Name: fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe no. 320030-184713). Yazarlar BBT ve KC, Velux Vakfı tarafından desteklenmektedir (proje n. 1123). Yazar ST, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'ndan destek aldı (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), Prof. Dr. Max Cloetta Vakfı (Klinik Tıp Plus bursu) ve Jean ve Madeleine Vachoux Vakfı.

Tüm deneysel prosedürler, sırasıyla Cenevre Kantonu İnsan ve Hayvan Deneyleri Etik Komitesi, Kanton Araştırma Etiği Komisyonu (CCER) ve Cenevre Kantonu Sağlığının Genel Yönü (İsviçre) ile mutabık kalınarak yürütülmüştür. Veriler, Hayvan Araştırması: In-vivo Deneylerin Raporlanması (ARRIVE) yönergelerini izleyerek bildirilmiştir.
1. SPECT kamera hazırlığı ve kalibrasyonu
<ol><li>Fotoğraf makinesini açın, işletim yazılımını yükleyin ...

<ol>
	<li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+Alzheimer's+disease+and+other+dementias,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li><li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer's+disease.">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 4, 575-590 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer's+disease:+Translating+basic+science+into+clinical+practice.">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li><li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer's+disease:+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans.">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques,+tau+pathology,+behavioral+impairment,+oligomeric+a&#946;,+and+frank+neuronal+loss.">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric a&#946;, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li><li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+Alzheimer's+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-&#946;+attenuation.">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-&#946; attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li><li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer's+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task.">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).</li><li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer's+disease:+A+preliminary+approach.">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer's+disease.">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).</li><li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyz&#233;riat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[11C]raclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2/3+receptors.">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346 (2020).</li><li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dopamine+D(2/3)+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+[18F]Fallypride+images.">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li><li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2/3+receptors+with+[18F]Fallypride+images.">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li><li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue.">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding.">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li><li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer's+disease.">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li></ol>

Bildiğimiz kadarıyla, bu teknik, hücresel düzeyde bir radyotracer'in in vivo bağlanma değişikliklerinin daha iyi anlaşılmasını sağlayan bir yaklaşımı tanımlayan ilk tekniktir. Protokol, örnek olarak [125 I]CLINDE (TSPO) veya [125 I]R91150(5HT 2AR) kullanarak hücresel düzeyde radyotracer bağlanmasını ölçmek için çok ölçeklibiryöntemi açıklar.
Bu teknik, LPS tarafından indüklenen yoğun bir enflamatuar reaksiyondan, AD'ni...

