Name: fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (subvención nº 320030-184713). Los autores BBT y KC cuentan con el apoyo de la Fundación Velux (proyecto n. 1123). El autor ST recibió el apoyo de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), la Fundación Prof. Dr. Max Cloetta (beca Clinical Medicine Plus) y la Fundación Jean y Madeleine Vachoux.

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con el Comité de Ética para la Experimentación Humana y Animal del Cantón de Ginebra, la Comisión Cantonal de Ética de la Investigación (CCER) y la Dirección General de Salud del Cantón de Ginebra (Suiza), respectivamente. Los datos se informan siguiendo las pautas de Investigación en Animales: Informes de Experimentos In-vivo (ARRIVE).
1. Preparación y calibración de la cámara SPECT
<ol><li>Encienda ...

<ol>
	<li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+Alzheimer's+disease+and+other+dementias,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li><li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer's+disease.">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 4, 575-590 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer's+disease:+Translating+basic+science+into+clinical+practice.">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer's+disease:+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans.">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques,+tau+pathology,+behavioral+impairment,+oligomeric+a&#946;,+and+frank+neuronal+loss.">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric a&#946;, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li><li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+Alzheimer's+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-&#946;+attenuation.">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-&#946; attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li><li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer's+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task.">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).</li><li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer's+disease:+A+preliminary+approach.">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).</li><li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyz&#233;riat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[11C]raclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2/3+receptors.">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346 (2020).</li><li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dopamine+D(2/3)+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+[18F]Fallypride+images.">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li><li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2/3+receptors+with+[18F]Fallypride+images.">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding.">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer's+disease.">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li></ol>

Hasta donde sabemos, esta técnica fue la primera en describir un enfoque que permite una mejor comprensión de las alteraciones de unión in vivo de un radiotrazador a nivel celular. El protocolo describe un método multiescala para cuantificar la unión al radiotrazador a nivel celular utilizando [125I]CLINDE (TSPO) o [125I]R91150 (5HT2AR) como ejemplos.
Esta técnica es lo suficientemente robusta y sensible como para detectar con precisión el orige...

Las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA), se caracterizan por una pérdida neuronal asociada con un aumento de los síntomas. La EA, la causa más común de demencia, que representa el 60%-70% de los casos, afecta a alrededor de 50 millones de personas en todo el mundo1. A nivel neuropatológico, las dos características principales de la EA son la acumulación de placas extracelulares de β amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares intracelulares de Tau. Las alteraciones de las células gliales también se han asociado con la EA2 y la posible interrupción de varios sistemas de neurotransmisores 3,4.
La línea de ratas TgF344-AD ha sido modificada para modelar AD expresando transgenes humanos APP y PS1ΔE9, lo que lleva a la expresión soluble e insoluble de Aβ-40 y Aβ-42 y a la formación de placa amiloide5. También presenta la acumulación de formas hiperfosforiladas de la proteína Tau que conducen a la tauopatía. A partir de los 9-24 meses de edad, las ratas desarrollan progresivamente las señas de identidad patológicas de la EA y un deterioro cognitivo 5,6,7,8,9.
La tomografía por emisión de positrones (PET), la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y la autorradiografía son técnicas basadas en la emisión y cuantificación de rayos γ. Los radiotrazadores se cuantifican in vivo (PET y SPECT) o ex vivo/in vitro (autorradiografía). Esas técnicas sensibles han contribuido a la comprensión de los mecanismos de varias enfermedades cerebrales, como la EA. De hecho, en términos de neuroinflamación, hay muchos estudios que evalúan la proteína translocadora de 18 kDa (TSPO), un marcador de neuroinflamación in vivo, con trazadores radiomarcados como [11C]-(R)-PK11195 o [11C]PBR28 (para revisión ver10). Además, se han estudiado alteraciones de los sistemas de neurotransmisores utilizando radiotrazadores 11,12,13.
Sin embargo, esas técnicas no determinan el origen celular de la señal radiactiva. Esto podría dificultar la interpretación de los fundamentos biológicos de la alteración en la unión de un radioligando en PET/SPECT. Por ejemplo, en el caso de los estudios de neuroinflamación de TSPO, comprender si el aumento o la disminución de TSPO se debe a cambios astrocíticos o microgliales es de suma importancia. La técnica Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) se desarrolló para solucionar estos problemas, permitiendo la evaluación de la unión de radioligando en cada tipo de célula por separado y la cuantificación de la densidad de proteína objetivo por célula. Esta innovadora técnica es, en consecuencia, complementaria y altamente compatible con las imágenes PET y SPECT.
Aquí, esta técnica se aplicó a lo largo de dos ejes: el estudio de la neuroinflamación utilizando radioligandos específicos de TSPO y la evaluación del sistema serotoninérgico. En el primer eje, el objetivo fue comprender el origen celular de la señal TSPO en respuesta a una reacción inflamatoria aguda. Por lo tanto, FACS-RTT se utilizó en los tejidos cerebrales de ratas después de la inducción de la neuroinflamación a través de una inyección de lipopolisacáridos (LPS) y después de un estudio de imágenes IN VIVO [125I]CLINDE SPECT. Además, se aplicaron las mismas imágenes y el protocolo FACS-RTT en ratas TgF344-AD de 12 y 24 meses de edad y ratas de tipo salvaje (WT) coincidentes. El segundo eje tuvo como objetivo determinar el origen de las alteraciones del sistema serotoninérgico en este modelo de rata a través de la evaluación ex vivo de la densidad 5-HT2AR por tipo de célula.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVet</td>
			<td>BioVet</td>
			<td></td>
			<td>Software for vitals check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bondclone C18 reverse-phase column</td>
			<td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Des-Sur</td>
			<td>University Hospital of Geneva</td>
			<td></td>
			<td>Virucide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block / anti-CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB550270</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202504</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Knauer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>321312</td>
			<td>24 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ZDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacryvisc</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2160699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore soft tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>F51DA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILabs-Uspect II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Software for SPECT Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Removal Beads II</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-733</td>
			<td>Contains beads and myelin removal buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% Sterile solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>395202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Sheet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0074-10YD</td>
			<td>40 inch width, 80 micron size mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R91150 pr&#233;cursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Concentration column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodide Na125</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tributylin precursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-SPECT Rec2.38c</td>
			<td>MILabs</td>
			<td>Version Rec2.38c</td>
			<td>Software for SPECT images reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USPECT II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Spect Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard 3&#34;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Gamma counter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal

Las células gliales probablemente tienen una implicación considerable en la fisiopatología de los trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer (EA). Sus alteraciones están quizás asociadas a un estado proinflamatorio. La cepa de rata TgF344-AD ha sido diseñada para expresar los genes humanos APP y PS1ΔE9 humanos, codificando para las proteínas amiloides Aβ-40 y Aβ-42 y muestra patología amiloide y déficits cognitivos con el envejecimiento. El modelo de rata TgF344-AD se utiliza en este estudio para evaluar el origen celular de la unión a la proteína translocadora de 18 kDa (TSPO, un marcador de activación de células gliales) y los niveles del receptor de serotonina 5HT2A (5HT2AR) que posiblemente se interrumpen en la EA. La técnica que aquí se presenta es Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), una técnica cuantitativa específica de tipo celular complementaria a las técnicas in vivo de PET o SPECT o autorradiografía ex vivo/in vitro . Cuantifica el mismo trazador radiomarcado utilizado anteriormente para la obtención de imágenes, utilizando un contador de γ después de la clasificación celular por citometría. Esto permite determinar el origen celular de la proteína radiomarcada con alta especificidad y sensibilidad celular. Por ejemplo, los estudios con FACS-RTT mostraron que (i) el aumento en la unión a TSPO se asoció con microglia en un modelo de rata de neuroinflamación inducida por lipopolisacáridos (LPS), (ii) un aumento en la unión a TSPO a los 12 y 18 meses se asoció con astrocitos primero, y luego microglia en las ratas TgF344-AD en comparación con ratas de tipo salvaje (WT), y (iii) la densidad estriatal de 5HT2A R disminuye en los astrocitos a los 18 meses en el mismo modelo de EA de rata. Curiosamente, esta técnica se puede extender a prácticamente todos los radiotrazadores.

Las ratas WT experimentaron exploración SPECT in vivo con radiotrazador [125I]CLINDE después de una inyección unilateral de LPS (Figura 2). Esta exploración (utilizando datos sumados de imágenes de 45-60 min después de la inyección de radiotrazador) mostró una mayor unión de [125I]CLINDE en el sitio de la inyección de LPS (Figura 2A) que en la región contralateral del cerebro (Figura 2B). La...

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Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) es una poderosa herramienta para estudiar el papel de la proteína translocadora de 18 kDa o la expresión del receptorserotonina 5HT 2A en la enfermedad de Alzheimer a escala celular. Este protocolo describe la aplicación ex-vivo de FACS-RTT en el modelo de rata TgF344-AD.

