Name: fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da Suíça (bolsa nº 320030-184713). Os autores BBT e KC são apoiados pela Fundação Velux (projeto nº 1123). A Author ST recebeu apoio da Fundação Nacional de Ciência suíça (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), a Fundação Prof. Dr. Max Cloetta (bolsa de estudos Clínica Medicine Plus) e a Fundação Jean e Madeleine Vachoux.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Comitê de Ética para Experimentação Humana e Animal do Cantão de Genebra, a Comissão Cantonnal de Ética em Pesquisa (CCER) e a Direção Geral da Saúde do Cantão de Genebra (Suíça), respectivamente. Os dados são relatados seguindo as diretrizes da Animal Research: Reporting In-vivo Experiments (ARRIVE).
1. Preparação e calibração da câmera SPECT
<ol><li>Ligue a câmera, carregue o software operaci...

<ol>
	<li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+Alzheimer's+disease+and+other+dementias,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li><li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer's+disease.">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 4, 575-590 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer's+disease:+Translating+basic+science+into+clinical+practice.">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer's+disease:+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans.">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques,+tau+pathology,+behavioral+impairment,+oligomeric+a&#946;,+and+frank+neuronal+loss.">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric a&#946;, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li><li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+Alzheimer's+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-&#946;+attenuation.">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-&#946; attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li><li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer's+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task.">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).</li><li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer's+disease:+A+preliminary+approach.">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).</li><li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyz&#233;riat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[11C]raclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2/3+receptors.">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346 (2020).</li><li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dopamine+D(2/3)+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+[18F]Fallypride+images.">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li><li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2/3+receptors+with+[18F]Fallypride+images.">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding.">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer's+disease.">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li></ol>

Para nosso conhecimento, essa técnica foi a primeira a descrever uma abordagem que permite uma melhor compreensão das alterações in vivo de ligação de um radiotracer no nível celular. O protocolo descreve um método multiescala para quantificar a ligação radiotracer no nível celular usando [125I]CLINDE (TSPO) ou [125I]R91150 (5HT2AR) como exemplos.
Esta técnica é robusta e sensível o suficiente para detectar precisamente a origem celular d...

Doenças neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer (DA), são caracterizadas por uma perda neuronal associada ao aumento dos sintomas. AD, a causa mais comum de demência, representando 60%-70% dos casos, afeta cerca de 50 milhões de pessoas em todo o mundo1. Em um nível neuropatológico, as duas principais características da DA são o acúmulo de placas extracelulares amilóide-β (Aβ) e emaranhados neurofibrilaris Tau intracelulares. Alterações celulares gliais também foram associadas à AD2 e possível interrupção de vários sistemas neurotransmissores 3,4.
A linha de ratos TgF344-AD foi modificada para modelar AD expressando transgenes humanos APP e PS1ΔE9, levando à expressão solúvel e insolúvel Aβ-40 e Aβ-42 e formação de placa amiloide5. Também apresenta o acúmulo de formas hiperfosforilaladas da proteína Tau que levam à tauopatia. Dos 9 a 24 meses, os ratos desenvolvem progressivamente as características patológicas da DA e um comprometimento cognitivode 5,6,7,8,9.
Tomografia de Emissão de Pósitrons (PET), Tomografia computadorizada de emissão de fótons (SPECT) e autoradiografia são técnicas baseadas na emissão e quantificação de raios γ. Os radiotracers são quantificados tanto in vivo (PET e SPECT) quanto ex vivo/in vitro (autoradiografia). Essas técnicas sensíveis têm contribuído para a compreensão de mecanismos de várias doenças cerebrais, como a DA. De fato, em termos de neuroinflamação, há muitos estudos avaliando 18 kDa Translocator Protein (TSPO), um marcador de neuroinflamação in vivo, com rastreadores radiolabeled como [11C]-(R)-PK11195 ou [11C]PBR28 (para revisão ver10). Além disso, alterações nos sistemas neurotransmissores têm sido estudadas utilizando radiotracers 11,12,13.
No entanto, essas técnicas não determinam a origem celular do sinal radioativo. Isso poderia dificultar a interpretação dos fundamentos biológicos da alteração na vinculação de um radiolig e no PET/SPECT. Por exemplo, no caso de estudos tspo de neuroinflamação, entender se o aumento ou diminuição do TSPO é devido a alterações astróciticas ou microgliais é de suma importância. A técnica de Triagem celular ativada pela Fluorescência para Radioligand Tecido Tratado (FACS-RTT) foi desenvolvida para contornar esses problemas, permitindo a avaliação da radioligência e vinculação em cada tipo de célula separadamente e a quantificação da densidade de proteína-alvo por célula. Esta técnica inovadora é, consequentemente, complementar e altamente compatível com imagens PET e SPECT.
Aqui, essa técnica foi aplicada ao longo de dois eixos: o estudo da neuroinflamação utilizando radioligands específicos do TSPO e avaliação do sistema serotonérgico. No primeiro eixo, o objetivo era compreender a origem celular do sinal TSPO em resposta a uma reação inflamatória aguda. Portanto, o FACS-RTT foi utilizado nos tecidos cerebrais dos ratos após a indução da neuroinflamação por meio de uma injeção de lipopólise (LPS) e após um estudo de imagem in vivo [125I]CLINDE SPECT. Além disso, o mesmo protocolo de imagem e FACS-RTT foram aplicados em ratos TgF344-AD de 12 e 24 meses de idade e ratos do tipo selvagem (WT) correspondentes. O segundo eixo visava determinar a origem das alterações do sistema serotoninérgico neste modelo de rato através da avaliação de densidade ex vivo 5-HT2AR por tipo de célula.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVet</td>
			<td>BioVet</td>
			<td></td>
			<td>Software for vitals check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bondclone C18 reverse-phase column</td>
			<td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Des-Sur</td>
			<td>University Hospital of Geneva</td>
			<td></td>
			<td>Virucide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block / anti-CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB550270</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202504</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Knauer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>321312</td>
			<td>24 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ZDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacryvisc</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2160699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore soft tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>F51DA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILabs-Uspect II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Software for SPECT Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Removal Beads II</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-733</td>
			<td>Contains beads and myelin removal buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% Sterile solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>395202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Sheet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0074-10YD</td>
			<td>40 inch width, 80 micron size mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R91150 pr&#233;cursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Concentration column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodide Na125</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tributylin precursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-SPECT Rec2.38c</td>
			<td>MILabs</td>
			<td>Version Rec2.38c</td>
			<td>Software for SPECT images reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USPECT II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Spect Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard 3&#34;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Gamma counter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal

As células gliais provavelmente têm uma implicação considerável na fisiopatologia de distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer (DA). Suas alterações talvez estejam associadas a um estado pró-inflamatório. A linhagem de ratos TgF344-AD foi projetada para expressar genes humanos app e humanos PS1ΔE9 , codificando proteínas amiloides Aβ-40 e Aβ-42 e exibe patologia amiloide e déficits cognitivos com envelhecimento. O modelo de rato TgF344-AD é usado neste estudo para avaliar a origem celular da ligação de 18 kDa translocator protein (TSPO, um marcador de ativação celular gliana) e os níveis de receptor de serotonina 5HT2A receptor (5HT2AR) que são possivelmente interrompidos em DDA. A técnica aqui apresentada é Fluorescência-Ativada Classificação celular para Radioligand Tecido Tratado (FACS-RTT), uma técnica quantitativa específica do tipo celular complementar às técnicas in vivo PET ou SPECT ou ex vivo/in vitro autoradiography. Ele quantifica o mesmo rastreador radiolabeled usado antes para a imagem, usando um contador de γ após a triagem de células de citometria. Isso permite determinar a origem celular da proteína radiolabeled com alta especificidade celular e sensibilidade. Por exemplo, estudos com FACS-RTT mostraram que (i) o aumento da ligação TSPO estava associado à microglia em um modelo de ratinaide de lipopolysacarídeo (LPS)-induzido neuroinflamação, (ii) um aumento na ligação TSPO em 12 e 18 meses foi associado primeiro com astrócitos, e depois microglia nos ratos TgF344-AD em comparação com ratos do tipo selvagem (WT) e (iii) a densidade estriatal de 5HT2A R diminui em astrócitos aos 18 meses no mesmo modelo de AD de rato. Curiosamente, essa técnica pode ser estendida a praticamente todos os radiotracers.

Ratos WT experimentaram in vivo SPECT scan com [125I]RADIOtracer CLINDE após uma injeção unilateral de LPS (Figura 2). Esta varredura (utilizando dados somados de imagens de 45-60 min de injeção pós-radiotracer) mostrou maior ligação de [125I]CLINDE no local da injeção de LPS (Figura 2A) do que na região contralateral do cérebro (Figura 2B). As amostras ex vivo que foram submetidas...

