Name: fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica (sovvenzione n. 320030-184713). Gli autori BBT e KC sono sostenuti dalla Fondazione Velux (progetto n. 1123). L'autore ST ha ricevuto il sostegno del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), la Fondazione Prof Dr. Max Cloetta (borsa di studio Clinical Medicine Plus) e la Fondazione Jean e Madeleine Vachoux.

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in accordo con il Comitato etico per la sperimentazione umana e animale del Cantone di Ginevra, la Commissione cantonale per l'etica della ricerca (CCER) e la Direzione generale della salute del Cantone di Ginevra (Svizzera), rispettivamente. I dati sono riportati seguendo le linee guida Animal Research: Reporting In-vivo Experiments (ARRIVE).
1. Preparazione e calibrazione della telecamera SPECT
<ol><li>Accendere la fotocamera, ca...

<ol>
	<li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+Alzheimer's+disease+and+other+dementias,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li><li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer's+disease.">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 4, 575-590 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer's+disease:+Translating+basic+science+into+clinical+practice.">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer's+disease:+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans.">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques,+tau+pathology,+behavioral+impairment,+oligomeric+a&#946;,+and+frank+neuronal+loss.">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric a&#946;, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li><li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+Alzheimer's+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-&#946;+attenuation.">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-&#946; attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li><li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer's+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task.">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).</li><li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer's+disease:+A+preliminary+approach.">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).</li><li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyz&#233;riat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[11C]raclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2/3+receptors.">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346 (2020).</li><li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dopamine+D(2/3)+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+[18F]Fallypride+images.">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li><li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2/3+receptors+with+[18F]Fallypride+images.">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding.">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer's+disease.">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li></ol>

Per quanto ne sappiamo, questa tecnica è stata la prima a descrivere un approccio che consente una migliore comprensione delle alterazioni di legame in vivo di un radiotracciante a livello cellulare. Il protocollo descrive un metodo multiscala per quantificare il legame del radiotracciante a livello cellulare usando [125I]CLINDE (TSPO) o [125I]R91150 (5HT2AR) come esempi.
Questa tecnica è abbastanza robusta e sensibile da rilevare con precisione l'or...

Le malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer (AD), sono caratterizzate da una perdita neuronale associata ad un aumento dei sintomi. L'AD, la causa più comune di demenza, che rappresenta il 60%-70% dei casi, colpisce circa 50 milioni di persone in tutto il mondo1. A livello neuropatologico, le due principali caratteristiche dell'AD sono l'accumulo di placche extracellulari amiloide-β (Aβ) e grovigli neurofibrillari intracellulari Tau. Alterazioni delle cellule gliali sono state anche associate all'AD2 e alla possibile interruzione di diversi sistemi di neurotrasmettitori 3,4.
La linea di ratto TgF344-AD è stata modificata nel modello AD esprimendo transgeni umani APP e PS1ΔE9, portando all'espressione solubile e insolubile di Aβ-40 e Aβ-42 e alla formazione di placche amiloidi5. Presenta anche l'accumulo di forme iperfosforilate della proteina Tau che porta alla tauopatia. Dall'età di 9-24 mesi, i ratti sviluppano progressivamente i segni patologici dell'AD e un deterioramento cognitivo 5,6,7,8,9.
La tomografia ad emissione di positroni (PET), la tomografia computerizzata a emissione di fotoni singoli (SPECT) e l'autoradiografia sono tecniche basate sull'emissione e la quantificazione dei raggi γ. I radiotraccianti sono quantificati in vivo (PET e SPECT) o ex vivo/in vitro (autoradiografia). Queste tecniche sensibili hanno contribuito alla comprensione dei meccanismi di diverse malattie cerebrali, come l'AD. In effetti, in termini di neuroinfiammazione, ci sono molti studi che valutano 18 kDa Translocator Protein (TSPO), un marcatore di neuroinfiammazione in vivo, con traccianti radiomarcati come [11C]-(R)-PK11195 o [11C]PBR28 (per la revisione vedi10). Inoltre, le alterazioni dei sistemi di neurotrasmettitori sono state studiate utilizzando radiotraccianti 11,12,13.
Tuttavia, tali tecniche non determinano l'origine cellulare del segnale radioattivo. Ciò potrebbe ostacolare l'interpretazione delle basi biologiche dell'alterazione del legame di un radioligando in PET/SPECT. Ad esempio, nel caso degli studi TSPO sulla neuroinfiammazione, capire se l'aumento o la diminuzione del TSPO è dovuto a cambiamenti astrocitici o microgliali è di fondamentale importanza. La tecnica FACS-RTT (Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue) è stata sviluppata per aggirare questi problemi, consentendo la valutazione del legame radioligante in ogni tipo di cellula separatamente e la quantificazione della densità della proteina bersaglio per cellula. Questa tecnica innovativa è quindi complementare e altamente compatibile con l'imaging PET e SPECT.
Qui, questa tecnica è stata applicata lungo due assi: lo studio della neuroinfiammazione utilizzando radioligandi TSPO-specifici e la valutazione del sistema serotoninergico. Sul primo asse, l'obiettivo era quello di comprendere l'origine cellulare del segnale TSPO in risposta a una reazione infiammatoria acuta. Pertanto, FACS-RTT è stato utilizzato sui tessuti cerebrali dei ratti dopo l'induzione della neuroinfiammazione tramite iniezione di lipopolisaccaride (LPS) e a seguito di uno studio di imaging in vivo [125I]CLINDE SPECT. Inoltre, lo stesso imaging e lo stesso protocollo FACS-RTT sono stati applicati su ratti TgF344-AD di 12 e 24 mesi e ratti wild-type (WT) corrispondenti. Il secondo asse mirava a determinare l'origine delle alterazioni del sistema serotoninergico in questo modello di ratto tramite la valutazione della densità ex vivo 5-HT2AR per tipo di cellula.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVet</td>
			<td>BioVet</td>
			<td></td>
			<td>Software for vitals check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bondclone C18 reverse-phase column</td>
			<td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Des-Sur</td>
			<td>University Hospital of Geneva</td>
			<td></td>
			<td>Virucide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block / anti-CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB550270</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202504</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Knauer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>321312</td>
			<td>24 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ZDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacryvisc</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2160699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore soft tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>F51DA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILabs-Uspect II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Software for SPECT Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Removal Beads II</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-733</td>
			<td>Contains beads and myelin removal buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% Sterile solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>395202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Sheet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0074-10YD</td>
			<td>40 inch width, 80 micron size mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R91150 pr&#233;cursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Concentration column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodide Na125</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tributylin precursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-SPECT Rec2.38c</td>
			<td>MILabs</td>
			<td>Version Rec2.38c</td>
			<td>Software for SPECT images reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USPECT II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Spect Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard 3&#34;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Gamma counter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal

