्माण सॉफ़्टवेयर खोलें और फिर डेटासेट खोलें, स्कैन के फ़ोल्डर में बनाई गई फ़ाइल नाम पैरामीटर फ़ाइल की तलाश करें।ब्याज के आइसोटोप का चयन करें। ध्यान दें कि सूची मोड पैरामीटर इस चरण में कई आइसोटोप चयन की अनुमति देता है। पांडुलिपि में वर्णित वोक्सेल आकार, सबसेट की संख्या और पुनरावृत्तियों जैसे विभिन्न पुनर्निर्माण मापदंडों को सेट करें।NIFTI के रूप में आउटपुट स्वरूप का चयन करें और उसके बाद SPECT पुनर्निर्माण प्रारंभ करें का चयन करें। मस्तिष्क के हित के क्षेत्रों को विच्छेदित करने के लिए एक फ्लैट धातु स्पैटुला और एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। ऊतकों को दो मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें और प्राप्त ऊतक का वजन करें।नमूनों को कैल्शियम-और मैग्नीशियम मुक्त एचबीएसएस के एक मिलीलीटर के साथ दो मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखो और फिर कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्रित्र और गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। एंजाइम मिश्रण के 1,900 माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं, जबकि हर पांच मिनट में उलटा द्वारा ट्यूबों को उत्तेजित करते हैं। एंजाइम मिश्रण दो के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें।1,000 माइक्रोलीटर विंदुक के साथ धीरे-धीरे आंदोलन करें और 30 बार आगे और पीछे। फिर, हर पांच मिनट में उलटा करके ट्यूबों को उत्तेजित करते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं। ऊतकों को अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करने से पहले 200-माइक्रोलीटर विंदुक और फिर 10-माइक्रोलीटर विंदुक के साथ धीरे-धीरे आगे और पीछे मिलाएं।70-माइक्रोमीटर सेल स्ट्रेनर के साथ कोशिकाओं को फ़िल्टर करें और कैल्शियम-और मैग्नीशियम मुक्त एचबीएसएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्रित्र और गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। माइलिन की कमी के लिए, माइलिन हटाने बफर के 400 माइक्रोलीटर के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और फिर चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने से पहले माइलिन हटाने के मोतियों के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए माइलिन हटाने बफर और अपकेंद्रित्र 300 बार जी के पांच मिलीलीटर जोड़ें। माइलिन हटाने बफर के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और चुंबकीय क्षेत्र स्तंभ में निलंबित छर्रों जगह है। चार बार माइलिन हटाने बफर के एक मिलीलीटर के साथ कॉलम धोलें।कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्रित्र और गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। भंवर संक्षेप में कोशिकाओं को अलग करने और एफसी ब्लॉक सीडी 32 के पांच माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए। ब्याज के प्राथमिक एंटीबॉडी के मिश्रण के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 350 बार जी पर अपकेंद्रित्र और गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। नरम कागज पर ट्यूबों को उल्टा धब्बा दें। संक्षेप में ट्यूब भंवर, तो माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।माइलिन हटाने बफर के एक मिलीलीटर जोड़ें और सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और नरम कागज पर उल्टा ट्यूबों धब्बा। बाँझ पीबीएस के 250 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सीधे सेल सॉर्टिंग के लिए आगे बढ़ें।जंगली प्रकार के चूहों के इन विवो स्पेक्ट स्कैन ने मस्तिष्क के कॉन्ट्रा-लेटरल क्षेत्र की तुलना में लिपोपॉलीसेकेराइड इंजेक्शन की साइट में क्लिंडे के उच्च बंधन को दिखाया। पूर्व विवो नमूने जो प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग रेडियोलिगैंड-उपचारित ऊतक, या एफएसीएस-आरटीटी से गुजरते थे, ने केवल माइक्रोग्लिया में सीएलआईएनडीई बाध्यकारी साइटों की उच्च संख्या की उपस्थिति का खुलासा किया, यह दर्शाता है कि मस्तिष्क के इप्सिलेटरल पक्ष में क्लिंडे सिग्नल की सेलुलर उत्पत्ति माइक्रोग्लिया थी। टीजीएफ 344-एडी चूहों में 12 महीनों में ट्रांसलोकेटर प्रोटीन, या टीएसपीओ बाध्यकारी में वृद्धि एस्ट्रोसाइट्स तक सीमित थी।24 महीने के चूहों में, एस्ट्रोसाइटिक और माइक्रोग्लियल परिवर्तन दोनों के कारण टीएसपीओ बाध्यकारी में वृद्धि देखी गई थी। पुराने टीजीएफ 344-एडी चूहों में, स्ट्रिएटल एस्ट्रोसाइट्स ने जंगली प्रकार की तुलना में 5 एचटी 2 एआर घनत्व में कमी प्रदर्शित की। टीएसपीओ का एक कॉर्टिकल ओवरएक्सप्रेशन एडी विषयों के एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया दोनों में उम्र-मिलान वाले नियंत्रणों की तुलना में देखा गया था जब एफएसीएस-आरटीटी मानव एडी पोस्टमॉर्टम नमूनों पर किया गया था।रेडियोधर्मिता के साथ काम करते समय, रेडियो-सुरक्षा के निर्देश का पालन करें और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। फिर, प्रक्रिया के बाद, काम के माहौल को विघटित करना सुनिश्चित करें। प्रोटीन मात्रा का ठहराव और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण आसानी से पृथक सेल आबादी पर इस प्रक्रिया के बाद किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

भ्रूण चूहे की आंत अंग से प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) स्वायत तंत्रिका progenitors के अलगाव के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

एक Hypothalamic सेल मॉडल में apoptosis निर्धारित करने के लिए कस्पासे बहुसंकेतन परख का उपयोग

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

माउस मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में टेलोमिरेज गतिविधि: गैर रेडियोधर्मी टेलोमिरेज प्रवर्धन प्रोटोकॉल दोहराएँ (ट्रैप) परख

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Globoid सेल Leukodystrophy में सेलुलर pathophysiology के अध्ययन के लिए मॉडल

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

चूहे के मस्तिष्क ऊतक में जांच करने के लिए छंटनी प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल का उपयोग सेल प्रकार विशिष्ट जीन एक्सप्रेशन

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) और ताजा और जमे हुए चूहा मस्तिष्क के ऊतकों से Fos व्यक्त न्यूरॉन्स की जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

गर्भाशय में Electroporation Neuronal उप-जनसंख्या के excitability और एकल कोशिका कनेक्टिविटी अध्ययन के लिए दृष्टिकोण

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

MALDI इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए चूहा मस्तिष्क के ऊतकों में जांच और gangliosides के दृश्य के लिए दान मैट्रिक्स की उच्च बनाने की क्रिया

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

एक तापमान ढाल परख Drosophila लार्वा के थर्मल वरीयताओं का निर्धारण करने के लिए

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग के माध्यम से स्थापित शुद्घ गैवाजिक या ग्लूटामैटजिक न्यूरॉन्स की प्राथमिक कोशिका संस्कृति

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...