Clasificación celular activada por fluorescencia-tejido tratado con radioligando (FACS-RTT) para determinar el origen celular de la señal radiactiva

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

Este protocolo es complementario a la imagen in vivo. Permite cuantificar el tipo de célula y el nivel celular de los radiotrazadores, que es una escala diferente a la obtenida in vivo. La principal ventaja de esta técnica es su sensibilidad y la resolución celular dada por el uso de radioligandos y la clasificación celular.Encienda la cámara y cargue el software operativo. Haga clic en el botón Inicio XYZ escenario para realizar la orientación. Configure el experimento compuesto por una adquisición de escaneo de 10 minutos.Establezca el modo Step en Fine y el modo Acquisition en Listmode para registrar todo el espectro de emisión. Configure la cama y asegúrese de que el sistema de calentamiento, el sensor de respiración y la anestesia sean funcionales y seguros. Luego, coloque un fantasma donde se colocará la cabeza del animal.Ajuste el área de escaneo deslizando los cursores para las tres dimensiones con la ayuda de las tres imágenes en la parte inferior de la pantalla. Asegúrese de que el volumen de escaneo del fantasma y el animal sea el mismo. Inicie el escaneo fantasma para su posterior calibración con los parámetros previamente establecidos.Asegurarse de trabajar en un entorno apropiado, autorizado para experimentos que involucren radiactividad. Incubar 100 microgramos de precursor de tributilina en 100 microlitros de ácido acético con yoduro de sodio y cinco microlitros de ácido paracético al 37% a 70 grados centígrados durante 20 minutos en un termociclador colocado en una guantera. Diluir la reacción utilizando 50% de acetonitrilo en agua para alcanzar un volumen de 500 microlitros.Inyecte los 500 microlitros de la reacción diluida en una columna de fase inversa. Aísle el CLINDE con un HPLC de gradiente lineal de 5 a 95% ACN en ácido fosfórico siete milimolares durante 10 minutos. Diluya el aislado en agua para alcanzar un volumen final de 10 mililitros y luego inyecte la reacción diluida en una columna de concentración.Eluya el CLINDE de la columna con 300 microlitros de etanol absoluto y luego evapore el etanol incubándolo en una centrífuga al vacío a temperatura ambiente durante 40 minutos. Diluya el residuo que contiene el CLINDE en 300 microlitros de solución salina para crear una solución madre. Después de medir su radiactividad, diluir la solución madre en solución salina para obtener una solución de 0.037 megabecquerel en 500 microlitros.Establecer las curvas de calibración con compuestos de referencia fríos y resolver la ecuación de regresión lineal:Y igual a AX más B para obtener coeficientes A y B. X representa la masa del compuesto frío, e Y representa el área bajo las curvas. Compruebe el área bajo la curva del radioligando, midiendo la absorbancia ultravioleta a 450 nanómetros en función de la curva de calibración y el área bajo la curva del radioligando.Estimar la masa y medir la actividad del radioligando. Asegurar que la actividad específica sea superior a 1.000 gigabecquerel por micromol. Haga clic en el botón Actualizar imagen para actualizar la posición del animal.Ajuste el área de escaneo deslizando los cursores con la ayuda de las tres imágenes en la parte inferior de la pantalla para las tres dimensiones. Configure el experimento en un escaneo de 60 minutos que constituye 60 cuadros de un minuto. Reutilice todos los demás parámetros configurados inicialmente.Inyecte 500 microlitros del radiotrazador radiactivo y luego enjuague el tubo con 300 microlitros de cloruro de sodio estéril al 0,9%. Simultáneamente, haga clic en Iniciar adquisición para iniciar el escaneo. Abra el software de reconstrucción de escaneo y luego abra el conjunto de datos, buscando el archivo de parámetros de nombre de archivo creado en la carpeta del escaneo.Seleccione el isótopo de interés. Tenga en cuenta que el parámetro de modo de lista permite la selección de varios isótopos en este paso. Establezca los diferentes parámetros de reconstrucción, como el tamaño del vóxel, el número de subconjuntos y las iteraciones como se describe en el manuscrito.Seleccione el formato de salida como NIFTI y, a continuación, seleccione Iniciar reconstrucción SPECT. Use una espátula de metal plana y una cuchilla de afeitar para diseccionar las regiones de interés del cerebro. Coloque los tejidos en un tubo centrífugo de dos mililitros y pese el tejido obtenido.Coloque las muestras en un tubo de centrífuga de dos mililitros con un mililitro de HBSS libre de calcio y magnesio y luego centrífuga a 300 veces G durante dos minutos a temperatura ambiente y retire el sobrenadante sin molestar el pellet. Agregue 1, 900 microlitros de mezcla de enzimas y incube durante 15 minutos a 37 grados centígrados mientras agita los tubos por inversión cada cinco minutos. Añadir 30 microlitros de enzima mezclar dos.Agitar suavemente con una pipeta de 1.000 microlitros hacia adelante y