Le cellule gliali hanno probabilmente una notevole implicazione nella fisiopatologia delle malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer (AD). Le loro alterazioni sono forse associate a uno stato pro-infiammatorio. Il ceppo di ratto TgF344-AD è stato progettato per esprimere i geni umani APP e PS1ΔE9 umani, codificando per le proteine amiloidi Aβ-40 e Aβ-42 e mostra patologia amiloide e deficit cognitivi con l'invecchiamento. Il modello di ratto TgF344-AD viene utilizzato in questo studio per valutare l'origine cellulare del legame della proteina traslocatrice 18 kDa (TSPO, un marcatore di attivazione delle cellule gliali) e dei livelli del recettore della serotonina 5HT2A (5HT2AR) che sono potenzialmente interrotti nell'AD. La tecnica qui presentata è Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), una tecnica quantitativa specifica per tipo cellulare complementare alle tecniche in vivo PET o SPECT o autoradiografia ex vivo / in vitro . Quantifica lo stesso tracciante radiomarcato utilizzato in precedenza per l'imaging, utilizzando un contatore di γ dopo lo smistamento delle cellule citometriche. Ciò consente di determinare l'origine cellulare della proteina radiomarcata con elevata specificità e sensibilità cellulare. Ad esempio, studi con FACS-RTT hanno dimostrato che (i) l'aumento del legame TSPO era associato alla microglia in un modello di ratto di neuroinfiammazione indotta da lipopolisaccaride (LPS), (ii) un aumento del legame TSPO a 12 e 18 mesi è stato associato prima agli astrociti, e poi alla microglia nei ratti TgF344-AD rispetto ai ratti wild type (WT) e (iii) alla densità striatale di 5HT2A R diminuisce negli astrociti a 18 mesi nello stesso modello di AD di ratto. È interessante notare che questa tecnica può essere estesa praticamente a tutti i radiotraccianti.

I ratti WT hanno sperimentato la scansione SPECT in vivo con radiotracciante [125I]CLINDE dopo un'iniezione unilaterale di LPS (Figura 2). Questa scansione (utilizzando dati sommati da immagini di 45-60 minuti dopo l'iniezione di radiotraccianti) ha mostrato un legame più elevato di [125I]CLINDE nel sito dell'iniezione LPS (Figura 2A) rispetto alla regione controlaterale del cervello (Figura 2B). I ca...

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Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) è un potente strumento per studiare il ruolo della proteina traslocatore 18 kDa o dell'espressione del recettore della serotonina 5HT2A nella malattia di Alzheimer su scala cellulare. Questo protocollo descrive l'applicazione ex-vivo di FACS-RTT nel modello di ratto TgF344-AD.