Alzheimer Hastalığı (AD) gibi nörodejeneratif hastalıklar, artan semptomlarla ilişkili nöronal bir kayıp ile karakterizedir. Demansın en sık nedeni olan ve vakaların %60-%70'ini oluşturan AD, dünya çapında yaklaşık 50 milyon insanı etkilemektedir1. Nöropatolojik düzeyde, AH'nin iki ana özelliği, hücre dışı amiloid-β (Aβ) plaklarının ve hücre içi Tau nörofibriler yumakların birikmesidir. Glial hücre değişiklikleri ayrıca AD2 ve çeşitli nörotransmitter sistemlerin olası bozulması ile ilişkilendirilmiştir 3,4.
TgF344-AD sıçan hattı, insan APP ve PS1 ΔE9 transgenlerini eksprese ederekAD'yi modellemek için modifiye edilmiştir, bu da çözünür ve çözünmez Aβ-40 ve Aβ-42 ekspresyonuna ve amiloid plak oluşumuna yol açmıştır5. Aynı zamanda Tau proteininin hiperfosforile formlarının birikmesini ve tauopatiye yol açmasını sağlar. 9-24 aylıktan itibaren, sıçanlar giderek AD'nin patolojik özelliklerini ve bilişsel bir bozukluk 5,6,7,8,9'u geliştirir.
Pozitron Emisyon Tomografisi (PET), Tek Foton Emisyon bilgisayarlı Tomografi (SPECT) ve otoradyografi, γ ışınlarının emisyonuna ve nicelleştirilmesine dayanan tekniklerdir. Radyotracerler in vivo (PET ve SPECT) veya ex vivo/in vitro (otoradyografi) olarak ölçülür. Bu hassas teknikler, AD gibi çeşitli beyin hastalıklarının mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunmuştur. Gerçekten de, nöroinflamasyon açısından, bir in vivo nöroinflamasyon belirteci olan 18 kDa Translokatör Proteinini (TSPO), [11 C]-(R)-PK11195 veya [11 C] PBR28 gibi radyoaktif etiketli izleyicilerle değerlendiren birçok çalışma vardır (gözden geçirme için bkz.10). Ek olarak, nörotransmitter sistemlerinin değişiklikleri radyotracer11,12,13 kullanılarak incelenmiştir.
Bununla birlikte, bu teknikler radyoaktif sinyalin hücresel kökenini belirlemez. Bu, PET / SPECT'de bir radyoligandın bağlanmasındaki değişikliğin biyolojik temellerinin yorumlanmasını engelleyebilir. Örneğin, TSPO'nun nöroinflamasyon çalışmaları söz konusu olduğunda, TSPO'nun artmasının veya azalmasının astrositik veya mikroglial değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını anlamak çok önemlidir. Radyoligand ile Tedavi Edilen Dokuya Floresan Aktive Hücre Sıralama (FACS-RTT) tekniği, bu sorunların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir ve her hücre tipinde radyoligand bağlanmasının ayrı ayrı değerlendirilmesine ve hücre başına hedef-protein yoğunluğunun miktarına izin verir. Bu yenilikçi teknik sonuç olarak tamamlayıcıdır ve PET ve SPECT görüntüleme ile son derece uyumludur.
Burada, bu teknik iki eksen boyunca uygulandı: TSPO'ya özgü radyoligandlar kullanılarak nöroinflamasyonun incelenmesi ve serotonerjik sistemin değerlendirilmesi. İlk eksende amaç, akut inflamatuar reaksiyona yanıt olarak TSPO sinyalinin hücresel kökenini anlamaktı. Bu nedenle, FACS-RTT, bir lipopolisakkarit (LPS) enjeksiyonu yoluyla nöroinflamasyonun indüklenmesinden sonra ve in vivo [125I] CLINDE SPECT görüntüleme çalışmasının ardından sıçanların beyin dokularında kullanılmıştır. Ayrıca, aynı görüntüleme ve FACS-RTT protokolü 12 ve 24 aylık TgF344-AD sıçanlarına ve eşleşen vahşi tip (WT) sıçanlara uygulandı. İkinci eksen, bu sıçan modelindeki serotoninerjik sistem değişikliklerinin kökenini, hücre tipine göre ex vivo 5-HT2A Ryoğunluk değerlendirmesi yoluyla belirlemeyi amaçlamıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioVet</td>
			<td>BioVet</td>
			<td></td>
			<td>Software for vitals check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bondclone C18 reverse-phase column</td>
			<td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Des-Sur</td>
			<td>University Hospital of Geneva</td>
			<td></td>
			<td>Virucide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block / anti-CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BDB550270</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-rat CD90</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202504</td>
			<td>Reactivity for rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Knauer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>321312</td>
			<td>24 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>ZDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacryvisc</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2160699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore soft tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>F51DA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILabs-Uspect II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Software for SPECT Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Removal Beads II</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-733</td>
			<td>Contains beads and myelin removal buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% Sterile solution</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>395202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td>Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Sheet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0074-10YD</td>
			<td>40 inch width, 80 micron size mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R91150 pr&#233;cursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak C18 Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>Concentration column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium iodide Na125</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tributylin precursor</td>
			<td>CERMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-SPECT Rec2.38c</td>
			<td>MILabs</td>
			<td>Version Rec2.38c</td>
			<td>Software for SPECT images reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USPECT II</td>
			<td>MILabs</td>
			<td></td>
			<td>Spect Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard 3&#34;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Gamma counter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-activated cell sorting-radioligand treated tissue (facs-rtt) to determine the cellular origin of radioactive signal

