Name: fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation (tilskudd nr. 320030-184713). Forfatterne BBT og KC støttes av Velux Foundation (prosjekt n. 1123). Forfatter ST fikk støtte fra Swiss National Science Foundation (Early Post-Doc Mobility Scholarship, nei. P2GEP3_191446), Prof Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus stipend), og Jean og Madeleine Vachoux Foundation.

Alle eksperimentelle prosedyrer ble gjennomført i samsvar med etikkkomiteen for menneske- og dyreeksperimentering av henholdsvis Kantonen Genève, Kantonalkommisjonen for forskningsetikk (CCER) og den generelle retningen av helsen til kantonen Genève (Sveits). Data rapporteres etter dyreforskning: Rapportering av retningslinjer for in-vivo-eksperimenter (ARRIVE).
1. SPECT-kameraforberedelse og kalibrering
<ol><li>Slå på kameraet, last inn driftsprogramvaren (se Tabell ov...

<ol>
	<li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+Alzheimer's+disease+and+other+dementias,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li><li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer's+disease.">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 4, 575-590 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer's+disease:+Translating+basic+science+into+clinical+practice.">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer's+disease:+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans.">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques,+tau+pathology,+behavioral+impairment,+oligomeric+a&#946;,+and+frank+neuronal+loss.">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric a&#946;, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li><li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+Alzheimer's+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-&#946;+attenuation.">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-&#946; attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li><li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer's+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task.">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).</li><li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer's+disease:+A+preliminary+approach.">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).</li><li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyz&#233;riat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[11C]raclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2/3+receptors.">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346 (2020).</li><li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dopamine+D(2/3)+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+[18F]Fallypride+images.">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li><li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2/3+receptors+with+[18F]Fallypride+images.">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding.">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer's+disease.">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li></ol>

Så vidt vi vet, var denne teknikken den første til å beskrive en tilnærming som gir en bedre forståelse av in vivo bindende endringer av en radiotracer på cellenivå. Protokollen beskriver en flerskalametode for å kvantifisere radiotracerbinding på cellenivå ved hjelp av [125I]CLINDE (TSPO) eller [125I]R91150 (5HT2AR) som eksempler.
Denne teknikken er robust og følsom nok til å nøyaktig oppdage den cellulære opprinnelsen til et bredt spekt...

Nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom (AD), er preget av et nevronalt tap forbundet med økte symptomer. AD, den vanligste årsaken til demens, som står for 60% -70% av tilfellene, påvirker rundt 50 millioner mennesker over hele verden1. På et nevropatisk nivå er de to viktigste egenskapene til AD akkumulering av ekstracellulære amyloid-β (Aβ) plakk og intracellulære Tau nevrofibrillære tangles. Glial celle endringer har også vært assosiert med AD2 og mulig forstyrrelse av flere nevrotransmitter systemer 3,4.
TgF344-AD rottelinjen er modifisert til modell AD ved å uttrykke human APP og PS1ΔE9 transgenes, noe som fører til løselig og uoppløselig Aβ-40 og Aβ-42 uttrykk og amyloid plakkdannelse5. Det presenterer også akkumulering av hyperfosforrylaterte former for Tau-proteinet som fører til tauopati. Fra en alder av 9-24 måneder utvikler rottene gradvis de patologiske kjennetegnene til AD og en kognitiv svikt 5,6,7,8,9.
Positron Emission Tomography (PET), Single-Photon Emission computed Tomography (SPECT) og autoradiografi er teknikker basert på utslipp og kvantifisering av γ stråler. Radiotracers kvantifiseres enten in vivo (PET og SPECT) eller ex vivo/in vitro (autoradiografi). Disse sensitive teknikkene har bidratt til forståelsen av mekanismer for flere hjernesykdommer, for eksempel AD. Faktisk, når det gjelder nevroinflammasjon, er det mange studier som vurderer 18 kDa translokatorprotein (TSPO), en in vivo neuroinflammation-markør, med radiomerkede sporstoffer som [11C]-(R)-PK11195 eller [11C]PBR28 (for gjennomgang se10). I tillegg er endringer av nevrotransmittersystemer studert ved hjelp av radiotracers 11,12,13.
Disse teknikkene bestemmer imidlertid ikke den cellulære opprinnelsen til det radioaktive signalet. Dette kan hemme tolkningen av de biologiske understøttelsene av endringen i bindingen av en radioligog i PET/SPECT. For eksempel, når det gjelder TSPO-studier av nevroinflammasjon, er det viktig å forstå om økningen eller reduksjonen av TSPO skyldes astrocytiske eller mikrogliale endringer. Fluorescensaktivert cellesortering til radioligandbehandlet vev (FACS-RTT) ble utviklet for å omgå disse problemene, slik at vurderingen av radioligog binding i hver celletype separat og kvantifisering av målproteintetthet per celle. Denne innovative teknikken er følgelig komplementær og svært kompatibel med PET- og SPECT-avbildning.
Her ble denne teknikken brukt langs to akser: studiet av nevroinflammasjon ved hjelp av TSPO-spesifikke radioligander og vurdering av det serotonergiske systemet. På den første aksen var målet å forstå den cellulære opprinnelsen til TSPO-signalet som svar på en akutt inflammatorisk reaksjon. Derfor ble FACS-RTT brukt på hjernevev av rotter etter induksjon av nevroinflammasjon via en lipopolysakkarid (LPS) injeksjon og etter en in vivo [125I]CLINDE SPECT maging studie. Videre ble den samme bilde- og FACS-RTT-protokollen brukt på 12- og 24 måneder gamle TgF344-AD-rotter og matchende villtype (WT) rotter. Den andre aksen hadde som mål å bestemme opprinnelsen til serotoninergiske systemendringer i denne rottemodellen via ex vivo 5-HT2AR tetthetsvurdering etter celletype.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVet</td>
			<td>BioVet</td>
			<td></td>
			<td>Software for vitals check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bondclone C18 reverse-phase column</td>
			<td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Des-Sur</td>
			<td>University Hospital of Geneva</td>
			<td></td>
			<td>Virucide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block / anti-CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB550270</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202504</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Knauer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>321312</td>
			<td>24 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ZDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacryvisc</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2160699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore soft tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>F51DA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILabs-Uspect II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Software for SPECT Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Removal Beads II</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-733</td>
			<td>Contains beads and myelin removal buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% Sterile solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>395202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Sheet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0074-10YD</td>
			<td>40 inch width, 80 micron size mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R91150 pr&#233;cursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Concentration column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodide Na125</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tributylin precursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-SPECT Rec2.38c</td>
			<td>MILabs</td>
			<td>Version Rec2.38c</td>
			<td>Software for SPECT images reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USPECT II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Spect Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard 3&#34;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Gamma counter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal

Glialceller har sannsynligvis en betydelig implikasjon i patofysiologien til nevrodegenerative lidelser, som Alzheimers sykdom (AD). Deres endringer er kanskje forbundet med en proinflammatorisk tilstand. TgF344-AD rottestammen er designet for å uttrykke human APP og menneskelige PS1ΔE9-gener , koding for amyloidproteiner Aβ-40 og Aβ-42 og viser amyloidpatologi og kognitive underskudd med aldring. TgF344-AD rottemodellen brukes i denne studien til å evaluere den cellulære opprinnelsen til 18 kDa translokatorprotein (TSPO, en markør for glial celleaktivering) binding, og 5HT2A-reseptoren (5HT2AR) serotoninreseptornivåer som muligens forstyrres i AD. Teknikken som presenteres her er fluorescensaktivert cellesortering til radioligand behandlet vev (FACS-RTT), en kvantitativ celletypespesifikk teknikk komplementær til in vivo PET eller SPECT eller ex vivo / in vitro autoradiografiteknikker. Den kvantifiserer den samme radiomerkede sporingsenheten som ble brukt før avbildning, ved hjelp av en γ teller etter cytometricellesortering. Dette gjør det mulig å bestemme den cellulære opprinnelsen til det radiomerkede proteinet med høy cellulær spesifisitet og følsomhet. For eksempel viste studier med FACS-RTT at (i) økningen i TSPO-binding var forbundet med mikroglia i en rottemodell av lipopolysakkarid (LPS)-indusert nevroinflammasjon, (ii) en økning i TSPO-binding ved 12- og 18-måneders var først forbundet med astrocytter, og deretter mikroglia hos TgF344-AD-rotter sammenlignet med villtype (WT) rotter, og (iii) den striatale tettheten på 5HT2A R minker i astrocytter ved 18 måneder i samme rotte AD-modell. Interessant nok kan denne teknikken utvides til nesten alle radiotracers.

WT-rotter opplevde in vivo SPECT-skanning med [125I]CLINDE-radiotracer etter en ensidig LPS-injeksjon (figur 2). Denne skanningen (ved hjelp av summerte data fra bilder av 45-60 min post radiotracer injeksjon) viste høyere binding av [125I]CLINDE på stedet for LPS-injeksjonen (figur 2A) enn i hjernens kontralaterale område (figur 2B). Ex vivo-prøvene som gjennomgikk FACS-RTT bekreftet diss...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescensaktivert cellesortering-radioligog behandlet vev (FACS-RTT) er et kraftig verktøy for å studere rollen til 18 kDa translokatorprotein eller Serotonin 5HT2A-reseptoruttrykk i Alzheimers sykdom i cellulær skala. Denne protokollen beskriver ex-vivo-applikasjonen av FACS-RTT i TgF344-AD-rottemodellen.

