Name: fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00
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이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (보조금 번호 320030-184713)의 지원을 받았다. 저자 BBT와 KC는 Velux Foundation (프로젝트 n. 1123)의 지원을 받습니다. 저자 ST는 스위스 국립 과학 재단 (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus 장학금) 교수, Jean and Madeleine Vachoux Foundation.

모든 실험 절차는 제네바 광저우의 인간 및 동물 실험 윤리위원회, 연구 윤리를위한 광저우위원회 (CCER) 및 제네바 광저우 건강 (스위스)의 일반 방향과 각각 합의하여 수행되었습니다. 데이터는 동물 연구: 생체 내 실험(ARRIVE) 지침 보고에 따라 보고됩니다.
1. SPECT 카메라 준비 및 보정
<ol><li>카메라를 켜고 운영 소프트웨어를 로드 합니다(자료 표 참조). <st...

<ol>
	<li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+Alzheimer's+disease+and+other+dementias,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li><li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer's+disease.">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 4, 575-590 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer's+disease:+Translating+basic+science+into+clinical+practice.">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer's+disease:+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans.">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques,+tau+pathology,+behavioral+impairment,+oligomeric+a&#946;,+and+frank+neuronal+loss.">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric a&#946;, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li><li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+Alzheimer's+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-&#946;+attenuation.">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-&#946; attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li><li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer's+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task.">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).</li><li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer's+disease:+A+preliminary+approach.">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).</li><li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyz&#233;riat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[11C]raclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2/3+receptors.">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346 (2020).</li><li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dopamine+D(2/3)+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+[18F]Fallypride+images.">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li><li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2/3+receptors+with+[18F]Fallypride+images.">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding.">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer's+disease.">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li></ol>

우리의 지식에 따르면,이 기술은 세포 수준에서 방사성 추적기의 생체 내 결합 변경에 대한 더 나은 이해를 가능하게하는 접근법을 설명하는 최초의 기술이었습니다. 이 프로토콜은 예로서 [125 I]CLINDE (TSPO) 또는 [125I]R91150 (5HT2AR)을 사용하여 세포 수준에서 방사성 추적자 결합을 정량화하는 다중스케일 방법을 기술한다.
이 기술은 LPS에 의해 유?...