Glial hücreler muhtemelen Alzheimer hastalığı (AD) gibi nörodejeneratif bozuklukların patofizyolojisinde önemli bir etkiye sahiptir. Değişiklikleri belki de pro-inflamatuar bir durumla ilişkilidir. TgF344-AD sıçan suşu, insan APP ve insan PS1ΔE9 genlerini ifade etmek, amiloid proteinleri Aβ-40 ve Aβ-42'yi kodlamak ve yaşlanma ile birlikte amiloid patolojisini ve bilişsel eksiklikleri göstermek için tasarlanmıştır. Bu çalışmada TgF344-AD sıçan modeli, 18 kDa translokatör proteininin (TSPO, glial hücre aktivasyonunun bir belirteci) bağlanmasının hücresel kökenini ve AD'de muhtemelen bozulmuş olan 5HT2A-reseptörü (5HT2AR) serotonin reseptör seviyelerini değerlendirmek için kullanılmıştır. Burada sunulan teknik, in vivo PET veya SPECT veya ex vivo / in vitro otoradyografi tekniklerini tamamlayan kantitatif hücre tipine özgü bir teknik olan Radyoligand ile Tedavi Edilen Dokuya Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS-RTT) 'dir. Sitometri hücre sıralamadan sonra bir γ sayacı kullanarak, görüntüleme için daha önce kullanılan aynı radyoaktif etiketli izleyiciyi ölçer. Bu, radyoaktif etiketli proteinin hücresel kökeninin yüksek hücresel özgüllük ve hassasiyetle belirlenmesini sağlar. Örneğin, FACS-RTT ile yapılan çalışmalar, (i) TSPO bağlanmasındaki artışın, lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı nöroinflamasyonun bir sıçan modelinde mikroglia ile ilişkili olduğunu, (ii) 12 ve 18 aylarda TSPO bağlanmasındaki bir artışın önce astrositlerle ilişkili olduğunu ve daha sonra TgF344-AD sıçanlarında vahşi tip (WT) sıçanlara kıyasla mikroglia ve (iii) 5HT2A'nın striatal yoğunluğunun ilişkili olduğunu göstermiştir. R, aynı sıçan AD modelinde astrositlerde 18 ayda azalır. İlginç bir şekilde, bu teknik neredeyse tüm radyotracerlere genişletilebilir.

WT sıçanları, tek taraflı LPS enjeksiyonundan sonra [125I] CLINDE radyotracer ile in vivo SPECT taraması yaşadı (Şekil 2). Bu tarama (radyotracer enjeksiyon sonrası 45-60 dakikalık görüntülerden elde edilen toplam verileri kullanarak), LPS enjeksiyonu bölgesinde (Şekil 2A) beynin kontralateral bölgesinden daha yüksek [125I] CLINDE bağlanmasını göstermiştir (Şekil 2B). FACS-RTT uy...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal at JoVE.com

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Floresan-Aktif Hücre Sıralama-Radyoligand Tedavi Edilen Doku (FACS-RTT), Alzheimer Hastalığında 18 kDa translokatör proteininin veya Serotonin 5HT2A-reseptör ekspresyonunun hücresel ölçekte rolünü incelemek için güçlü bir araçtır. Bu protokol, TgF344-AD sıçan modelinde FACS-RTT'nin ex-vivo uygulamasını açıklar.

Radyoaktif Sinyalin Hücresel Kökenini Belirlemek için Floresan Aktive Hücre Sıralama-Radyoligand ile Tedavi Edilmiş Doku (FACS-RTT)