Fluorescensaktivert cellesortering-radioligog behandlet vev (FACS-RTT) for å bestemme cellulær opprinnelse av radioaktivt signal

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

Denne protokollen er komplementær til in vivo-avbildning. Det tillater celletype og cellulær nivå kvantifisering av radiotracers, som er en annen skala fra den som er oppnådd in vivo. Den største fordelen med denne teknikken er følsomheten og den cellulære oppløsningen gitt ved bruk av radioligands og cellesortering.Slå på kameraet og last inn driftsprogramvaren. Klikk på Home XYZ-sceneknappen for å utføre homing. Sett opp eksperimentet som består av ett 10-minutters skanneanskaffelse.Sett trinnmodusen til fin og anskaffelsesmodus til listmode for å registrere hele utslippsspekteret. Sett opp sengen og sørg for at varmesystemet, pustesensoren og anestesi er funksjonelle og sikre. Plasser deretter et fantom hvor dyrets hode skal plasseres.Angi skanneområdet ved å skyve markørene for de tre dimensjonene ved hjelp av de tre bildene i den nederste delen av skjermen. Forsikre deg om at skannevolumet til fantomet og dyret er det samme. Start fantomskanningen for senere kalibrering med de tidligere etablerte parameterne.Sørg for å arbeide i et passende miljø, autorisert for eksperimenter som involverer radioaktivitet. Inkuber 100 mikrogram sideelvforløper i 100 mikroliter eddiksyre med natriumjodid og fem mikroliter 37% parastisk syre ved 70 grader Celsius i 20 minutter i en termocycler plassert i en hanskeboks. Fortynn reaksjonen ved hjelp av 50% acetonitril i vann for å nå et volum på 500 mikroliter.Injiser de 500 mikroliter av den fortynnede reaksjonen på en omvendt fasekolonne. Isoler CLINDE med en lineær gradient HPLC kjøre fra 5 til 95% ACN i syv millimolar fosforsyre i 10 minutter. Fortynn isolasjonen i vann for å oppnå et sluttvolum på 10 milliliter og injiser deretter den fortynnede reaksjonen på en konsentrasjonskolonne.Elute CLINDE fra kolonnen med 300 mikroliter absolutt etanol og fordamp deretter etanol ved å inkubere det i en vakuum sentrifuge ved romtemperatur i 40 minutter. Fortynn restene som inneholder CLINDE i 300 mikroliter saltvann for å skape en lagerløsning. Etter å ha målt radioaktiviteten, fortynn lagerløsningen i saltvann for å oppnå en løsning på 0,037 megabecquerel i 500 mikroliter.Etablere kalibreringskurvene med kalde referanseforbindelser og løse den lineære regresjonsligningen: Y lik AX pluss B for å oppnå A- og B-koeffisienter. X representerer massen av kald forbindelse, og Y representerer området under kurvene. Kontroller området under kurven på radioligog, måler ultrafiolett absorbans ved 450 nanometer basert på kalibreringskurven og området under kurven til radioliganden.Estimere massen og måle aktiviteten til radioliganden. Sørg for at den spesifikke aktiviteten er større enn 1000 gigabecquerel per mikromole. Klikk på Oppdater bilde-knappen for å oppdatere dyreposisjonen.Angi skanneområdet ved å skyve markørene ved hjelp av de tre bildene i den nederste delen av skjermen for de tre dimensjonene. Sett opp eksperimentet på en 60-minutters skanning som utgjør 60 bilder på ett minutt. Bruk alle andre parametere som er definert til å begynne med, på nytt.Injiser 500 mikroliter av den radioaktive radiotraceren og skyll deretter røret med 300 mikroliter sterilt 0,9% natriumklorid. Samtidig klikker du på Start anskaffelse for å starte skanningen. Åpne programvaren for rekonstruksjon av skanning, og åpne deretter datasettet, og se etter filnavnparameterfilen som er opprettet i mappen til skanningen.Velg interesseisotoper. Vær oppmerksom på at parameteren for listemodus tillater valg av flere isotoper på dette trinnet. Angi de forskjellige rekonstruksjonsparametrene som voxelstørrelse, antall delsett og gjentakelser som beskrevet i manuskriptet.Velg utdataformatet som NIFTI, og velg deretter Start SPECT-rekonstruksjon. Bruk en flat metallspatel og et barberblad for å dissekere hjernens interesseområder. Plasser vevet i et sentrifugerør med to milliliter og vei vevet som er oppnådd.Legg prøvene i et sentrifugerør med to milliliter kalsium- og magnesiumfri HBSS og sentrifuger deretter ved 300 ganger G i to minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Tilsett 1900 mikroliter enzymblanding og inkuber den i 15 minutter ved 37 grader Celsius mens du agiterer rørene ved inversjon hvert femte minutt. Tilsett 30 mikroliter enzymblanding to.Rør forsiktig med en 1000 mikroliterpipette frem og tilbake 