알츠하이머 병 (AD)과 같은 신경 퇴행성 질환은 증상 증가와 관련된 신경 세포 손실을 특징으로합니다. 치매의 가장 흔한 원인 인 AD는 사례의 60 % -70 %를 차지하며 전 세계 약 5 천만 명의 사람들에게 영향을 미칩니다1. 신경 병리학 적 수준에서 AD의 두 가지 주요 특징은 세포 외 아밀로이드 β (Aβ) 플라크와 세포 내 타우 신경 세동 엉킴의 축적입니다. 신경교 세포 변화는 또한 AD2 및 여러 신경 전달 물질 시스템 3,4의 가능한 파괴와 관련이 있습니다.
TgF344-AD 래트 라인은 인간 APP 및 PS1ΔE9 전이유전자를 발현함으로써 AD를 모델로 변형시켜 가용성 및 불용성 Aβ-40 및 Aβ-42 발현 및 아밀로이드 플라크 형성5를 유도하였다. 또한 타우병증으로 이어지는 타우 단백질의 과인산화 형태의 축적을 제시한다. 9-24 개월의 나이부터, 쥐는 점차적으로 AD의 병리학 적 특징과인지 장애 5,6,7,8,9를 개발합니다.
양전자 방출 단층 촬영 (PET), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT) 및 자기 방사선 촬영은 γ선의 방출 및 정량화에 기반한 기술입니다. 방사성 추적기는 생체 내 (PET 및 SPECT) 또는 생체 외 / 시험관 내 (자기 방사선 촬영)에서 정량화됩니다. 이러한 민감한 기술은 AD와 같은 여러 뇌 질환의 메커니즘에 대한 이해에 기여했습니다. 실제로, 신경 염증의 관점에서, [11 C]-(R)-PK11195 또는 [11C]PBR28과 같은 방사성 표지 추적기를 갖는 생체내 신경염증 마커인 18 kDa 트랜스로케이터 단백질 (TSPO)을 평가하는 많은 연구가 있다 (검토를 위해10 참조). 또한, 신경 전달 물질 시스템의 변화는 방사성 추적기11,12,13을 사용하여 연구되었습니다.
그러나, 이러한 기술들은 방사성 신호의 세포 기원을 결정하지 않는다. 이것은 PET/SPECT에서 방사성 리간드의 결합의 변경에 대한 생물학적 토대에 대한 해석을 방해할 수 있다. 예를 들어, 신경 염증에 대한 TSPO 연구의 경우, TSPO의 증가 또는 감소가 성상세포 또는 미세 아교 변화로 인한 것인지 여부를 이해하는 것이 가장 중요합니다. 방사성리간드 처리된 조직으로의 형광-활성화 세포 분류(FACS-RTT) 기술은 이러한 문제를 해결하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 모든 세포 유형에서 방사성리간드 결합을 개별적으로 평가하고 세포당 표적 단백질 밀도를 정량화할 수 있습니다. 이 혁신적인 기술은 결과적으로 보완적이며 PET 및 SPECT 이미징과 매우 호환됩니다.
여기에서이 기술은 TSPO 특이적 방사성 리간드를 사용한 신경 염증 연구와 세로토닌성 시스템을 평가하는 두 축을 따라 적용되었습니다. 첫 번째 축에서, 목표는 급성 염증 반응에 반응하여 TSPO 신호의 세포 기원을 이해하는 것이 었습니다. 따라서, FACS-RTT는 리포폴리사카라이드(LPS) 주사를 통해 신경염증을 유도한 후 생체내 [125I]CLINDE SPECT 이미징 연구를 통해 래트의 뇌 조직에 사용되었다. 또한, 동일한 이미징 및 FACS-RTT 프로토콜이 12개월 및 24개월령의 TgF344-AD 래트 및 매칭된 야생형(WT) 래트에 적용되었다. 두 번째 축은 세포 유형별 생체외 5-HT2A R 밀도 평가를 통해 이러한 래트 모델에서 세로토닌성 시스템 변경의기원을 결정하는 것을 목표로 하였다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVet</td>
			<td>BioVet</td>
			<td></td>
			<td>Software for vitals check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bondclone C18 reverse-phase column</td>
			<td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Des-Sur</td>
			<td>University Hospital of Geneva</td>
			<td></td>
			<td>Virucide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block / anti-CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB550270</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202504</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Knauer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>321312</td>
			<td>24 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ZDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacryvisc</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2160699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore soft tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>F51DA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILabs-Uspect II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Software for SPECT Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Removal Beads II</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-733</td>
			<td>Contains beads and myelin removal buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% Sterile solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>395202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Sheet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0074-10YD</td>
			<td>40 inch width, 80 micron size mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R91150 pr&#233;cursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Concentration column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodide Na125</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tributylin precursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-SPECT Rec2.38c</td>
			<td>MILabs</td>
			<td>Version Rec2.38c</td>
			<td>Software for SPECT images reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USPECT II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Spect Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard 3&#34;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Gamma counter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal

신경교세포는 아마도 알츠하이머병(AD)과 같은 신경퇴행성 장애의 병태생리학에 상당한 영향을 미칠 것이다. 그들의 변화는 아마도 전염증성 상태와 관련이 있습니다. TgF344-AD 래트 균주는 아밀로이드 단백질 Aβ-40 및 Aβ-42를 코딩하는 인간 APP와 인간 PS1ΔE9 유전자를 발현하도록 설계되었으며 노화와 함께 아밀로이드 병리학 및 인지 결핍을 나타낸다. TgF344-AD 래트 모델은 AD에서 교란될 가능성이 있는 18 kDa 트랜스로케이터 단백질 (TSPO, 신경교세포 활성화의 마커) 결합 및 5HT 2A 수용체 (5HT2AR) 세로토닌 수용체 수준의 세포 기원을 평가하기 위해 본 연구에 사용된다. 여기에 제시된 기술은 방사성 리간드 처리 조직에 대한 형광 활성화 세포 분류 (FACS-RTT), 생체 내 PET 또는 SPECT 또는 생체 외 / 시험관 내 자가방사선 촬영 기술과 보완적인 정량적 세포 유형 특이적 기술입니다. 그것은 세포 측정 세포 분류 후 γ 카운터를 사용하여 이미징에 이전에 사용 된 것과 동일한 방사성 표지 추적기를 정량화합니다. 이것은 높은 세포 특이성 및 민감도를 갖는 방사성 표지된 단백질의 세포 기원을 결정할 수 있게 한다. 예를 들어, FACS-RTT를 사용한 연구는 (i) TSPO 결합의 증가가 리포폴리사카라이드(LPS)-유도된 신경염증의 래트 모델에서 미세아교세포와 연관되었고, (ii) 12개월 및 18개월에서의 TSPO 결합의 증가는 성상세포와 먼저 연관되었고, 이어서 야생형(WT) 래트와 비교하여 TgF344-AD 래트에서의 미세아교세포, 및 (iii)5HT2A의 삼중항 밀도와 관련이 있다는 것을 보여주었다. R은 동일한 래트 AD 모델에서 18개월에 성상세포에서 감소한다. 흥미롭게도,이 기술은 거의 모든 방사선 추적기로 확장 될 수 있습니다.

WT 래트는 일방적 LPS 주사 후 [125I]CLINDE 방사성추적기를 사용한 생체내 SPECT 스캔을 경험하였다(도 2). 이 스캔 (방사선 추적기 주사 후 45-60 분의 이미지로부터의 합산 데이터 사용)은 뇌의 대측성 영역에서보다 LPS 주사 부위 (도 2A)에서 [125I]CLINDE의 더 높은 결합을 보였다 (도 2B). FACS-RTT를 시행한 생체외...

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Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

형광-활성화된 세포 분류-방사성리간드 처리된 조직(FACS-RTT)은 알츠하이머병에서 세포 규모로 18kDa 트랜스로케이터 단백질 또는 세로토닌 5HT2A-수용체 발현의 역할을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 TgF344-AD 래트 모델에서 FACS-RTT의 생체외 적용을 기술한다.

형광-활성화된 세포 분류-방사성 신호의 세포 기원을 결정하기 위한 방사성리간드 처리조직(FACS-RTT)