Tessuto trattato con radioligandi attivati da fluorescenza per determinare l'origine cellulare del segnale radioattivo

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

Questo protocollo è complementare all'imaging in vivo. Permette la quantificazione del tipo cellulare e del livello cellulare dei radiotraccianti, che è una scala diversa da quella ottenuta in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua sensibilità e la risoluzione cellulare data dall'uso di radioligandi e dalla cernita cellulare.Accendere la fotocamera e caricare il software operativo. Fare clic sul pulsante Home XYZ stage per eseguire l'homing. Imposta l'esperimento composto da un'acquisizione di scansione di 10 minuti.Impostare la modalità Step su fine e la modalità Acquisition su Listmode per registrare l'intero spettro di emissione. Impostare il letto e assicurarsi che il sistema di riscaldamento, il sensore respiratorio e l'anestesia siano funzionali e sicuri. Quindi, posiziona un fantasma dove verrà posizionata la testa dell'animale.Imposta l'area di scansione facendo scorrere i cursori per le tre dimensioni con l'aiuto delle tre immagini nella parte inferiore dello schermo. Assicurarsi che il volume di scansione del fantasma e dell'animale sia lo stesso. Avviare la scansione fantasma per la successiva calibrazione con i parametri stabiliti in precedenza.Assicurarsi di lavorare in un ambiente appropriato, autorizzato per esperimenti che coinvolgono la radioattività. Incubare 100 microgrammi di precursore della tributilina in 100 microlitri di acido acetico con ioduro di sodio e cinque microlitri di acido paracetico al 37% a 70 gradi Celsius per 20 minuti in un termociclatore posizionato in un vano portaoggetti. Diluire la reazione utilizzando il 50% di acetonitrile in acqua per raggiungere un volume di 500 microlitri.Iniettare i 500 microlitri della reazione diluita su una colonna a fase inversa. Isolare il CLINDE con un HPLC a gradiente lineare eseguito dal 5 al 95% di ACN in acido fosforico a sette millimolari per 10 minuti. Diluire l'isolato in acqua per ottenere un volume finale di 10 millilitri e quindi iniettare la reazione diluita su una colonna di concentrazione.Eluire il CLINDE dalla colonna con 300 microlitri di etanolo assoluto e quindi evaporare l'etanolo incubandolo in una centrifuga sottovuoto a temperatura ambiente per 40 minuti. Diluire il residuo contenente il CLINDE in 300 microlitri di soluzione salina per creare una soluzione madre. Dopo aver misurato la sua radioattività, diluire la soluzione madre in soluzione salina per ottenere una soluzione di 0,037 megabecquerel in 500 microlitri.Stabilire le curve di calibrazione con composti di riferimento freddi e risolvere l'equazione di regressione lineare:Y uguale a AX più B per ottenere i coefficienti A e B. X rappresenta la massa del composto freddo e Y rappresenta l'area sotto le curve. Controllare l'area sotto la curva del radioligand, misurando l'assorbanza ultravioletta a 450 nanometri in base alla curva di calibrazione e l'area sotto la curva del radioligand.Stimare la massa e misurare l'attività del radioligando. Assicurarsi che l'attività specifica sia maggiore di 1.000 gigabecquerel per micromole. Fare clic sul pulsante Aggiorna immagine per aggiornare la posizione dell'animale.Imposta l'area di scansione facendo scorrere i cursori con l'aiuto delle tre immagini nella parte inferiore dello schermo per le tre dimensioni. Imposta l'esperimento su una scansione di 60 minuti che costituisce 60 fotogrammi di un minuto. Riutilizzare tutti gli altri parametri impostati inizialmente.Iniettare 500 microlitri del radiotracciante radioattivo e quindi lavare il tubo con 300 microlitri di cloruro di sodio sterile allo 0,9%. Contemporaneamente, fare clic su Avvia acquisizione per avviare la scansione. Aprire il software di ricostruzione della scansione e quindi aprire il set di dati, cercando il file dei parametri del nome file creato nella cartella della scansione.Selezionare l'isotopo di interesse. Si noti che il parametro list mode consente la selezione di più isotopi in questo passaggio. Imposta i diversi parametri di ricostruzione come la dimensione del voxel, il numero di sottoinsiemi e le iterazioni come descritto nel manoscritto.Selezionare il formato di output come NIFTI e quindi selezionare Avvia ricostruzione SPECT. Usa una spatola metallica piatta e una lama di rasoio per sezionare le regioni di interesse del cervello. Posizionare i tessuti in un tubo di centrifuga da due millilitri e pesare il tessuto ottenuto.Mettere i campioni in un tubo di centrifuga da due millilitri con un millilitro di HBSS privo di calcio e magnesio e quindi centrifugare a 300 volte G per due minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Aggiungere 1.900 microlitri di miscela enzimatica e incubarlo per 15 minuti a 37 gradi Celsius mentre si agitano i tubi per inversione ogni cinque minuti. Aggiungere 30 microlitri di enzima mescolare due.Agitare delicatamente con una pipetta da 1.000 microlitri avanti e indietro 30 volte. Quindi, incubare la miscela per 15 minuti a 37 gradi