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Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescência-Ativada Célula-Radioliging tecido tratado (FACS-RTT) é uma ferramenta poderosa para estudar o papel da proteína translocador de 18 kDa ou expressão de receptor de serotonina 5HT2A na doença de Alzheimer em escala celular. Este protocolo descreve a aplicação ex-vivo do FACS-RTT no modelo de rato TgF344-AD.

Fluorescência-Ativada Célula Desarmamento-Radiolige Tecido Tratado (FACS-RTT) para determinar a origem celular do sinal radioativo

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

Este protocolo é complementar à imagem in vivo. Permite quantificação de nível celular e celular de radiotracers, que é uma escala diferente da obtida in vivo. A principal vantagem dessa técnica é sua sensibilidade e a resolução celular dada pelo uso de radioligands e a triagem celular.Ligue a câmera e carregue o software operacional. Clique no botão de palco Home XYZ para executar o homing. Configure o experimento composto por uma aquisição de varredura de 10 minutos.Defina o modo Passo para multar e o modo de aquisição para o Listmode para registrar todo o espectro de emissões. Configure a cama e certifique-se de que o sistema de aquecimento, o sensor de respiração e a anestesia estejam funcionais e seguros. Então, coloque um fantasma onde a cabeça do animal será posicionada.Defina a área de varredura deslizando os cursores para as três dimensões com a ajuda das três imagens na parte inferior da tela. Certifique-se de que o volume de varredura do fantasma e do animal é o mesmo. Inicie a varredura fantasma para calibração subsequente com os parâmetros previamente estabelecidos.Certifique-se de trabalhar em um ambiente adequado, autorizado para experimentos envolvendo radioatividade. Incubar 100 microgramas de tributylin precursor em 100 microliters de ácido acético com iodeto de sódio e cinco microliters de ácido paracético de 37% a 70 graus Celsius por 20 minutos em um termociclador posicionado em um porta-luvas. Diluir a reação usando 50% de acetonitrila na água para atingir um volume de 500 microliters.Injete os 500 microliters da reação diluída em uma coluna de fase inversa. Isole o CLINDE com um HPLC linear de 5 a 95% de ACN em ácido fosfórico de sete milimolares por 10 minutos. Diluir o isolado na água para atingir um volume final de 10 mililitros e, em seguida, injetar a reação diluída em uma coluna de concentração.Elute o CLINDE da coluna com 300 microlitadores de etanol absoluto e, em seguida, evaporar o etanol incubando-o em uma centrífuga de vácuo à temperatura ambiente por 40 minutos. Diluir o resíduo contendo o CLINDE em 300 microlitres de soro fisiológico para criar uma solução de estoque. Após medir sua radioatividade, diluir a solução de estoque em soro fisiológico para obter uma solução de 0,037 megabecquerel em 500 microlitres.Estabeleça as curvas de calibração com compostos de referência fria e resolva a equação de regressão linear:Y igual a AX mais B para obter coeficientes A e B. X representa a massa de composto frio, e Y representa a área sob as curvas. Verifique a área sob a curva do radioligand, medindo a absorção ultravioleta a 450 nanômetros com base na curva de calibração e na área sob a curva do radioligand.Estimar a massa e medir a atividade do radioligand. Certifique-se de que a atividade específica é maior que 1.000 gigabecquerel por micromole. Clique no botão Atualizar imagem para atualizar a posição animal.Defina a área de varredura deslizando os cursores com a ajuda das três imagens na parte inferior da tela para as três dimensões. Configure o experimento em uma varredura de 60 minutos constituindo 60 quadros de um minuto. Reutilize todos os outros parâmetros configurados inicialmente.Injete 500 microliters do radiotracer radioativo e depois lave o tubo com 300 microliters de cloreto de sódio estéril de 0,9%. Simultaneamente, clique em Iniciar a aquisição para iniciar a varredura. Abra o software de reconstrução de varredura e, em seguida, abra o conjunto de dados, procurando o arquivo de parâmetros de nome do arquivo criado na pasta da varredura.Selecione o isótopo de interesse. Observe que o parâmetro do modo de lista permite a seleção de vários isótopos nesta etapa. Defina os diferentes parâmetros de reconstrução, como o tamanho do voxel, número de subconjuntos e iterações como descrito no manuscrito.Selecione o formato de saída como NIFTI e selecione Iniciar a reconstrução do SPECT. Use uma espátula de metal plano e uma lâmina de barbear para dissecar as regiões de interesse do cérebro. Coloque os tecidos em um tubo de centrífuga de dois mililitros e pese o tecido obtido.Coloque as amostras em um tubo de centrífuga de dois mililitros com um mililitro de HBSS sem cálcio e magnésio e, em seguida, centrífuga a 300 vezes G por dois minutos à temperatura ambiente e remova o sobrenatário