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

이 프로토콜은 생체내 영상화에 상보적이다. 그것은 방사성 추적기의 세포 유형 및 세포 수준 정량화를 허용하며, 이는 생체내에서 얻은 것과 다른 척도입니다. 이 기술의 주요 장점은 방사성 리간드 및 세포 분류의 사용에 의해 주어진 감도 및 세포 분해능이다.카메라를 켜고 운영 소프트웨어를로드하십시오. 홈 XYZ 스테이지 버튼을 클릭하여 호밍을 수행합니다. 하나의 10분 스캔 획득으로 구성된 실험을 설정합니다.스텝 모드를 fine으로 설정하고 획득 모드를 Listmode로 설정하여 전체 방출 스펙트럼을 기록합니다. 침대를 설치하고 온난화 시스템, 호흡 센서 및 마취가 기능적이고 안전한지 확인하십시오. 그런 다음 동물의 머리가 배치 될 팬텀을 놓습니다.화면 하단에 있는 세 개의 이미지를 사용하여 세 차원의 커서를 밀어 스캔 영역을 설정합니다. 팬텀과 동물의 스캔 볼륨이 동일한지 확인하십시오. 이전에 설정된 매개변수로 후속 보정을 위해 팬텀 스캔을 시작합니다.방사능과 관련된 실험을 위해 승인 된 적절한 환경에서 작업하십시오. 100 마이크로리터의 트리부틸린 전구체를 요오드화 나트륨과 37% 파라세틱 산 5마이크로리터와 함께 100 마이크로리터의 트리부틸린 전구체를 섭씨 70도에서 글로브 박스에 위치한 열순환기에서 20분 동안 배양한다. 물에 50% 아세토니트릴을 사용하여 반응을 희석하여 500 마이크로리터의 부피에 도달한다.희석된 반응물 500 마이크로리터를 역상 컬럼에 주입한다. CLINDE를 7밀리몰 인산에서 5 내지 95%ACN으로 10분 동안 선형구배 HPLC로 분리한다. 분리 된 물을 물에 희석하여 10 밀리리터의 최종 부피를 얻은 다음 희석 된 반응을 농축 컬럼에 주입하십시오.컬럼으로부터 CLINDE를 300 마이크로리터의 무수 에탄올로 에루트한 다음, 이를 실온에서 40분 동안 진공 원심분리기에서 인큐베이션하여 에탄올을 증발시킨다. CLINDE를 함유하는 잔류물을 300 마이크로리터의 식염수에 희석하여 원액을 생성한다. 방사능을 측정 한 후 원액을 식염수로 희석하여 500 마이크로 리터의 0.037 메가 베크렐 용액을 얻습니다.콜드 참조 화합물로 보정 곡선을 설정하고 선형 회귀 방정식인 Y를 AX + B와 동일하게 해결하여 A 및 B 계수를 구합니다. X는 차가운 화합물의 질량을 나타내고, Y는 곡선 아래의 면적을 나타낸다. 방사성 리간드의 곡선 아래의 면적을 확인하고, 보정 곡선을 기준으로 450 나노미터에서 자외선 흡광도를 측정하고, 방사성 리간드의 곡선 아래의 면적을 확인한다.질량을 추정하고 방사성 리간드의 활성을 측정한다. 특정 활성이 마이크로 몰 당 1, 000 기가베크렐보다 큰지 확인하십시오. 이미지 업데이트 버튼을 클릭하여 동물 위치를 업데이트하십시오.세 가지 차원에 대한 화면 하단 부분에 있는 세 개의 이미지의 도움으로 커서를 밀어 스캔 영역을 설정합니다. 일분의 60 프레임을 구성하는 60 분 스캔에 실험을 설정하십시오. 처음에 설정된 다른 모든 매개 변수를 다시 사용하십시오.500 마이크로 리터의 방사성 방사성 추적기를 주입 한 다음 300 마이크로 리터의 멸균 된 0.9 % 염화나트륨으로 튜브를 플러시하십시오. 동시에 획득 시작을 클릭하여 스캔을 시작하십시오. 스캔 재구성 소프트웨어를 연 다음 데이터 세트를 열고 스캔 폴더에 생성 된 파일 이름 매개 변수 파일을 찾습니다.관심 있는 동위원소를 선택합니다. 목록 모드 매개변수는 이 단계에서 다중 동위원소 선택을 허용합니다. 원고에 설명된 대로 복셀 크기, 하위 집합 수 및 반복과 같은 다양한 재구성 매개 변수를 설정합니다.출력 형식을 NIFTI로 선택한 다음 SPECT 재구성 시작을 선택합니다. 평평한 금속 주걱과 면도날을 사용하여 뇌의 관심 영역을 해부하십시오. 조직을 두 밀리리터 원심분리 튜브에 넣고 얻은 조직을 칭량합니다.샘플을 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS 한 밀리리터가 있는 두 밀리리터 원심분리 튜브에 넣은 다음, 실온에서 두 분 동안 300배 G에서 원심분리하고 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 1, 900 마이크로리터의 효소를 넣고 1개씩 섞어서 섭씨 37도에서 15분간 배양하면서 5분마다 역전시켜 튜브를 교반시킨다. 30 마이크로 리터의 효소 믹스 두 개를 추가하십시오.1, 000 마이크로리터 피펫으로 30회 앞뒤로 부드럽게 교반하십시오. 이어서, 혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 인큐베이션하면서 5분마다 역전시켜 튜브를 교반시킨다. 200마이크로리터 피펫으로 앞뒤로 부드럽게 혼합한 다음 10마이크로리터 피펫을 가졌고, 혼합물을 섭씨 37도에서 10분 동안 인큐베이션하기 전에 조직을 해리시킨다.세포를 70마이크로미터 세포 스트레이너로 여과하고 10밀리리터의 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS를 첨가하십시오. 