30 ganger. Deretter inkuberer du blandingen i 15 minutter ved 37 grader Celsius mens du agiterer rørene ved inversjon hvert femte minutt. Bland forsiktig frem og tilbake med en 200-mikroliter pipette og deretter en 10-mikroliter pipette før du inkuberer blandingen i 10 minutter ved 37 grader Celsius for å fjerne vevet.Filtrer cellene med en 70-mikrometer cellesil og tilsett 10 milliliter kalsium- og magnesiumfri HBSS. Sentrifuger ved 300 ganger G i 10 minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen. For myelintømming, resuspend pellet med 400 mikroliter av myelin fjerning buffer og deretter legge til 100 mikroliter av myelin fjerning perler før inkubering i 15 minutter ved fire grader Celsius.Tilsett fem milliliter myelinfjerningsbuffer og sentrifuger 300 ganger G i 10 minutter ved romtemperatur. Tilsett 500 mikroliter myelinfjerningsbuffer og plasser de suspenderte pelletsene i magnetfeltkolonnen. Vask kolonnen med en milliliter myelinfjerningsbuffer fire ganger.Sentrifuge ved 300 ganger G i to minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Vortex kort for å fjerne cellene og legge til fem mikroliter av Fc Block CD32. Tilsett 100 mikroliter av blandingen av primære antistoffer av interesse og inkuber i 20 minutter ved fire grader Celsius.Sentrifuge ved 350 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Flekk rørene opp ned på mykt papir. Virvel røret kort, legg deretter til 100 mikroliter av den sekundære antistoffblandingen og inkuber i 15 minutter ved fire grader Celsius.Tilsett en milliliter myelinfjerningsbuffer og gjenta sentrifugeringen. Kast supernatanten og flekk rørene opp ned på mykt papir. Resuspend cellene i 250 mikroliter sterile PBS og fortsett direkte til cellesortering.In vivo SPECT-skanningen av villrotter viste høyere binding av CLINDE på stedet for lipopolysakkaridinjeksjonen enn i hjernens kontra-laterale region. Ex vivo-prøvene som gjennomgikk fluorescensaktivert cellesortering av radioligogbehandlet vev, eller FACS-RTT, avslørte tilstedeværelsen av et høyere antall CLINDE-bindingssteder bare i mikroglia, og viste at den cellulære opprinnelsen til CLINDE-signalet i den ipsilaterale siden av hjernen var mikroglia. Økningen i translokatorprotein, eller TSPO-binding, ved 12 måneder hos TgF344-AD rotter var begrenset til astrocytter.I 24 måneder gamle rotter ble økningen i TSPO-binding observert på grunn av både astrocytiske og mikrogliale endringer. Hos eldre TgF344-AD rotter viste striatal astrocytter en redusert tetthet på 5HT2AR sammenlignet med wild-type. En kortikale overekspressjon av TSPO ble observert i både astrocytter og mikroglia av AD-forsøkspersoner sammenlignet med alderstilpassede kontroller da FACS-RTT ble utført på humane AD postmortem-prøver.Når du arbeider med radioaktivitet, følg instruksjonene for radiobeskyttelse og bruk egnet personlig verneutstyr. Deretter, etter prosedyren, sørg for å dekontamineres arbeidsmiljøet. Protein kvantifisering og genuttrykksanalyse kan enkelt gjøres etter denne prosedyren på isolerte cellepopulasjoner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

En Optimalisert Prosedyre for fluorescens-aktivert Cell Sorting (FACS) Isolering av Autonome Neural stamfedre fra Visceral organer Fetal Mus

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Anvendelse av en Caspase Multiplexing-analysen fastslår apoptose i en celle hypothalamus Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase aktivitet i de ulike regionene i Mouse Brain: ikke-radioaktive Telomerase Gjenta Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell for studier av Cellular Patofysiologi i Globoid Cell leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Bruke fluorescensaktivert Cell Sorting å undersøke Cell-Type-Specific genuttrykk i Rat hjernevev

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sortering (FACS) og Gene Expression Analyse av Fos-uttrykker Nerveceller fra fersk og fryst Rat hjernevev

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

I Utero Electroporation Tilnærminger til Studer Excitability av neuronal subpopulasjoner og Single-celle Tilkobling

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

En temperaturgradient analysen å bestemme termisk preferanser Drosophila larver

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primær Cell kultur renset GABAergic eller Glutamatergic neurons etablert gjennom fluorescens-aktivert Cell sortering

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...