sem perturbar a pelota. Adicione 1.900 microliters de enzima misture um e incuba-o por 15 minutos a 37 graus Celsius enquanto agita os tubos por inversão a cada cinco minutos. Adicione 30 microliters de enzima mistura dois.Agitar suavemente com uma pipeta de 1.000 microliter para frente e para trás 30 vezes. Em seguida, incubar a mistura por 15 minutos a 37 graus Celsius enquanto agita os tubos por inversão a cada cinco minutos. Misture suavemente para frente e para trás com uma pipeta de 200 microliter e, em seguida, uma pipeta de 10 microliter antes de incubar a mistura por 10 minutos a 37 graus Celsius para dissociar os tecidos.Filtre as células com um coador de células de 70 micrômetros e adicione 10 mililitros de HBSS sem cálcio e magnésio. Centrifugar a 300 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente e remover o supernatante sem perturbar a pelota. Para o esgotamento da mielina, resuspenque a pelota com 400 microliters de tampão de remoção de mielina e adicione 100 microliters de contas de remoção de mielina antes de incubar por 15 minutos a quatro graus Celsius.Adicione cinco mililitros de tampão de remoção de mielina e centrífuga 300 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente. Adicione 500 microliters de tampão de remoção de mielina e coloque as pelotas suspensas na coluna do campo magnético. Lave a coluna com um mililitro de tampão de remoção de mielina quatro vezes.Centrifugar a 300 vezes G por dois minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenatante sem perturbar a pelota. Vórtice brevemente para dissociar as células e adicionar cinco microliters de Fc Block CD32. Adicione 100 microliters da mistura de anticorpos primários de interesse e incubar por 20 minutos a quatro graus Celsius.Centrifugar a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e remover o supernatante sem perturbar a pelota. Borrida os tubos de cabeça para baixo em papel macio. Vortex o tubo brevemente, em seguida, adicione 100 microliters da mistura de anticorpos secundários e incubar por 15 minutos a quatro graus Celsius.Adicione um mililitro de tampão de remoção de mielina e repita a centrifugação. Descarte o supernatante e borre os tubos de cabeça para baixo em papel macio. Resuspenque as células em 250 microliters de PBS estéreis e proceda diretamente à triagem celular.O escaneamento in vivo SPECT de ratos do tipo selvagem mostrou maior ligação de CLINDE no local da injeção de lipopólise do que na região contra-lateral do cérebro. As amostras ex vivo que foram submetidas à fluorescência ativaram tecido radioligand tratado de células, ou FACS-RTT, revelaram a presença de um maior número de sítios de ligação CLINDE apenas em microglia, mostrando que a origem celular do sinal CLINDE no lado ipsilateral do cérebro era microglia. O aumento da proteína translocadora, ou ligação TSPO, aos 12 meses em ratos TgF344-AD foi restrito aos astrócitos.Em ratos de 24 meses de idade, o aumento da ligação TSPO foi observado devido a alterações astróciticas e microgliais. Em ratos TgF344-AD mais antigos, os astrócitos estriais apresentaram uma densidade 5HT2AR reduzida quando comparados com o tipo selvagem. Uma superexpressão cortical de TSPO foi observada tanto em astrócitos quanto em microglia de sujeitos da AD em comparação com controles com correspondência etária quando o FACS-RTT foi realizado em amostras pós-morte humanas.Ao trabalhar com radioatividade, siga a instrução de proteção por rádio e use equipamentos de proteção pessoal adequados. Em seguida, após o procedimento, certifique-se de descontaminar o ambiente de trabalho. A quantificação proteica e a análise da expressão genética podem ser facilmente feitas após este procedimento em populações celulares isoladas.

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JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Um procedimento otimizado para fluorescência-ativado Isolamento classificação celular (FACS) da Autônomo progenitores neurais a partir de vísceras de ratos fetais

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Neurociência

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Utilização de uma caspase Multiplexing ensaio para determinar a apoptose em um modelo de célula hipotalâmica

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescência de células activadas (FACS) e Gene Análise da expressão de Fos-expressando neurônios de fresco e congelado cérebro de um rato Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimação da DAN Matrix para a Detecção e Visualização de gangliosídeos no cérebro de um rato do tecido por MALDI imagem Espectrometria de Massa

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Cultura de células primárias de neurônios Gabaérgicos ou glutamatérgicos purificados estabelecidos através da triagem de células ativadas por fluorescência

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...