실온에서 10분 동안 300배 G에서 원심분리하고 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 미엘린 고갈을 위해, 펠렛을 400 마이크로리터의 미엘린 제거 완충액으로 재현탁시킨 다음, 섭씨 4도에서 15분 동안 인큐베이션하기 전에 미엘린 제거 비드 100 마이크로리터를 첨가한다.미엘린 제거 완충액 다섯 밀리리터를 첨가하고 실온에서 10분 동안 300배 G를 원심분리한다. 500 마이크로 리터의 미엘린 제거 버퍼를 추가하고 부유 한 펠렛을 자기장 컬럼에 넣으십시오. 미엘린 제거 완충액 한 밀리리터로 컬럼을 네 번 세척하십시오.실온에서 두 분 동안 300배 G에서 원심분리하고 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 소용돌이를 잠깐 소용돌이 치면서 세포를 해리시키고 다섯 마이크로 리터의 Fc 블록 CD32를 첨가한다. 관심있는 일차 항체의 혼합물 100 마이크로리터를 첨가하고, 섭씨 네 도에서 20분 동안 인큐베이션한다.섭씨 네 도에서 5분 동안 350배 G에서 원심분리하고 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 튜브를 부드러운 종이에 거꾸로 닦으십시오. 튜브를 간략하게 소용돌이 치고, 100 마이크로리터의 이차 항체 믹스를 첨가하고, 섭씨 4도에서 15분 동안 인큐베이션한다.미엘린 제거 완충액 한 밀리리터를 넣고 원심분리를 반복한다. 상층액을 버리고 튜브를 부드러운 종이에 거꾸로 닦으십시오. 세포를 250 마이크로리터의 멸균 PBS에 재현탁시키고 세포 분류를 직접 진행한다.야생형 래트의 생체내 SPECT 스캔은 뇌의 대측 영역에서보다 리포폴리사카라이드 주사 부위에서 CLINDE의 더 높은 결합을 나타냈다. 방사성리간드 처리 조직 또는 FACS-RTT를 분류하는 형광 활성화 세포 분류를 시행한 생체외 샘플은 미세아교세포에서만 더 많은 수의 CLINDE 결합 부위의 존재를 밝혀냈으며, 이는 뇌의 동측성 측면에서 CLINDE 신호의 세포 기원이 미세아교세포임을 보여준다. TgF344-AD 래트에서 12개월째에 트랜스로케이터 단백질 또는 TSPO 결합의 증가는 성상세포로 제한되었다.24개월령의 래트에서, TSPO 결합의 증가는 성상세포 및 미세아교세포 변화 둘 다로 인해 관찰되었다. 더 오래된 TgF344-AD 래트에서, 줄무늬 성상세포는 야생형과 비교했을 때 감소된 5HT2AR 밀도를 나타냈다. TSPO의 피질 과발현은 인간 AD 사후 샘플에서 FACS-RTT를 수행했을 때 연령 일치 대조군과 비교하여 AD 피험자의 성상세포 및 미세아교세포 둘 다에서 관찰되었다.방사능으로 작업 할 때는 방사선 보호의 지시에 따라 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 그런 다음 절차가 끝나면 작업 환경의 오염을 제거하십시오. 단백질 정량 및 유전자 발현 분석은 분리된 세포 집단에서 이 절차 후에 쉽게 수행할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

태아 쥐의 내장 장기에서 자율 신경 Progenitors의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) 절연을위한 최적화된 절차

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

연구

신경과학

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

시상 하부 세포 모델에서 세포 사멸을 결정하는 카스파 다중 분석의 사용

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

마우스 뇌의 다양한 지역에서 텔로 머라 제 활동 : 비 방사성 텔로 머라 제는 증폭 프로토콜을 반복 (TRAP) 분석

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

<em&gt; 체외</em&gt; Globoid 셀 Leukodystrophy에서 휴대 병태 생리의 연구에 대한 모델

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)와 신선한 및 냉동 쥐 뇌 조직 FOS를 발현하는 신경 세포의 유전자 발현 분석

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

MALDI 이미징 질량 분석에 대한 쥐 뇌 조직에 강글리오사이드의 감지 및 시각화를위한 DAN 매트릭스의 승화

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

초파리 애벌레의 열 환경 설정을 결정 하는 온도 분석 결과

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

형광 활성 세포 선별을 통해 확립 된 정제 GABAergic 또는 Glutamatergic 뉴런의 일차 세포 배양

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...