Celsius mentre si agitano i tubi per inversione ogni cinque minuti. Mescolare delicatamente avanti e indietro con una pipetta da 200 microlitri e poi una pipetta da 10 microlitri prima di incubare la miscela per 10 minuti a 37 gradi Celsius per dissociare i tessuti.Filtrare le cellule con un filtro cellulare da 70 micrometri e aggiungere 10 millilitri di HBSS privo di calcio e magnesio. Centrifugare a 300 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Per l'esaurimento della mielina, risospesciare il pellet con 400 microlitri di tampone per la rimozione della mielina e quindi aggiungere 100 microlitri di perle di rimozione della mielina prima di incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Aggiungere cinque millilitri di tampone per la rimozione della mielina e centrifugare 300 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 500 microlitri di tampone per la rimozione della mielina e posizionare i pellet sospesi nella colonna del campo magnetico. Lavare la colonna con un millilitro di tampone per la rimozione della mielina quattro volte.Centrifugare a 300 volte G per due minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Vortice brevemente per dissociare le cellule e aggiungere cinque microlitri di Fc Block CD32. Aggiungere 100 microlitri del mix di anticorpi primari di interesse e incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius.Centrifugare a 350 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Asciugare i tubi a testa in giù su carta morbida. Ruotare brevemente il tubo, quindi aggiungere 100 microlitri della miscela di anticorpi secondari e incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Aggiungere un millilitro di tampone per la rimozione della mielina e ripetere la centrifugazione. Scartare il surnatante e tamponare i tubi a testa in giù su carta morbida. Risospese le cellule in 250 microlitri di PBS sterile e procedere direttamente allo smistamento cellulare.La scansione SPECT in vivo di ratti selvatici ha mostrato un legame più elevato di CLINDE nel sito di iniezione di lipopolisaccaride rispetto alla regione controlaterale del cervello. I campioni ex vivo sottoposti a tessuto trattato con radioligandi di selezione cellulare attivata a fluorescenza, o FACS-RTT, hanno rivelato la presenza di un numero maggiore di siti di legame CLINDE solo nelle microglia, dimostrando che l'origine cellulare del segnale CLINDE nel lato ipsilaterale del cervello era microglia. L'aumento della proteina traslocatrice, o legame TSPO, a 12 mesi nei ratti TgF344-AD è stato limitato agli astrociti.Nei ratti di 24 mesi, l'aumento del legame TSPO è stato osservato a causa di alterazioni sia astrocitiche che microgliali. Nei ratti TgF344-AD più anziani, gli astrociti striatali hanno mostrato una diminuzione della densità di 5HT2AR rispetto al wild-type. Una sovraespressione corticale di TSPO è stata osservata sia negli astrociti che nelle microglia di soggetti ad AD rispetto ai controlli di pari età quando FACS-RTT è stato eseguito su campioni umani di AD post mortem.Quando si lavora con la radioattività, seguire le istruzioni di radioprotezione e indossare dispositivi di protezione individuale appropriati. Quindi, dopo la procedura, assicurati di decontaminare l'ambiente di lavoro. La quantificazione delle proteine e l'analisi dell'espressione genica possono essere facilmente eseguite dopo questa procedura su popolazioni cellulari isolate.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Una procedura ottimizzata per fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) Isolamento del Sistema Nervoso Autonomo progenitori neurali da organi viscerali di topi fetali

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Ricerca

Neuroscienze

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

L&#39;uso di una caspasi Multiplexing test per determinare apoptosi in un modello cellulare ipotalamica

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

La telomerasi attività nelle varie regioni del cervello di topo: telomerasi non radioattivo Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello per lo Studio della Fisiopatologia Cellulare in Globoid Leucodistrofia cellulare

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Usando fluorescenza cellulare attivo Ordinamento per esaminare Cell-Type-specifica espressione genica nel cervello di ratto tessuto

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated di separazione delle cellule (FACS) e Gene Expression Analisi di Fos-esprimono neuroni da freschi e congelati Rat tessuto cerebrale

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

Elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimazione di DAN Matrix per la rilevazione e visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto Tissue per MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Un'analisi di gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Coltura cellulare primaria di neuroni GABAergici o glutamatergici purificati stabiliti attraverso la selezione di cellule attivate a fluorescenza

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...