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

Bu protokol in vivo görüntülemeyi tamamlayıcı niteliktedir. İn vivo elde edilenden farklı bir ölçek olan radyotracerlerin hücre tipi ve hücresel düzeyde nicelleştirilmesine izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, radyoligandların kullanımı ve hücre sıralaması ile verilen hassasiyeti ve hücresel çözünürlüğüdür.Fotoğraf makinesini açın ve işletim yazılımını yükleyin. Yönlendirme gerçekleştirmek için Ana Sayfa XYZ sahne alanı düğmesine tıklayın. 10 dakikalık bir tarama alımından oluşan denemeyi ayarlayın.Tüm emisyon spektrumunu kaydetmek için Adım modunu iyi ve Edinme modunu Listmode olarak ayarlayın. Yatağı kurun ve ısıtma sisteminin, solunum sensörünün ve anestezinin işlevsel ve güvenli olduğundan emin olun. Ardından, hayvanın başının yerleştirileceği yere bir hayalet yerleştirin.Ekranın alt kısmındaki üç görüntünün yardımıyla üç boyut için imleçleri kaydırarak tarama alanını ayarlayın. Fantomun ve hayvanın tarama hacminin aynı olduğundan emin olun. Daha önce belirlenmiş parametrelerle sonraki kalibrasyon için fantom taramasını başlatın.Radyoaktivite içeren deneyler için yetkilendirilmiş uygun bir ortamda çalıştığından emin olun. Bir torpido gözüne yerleştirilmiş bir termosiklerde, 100 mikrolitre asetik asit içinde 100 mikrogram tributylin öncüsünü sodyum iyodür ve beş mikrolitre% 37 parasetik asit 70 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin. 500 mikrolitrelik bir hacme ulaşmak için reaksiyonu suda% 50 asetonitril kullanarak seyreltin.Seyreltilmiş reaksiyonun 500 mikrolitresini ters fazlı bir kolona enjekte edin. CLINDE'yi 10 dakika boyunca yedi milimolar fosforik asit içinde% 5 ila% 95 ACN arasında çalışan doğrusal gradyan HPLC ile izole edin. 10 mililitrelik bir son hacme ulaşmak için izolatı suda seyreltin ve ardından seyreltilmiş reaksiyonu bir konsantrasyon kolonuna enjekte edin.CLINDE'yi kolondan 300 mikrolitre mutlak etanol ile süzün ve daha sonra etanol'ü oda sıcaklığında vakum santrifüjünde 40 dakika boyunca inkübe ederek buharlaştırın. Bir stok çözeltisi oluşturmak için CLINDE içeren kalıntıyı 300 mikrolitre salin içinde seyreltin. Radyoaktivitesini ölçtükten sonra, 500 mikrolitrede 0.037 megabecquerel çözeltisi elde etmek için stok çözeltisini tuzlu su içinde seyreltin.Soğuk referans bileşikleri ile kalibrasyon eğrilerini oluşturun ve doğrusal regresyon denklemini çözün: A ve B katsayılarını elde etmek için AX artı B'ye eşit Y. X, soğuk bileşiğin kütlesini temsil eder ve Y, eğrilerin altındaki alanı temsil eder. Radyoligand eğrisinin altındaki alanı kontrol edin, kalibrasyon eğrisine ve radyoligand eğrisinin altındaki alana bağlı olarak 450 nanometrede ultraviyole absorbansını ölçün.Kütleyi tahmin edin ve radyoligandın aktivitesini ölçün. Spesifik aktivitenin mikromol başına 1.000 gigabecquerel'den büyük olduğundan emin olun. Hayvan konumunu güncellemek için Resmi güncelle düğmesine tıklayın.Üç boyut için ekranın alt kısmındaki üç görüntünün yardımıyla imleçleri kaydırarak tarama alanını ayarlayın. Denemeyi, bir dakikanın 60 karesini oluşturan 60 dakikalık bir taramada ayarlayın. Başlangıçta ayarlanan diğer tüm parametreleri yeniden kullanın.500 mikrolitre radyoaktif radyotracer enjekte edin ve ardından tüpü 300 mikrolitre steril% 0.9 sodyum klorür ile yıkayın. Aynı zamanda, taramayı başlatmak için Edinimi başlat'a tıklayın. Tarama yeniden yapılandırma yazılımını açın ve ardından tarama klasöründe oluşturulan dosya adı parametreleri dosyasını arayarak veri kümesini açın.İlgilendiğiniz izotopu seçin. List mode parametresinin bu adımda çoklu izotop seçimine izin verdiğini unutmayın. Voksel boyutu, alt kümelerin sayısı ve yinelemeler gibi farklı rekonstrüksiyon parametrelerini makalede açıklandığı gibi ayarlayın.Çıktı formatını NIFTI olarak seçin ve ardından SPECT rekonstrüksiyonunu başlat'ı seçin. Beynin ilgi alanlarını incelemek için düz bir metal spatula ve bir tıraş bıçağı kullanın. Dokuları iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve elde edilen dokuyu tartın.Numuneleri bir mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS içeren iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne koyun ve daha sonra oda sıcaklığında iki dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. 