hacia atrás 30 veces. Luego, incuba la mezcla durante 15 minutos a 37 grados centígrados mientras agitas los tubos por inversión cada cinco minutos. Mezcle suavemente hacia adelante y hacia atrás con una pipeta de 200 microlitros y luego una pipeta de 10 microlitros antes de incubar la mezcla durante 10 minutos a 37 grados Celsius para disociar los tejidos.Filtre las células con un colador celular de 70 micrómetros y agregue 10 mililitros de HBSS libre de calcio y magnesio. Centrifugar a 300 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet. Para el agotamiento de la mielina, vuelva a suspender el pellet con 400 microlitros de tampón de eliminación de mielina y luego agregue 100 microlitros de perlas de eliminación de mielina antes de incubar durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Agregue cinco mililitros de tampón de eliminación de mielina y centrífuga 300 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Agregue 500 microlitros de tampón de eliminación de mielina y coloque los gránulos suspendidos en la columna de campo magnético. Lave la columna con un mililitro de tampón de eliminación de mielina cuatro veces.Centrifugar a 300 veces G durante dos minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet. Vórtice brevemente para disociar las células y añadir cinco microlitros de Fc Block CD32. Añadir 100 microlitros de la mezcla de anticuerpos primarios de interés e incubar durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.Centrifugar a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet. Seque los tubos boca abajo en papel blando. Vórtice el tubo brevemente, luego agregue 100 microlitros de la mezcla secundaria de anticuerpos e incube durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Agregue un mililitro de tampón de eliminación de mielina y repita la centrifugación. Deseche el sobrenadante y seque los tubos boca abajo en papel blando. Resuspend las células en 250 microlitros de PBS estéril y proceda directamente a la clasificación celular.La exploración SPECT in vivo de ratas de tipo salvaje mostró una mayor unión de CLINDE en el sitio de la inyección de lipopolisacáridos que en la región contralateral del cerebro. Las muestras ex vivo que se sometieron a fluorescencia activaron células de clasificación de tejido tratado con radioligando, o FACS-RTT, revelaron la presencia de un mayor número de sitios de unión a CLINDE solo en microglia, lo que demuestra que el origen celular de la señal clinde en el lado ipsilateral del cerebro era microglia. El aumento de la proteína translocadora, o unión a TSPO, a los 12 meses en ratas TgF344-AD se restringió a los astrocitos.En ratas de 24 meses de edad, se observó un aumento en la unión a TSPO debido a alteraciones astrocíticas y microgliales. En ratas TgF344-AD más viejas, los astrocitos estriatales mostraron una densidad disminuida de 5HT2AR en comparación con el tipo salvaje. Se observó una sobreexpresión cortical de TSPO tanto en astrocitos como en microglía de sujetos con EA en comparación con los controles de la misma edad cuando se realizó FACS-RTT en muestras humanas de EA postmortem.Cuando trabaje con radiactividad, siga las instrucciones de protección por radio y use el equipo de protección personal adecuado. Luego, después del procedimiento, asegúrese de descontaminar el entorno de trabajo. La cuantificación de proteínas y el análisis de expresión génica se pueden realizar fácilmente después de este procedimiento en poblaciones celulares aisladas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Un procedimiento optimizado para el activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) El aislamiento de progenitores neurales autónomas de los órganos viscerales de los fetos de ratones

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Investigación

Neurociencias

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

El uso de una Multiplexación Ensayo de la caspasa para determinar la apoptosis en un modelo de célula hipotalámica

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Actividad telomerasa en las diversas regiones del cerebro de ratón: La telomerasa no radiactivo Repetir Protocolo de Amplificación (TRAP) Ensayo

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

La fluorescencia de células activadas (FACS) y análisis de expresión génica de las neuronas que expresan Fos-Fresco y de tejido congelado de cerebro de rata

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimación de DAN Matriz para la detección y visualización de gangliósidos en el tejido cerebral de la rata por MALDI Imaging Espectrometría de Masas

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Un análisis de gradiente de temperatura para determinar las preferencias térmicas de larvas de Drosophila

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Cultura celular primaria de las neuronas purificadas GABAérgicas o glutamatérgicas establecidas a través de la clasificación celular activada por fluorescencia

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...