1.900 mikrolitre enzim karışımı ekleyin ve tüpleri her beş dakikada bir ters çevirerek çalkalarken 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin. İki adet 30 mikrolitre enzim karışımı ekleyin.1.000 mikrolitrelik pipetle 30 kez ileri geri hafifçe çalkalayın. Daha sonra, karışımı 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe ederken, tüpleri her beş dakikada bir ters çevirerek çalkalayın. Dokuları ayırmak için karışımı 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe etmeden önce 200 mikrolitrelik bir pipet ve ardından 10 mikrolitrelik bir pipetle hafifçe ileri geri karıştırın.Hücreleri 70 mikrometrelik bir hücre süzgeci ile filtreleyin ve 10 mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Miyelin tükenmesi için, peleti 400 mikrolitre miyelin giderme tamponu ile yeniden askıya alın ve daha sonra dört santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatmadan önce 100 mikrolitre miyelin giderme boncukları ekleyin.Beş mililitre miyelin giderme tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 kez G santrifüj yapın. 500 mikrolitre miyelin giderme tamponu ekleyin ve asılı peletleri manyetik alan kolonuna yerleştirin. Kolonu dört kez bir mililitre miyelin giderme tamponu ile yıkayın.Oda sıcaklığında iki dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Vorteks, hücreleri ayırmak ve beş mikrolitre Fc Blok CD32 eklemek için kısaca. İlgilenilen birincil antikorların karışımından 100 mikrolitre ekleyin ve dört santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin.Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj yapın ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Tüpleri yumuşak kağıda baş aşağı boyayın. Tüpü kısaca vorteksleyin, ardından 100 mikrolitre ikincil antikor karışımı ekleyin ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin.Bir mililitre miyelin giderme tamponu ekleyin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süpernatantı atın ve tüpleri yumuşak kağıda baş aşağı bürün. Hücreleri 250 mikrolitre steril PBS'de yeniden askıya alın ve doğrudan hücre sıralamasına geçin.Vahşi tip sıçanların in vivo SPECT taraması, lipopolisakkarit enjeksiyon bölgesinde CLINDE'nin beynin kontra-lateral bölgesinden daha yüksek bağlandığını göstermiştir. Floresan aktive edilmiş hücre sıralama radyoligandı ile tedavi edilen doku veya FACS-RTT uygulanan ex vivo örnekler, sadece mikroglia'da daha fazla sayıda CLINDE bağlanma bölgesinin varlığını ortaya koydu ve beynin ipsilateral tarafındaki CLINDE sinyalinin hücresel kökeninin mikroglia olduğunu gösterdi. TgF344-AD sıçanlarında 12 ayda translokatör proteinindeki veya TSPO bağlanmasındaki artış astrositlerle sınırlıydı.24 aylık sıçanlarda, hem astrositik hem de mikroglial değişiklikler nedeniyle TSPO bağlanmasındaki artış gözlenmiştir. Daha eski TgF344-AD sıçanlarında, striatal astrositler, vahşi tiple karşılaştırıldığında azalmış bir 5HT2AR yoğunluğu göstermiştir. İnsan AD postmortem örneklerinde FACS-RTT yapıldığında, AD deneklerinin hem astrositlerinde hem de mikroglialarında TSPO'nun kortikal bir aşırı ekspresyonu gözlendi.Radyoaktivite ile çalışırken, radyo koruma talimatlarını izleyin ve uygun kişisel koruma ekipmanı giyin. Ardından, işlemden sonra, çalışma ortamını dekontamine ettiğinizden emin olun. Bu işlemden sonra izole hücre popülasyonlarında protein nicelleştirme ve gen ekspresyon analizi kolaylıkla yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Fetal Fare Visseral Organlardan Otonom Sinir progenitörlerin Floresans aktive Hücre Sıralama (FACS) İzolasyon için bir optimize Prosedürü

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Bir Hipotalamik Hücre Modeli Apoptosisi Belirleyen Bir Kaspaz Çoğullama Testi Kullanımı

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Globoid Hücre lökodistrofi Hücresel Patofizyoloji Çalışması Modeli

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ve Taze ve Dondurulmuş Rat Beyin Dokusu gelen Fos-ifade nöronlar Gen İfadesi Analizi

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometre Rat Beyin Dokusu içinde gangliositler Saptanmasında ve Görselleştirme DAN Matrix Sublime

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Drosophila larva termal tercihlerini belirlemek için bir sıcaklık gradyanı tahlil

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Floresans ile kurulan Purified Gabaerojik veya glutamaterjik nöronların primer hücre kültürü-aktif hücre sıralama

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...