Name: design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome
Uploaded: 2021-08-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

Parte di questo lavoro è stato eseguito presso il Marine Biological Lab con il supporto del Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (numero di sovvenzione 5600373) e un dono della Simons Foundation.

Questo studio ha ricevuto l'approvazione del Partners Institutional Review Board (Protocollo # 2018P002934). Il criterio di inclusione includeva pazienti adulti con fibrosi cistica che hanno fornito il consenso informato scritto per lo studio. Non esisteva un criterio di esclusione. Secondo le linee guida del protocollo, tutti i campioni di espettorato sono stati raccolti da pazienti con fibrosi cistica durante una visita ambulatoriale programmata con il loro fornitore clinico.
1. Preparazione d...

<ol>
	<li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Acosta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+microbiota+is+predictive+of+long-term+clinical+outcomes+in+young+adults+with+cystic+fibrosis.">Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis.</a> Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).</li><li>Muhlebach, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+acquisition+and+succession+of+the+cystic+fibrosis+lung+microbiome+is+associated+with+disease+progression+in+infants+and+preschool+children.">Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children.</a> PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).</li><li>Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+in+childhood.+Data+from+European+cystic+fibrosis+society+patient+registry.">Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+survival+in+adult+patients+with+cystic+fibrosis+with+FEV1+30%+of+predicted+in+the+United+States.">Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States.</a> Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+non-referral+of+patients+with+cystic+fibrosis+for+lung+transplant+evaluation+in+the+United+States.">Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).</li><li>Girardis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+conservative+vs+conventional+oxygen+therapy+on+mortality+among+patients+in+an+intensive+care+unit:+The+Oxygen-ICU+randomized+clinical+trial.">Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial.</a> JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).</li><li>Comstock, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WinCF+model+-+An+inexpensive+and+tractable+microcosm+of+a+mucus+plugged+bronchiole+to+study+the+microbiology+of+lung+infections.">The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).</li><li>Diraviam Dinesh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+sputum+medium.">Artificial sputum medium.</a> Protocol Exchange. , (2010).</li><li>Kirchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+artificial+sputum+medium+to+test+antibiotic+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+in+conditions+more+relevant+to+the+cystic+fibrosis+lung.">Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).</li><li>Grandjean Lapierre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+respiratory+tract+salt+concentration:+An+Exploratory+Cohort+Study.">Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study.</a> Medicine. 96 (47), 8423 (2017).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+glucose+and+glycemic+control+in+cystic+fibrosis-related+diabetes:+a+cross-sectional+study.">Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study.</a> PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).</li><li>Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+and+role+for+bacterial+mucin+degradation+in+cystic+fibrosis+airway+disease.">Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).</li><li>Gallagher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+mass+spectrometry+detection+of+antibiotic+agents+in+sputum+from+persons+with+cystic+fibrosis.">Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).</li><li>Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins,+mucus,+and+sputum.">Mucins, mucus, and sputum.</a> Chest. 135 (2), 505-512 (2009).</li><li>Sui, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+variation+in+human+and+built+environment+microbial+community+and+functional+profiles+assessed+by+shotgun+metagenomics+sequencing.">Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).</li><li>McIver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bioBakery:+a+meta'omic+analysis+environment.">bioBakery: a meta'omic analysis environment.</a> Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).</li><li>Truong, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaPhlAn2+for+enhanced+metagenomic+taxonomic+profiling.">MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling.</a> Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).</li><li>Stammler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjusting+microbiome+profiles+for+differences+in+microbial+load+by+spike-in+bacteria.">Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria.</a> Microbiome. 4 (1), 28 (2016).</li><li>Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC5AC+and+MUC5B+mucins+are+decreased+in+cystic+fibrosis+airway+secretions.">MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).</li><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyper+concentration+and+increased+osmotic+pressure.">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li><li>Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+pulmonary+secretions.+I.+The+over-all+chemical+composition+of+pulmonary+secretions+from+patients+with+cystic+fibrosis,+bronchiectasis,+and+laryngectomy.">Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy.</a> American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).</li><li>Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+regulation+of+extracellular+DNA+release+and+its+biological+roles+in+microbial+communities.">Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).</li><li>Tunney, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+anaerobic+bacteria+in+high+numbers+in+sputum+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).</li><li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).</li></ol>

In questo studio, è stato sviluppato un modello in vitro per studiare l'effetto dell'iperossia sulle comunità microbiche polmonari. Questo modello, basato sul mezzo espettorato artificiale e sullo spargimento giornaliero di flaconi di siero, mantiene elevate concentrazioni di ossigeno e supporta la crescita dei microbi identificati nell'espettorato da pwCF.
Ci sono diversi passaggi critici di questo approccio. Il primo è la scelta di utilizzare la sterilizzazione con filtro piuttos...

La fibrosi cistica (FC) è una malattia genetica caratterizzata dall'incapacità di eliminare il muco denso dai polmoni, che porta a infezioni ripetute e progressivo declino della funzione polmonare che spesso si traduce nella necessità di trapianto di polmone o morte. Il microbioma delle vie aeree delle persone con fibrosi cistica (pwCF) sembra tracciare l'attività della malattia1, con una riduzione della diversità microbica associata a esiti avversi a lungo termine2,3. Negli studi clinici di pwCF, l'ossigenoterapia supplementare è stata associata alla malattia più avanzata4,5, anche se tradizionalmente, l'uso dell'ossigenoterapia è stato visto semplicemente come un marcatore per la gravità della malattia6. Recenti studi di uno studio clinico su pazienti con insufficienza respiratoria hanno dimostrato che livelli più elevati di ossigeno nei pazienti sono paradossalmente associati ad un aumento delle infezioni batteriche gravi e ad una maggiore mortalità7, suggerendo che l'ossigeno supplementare può contribuire alla patogenesi della malattia. L'effetto dell'ossigeno supplementare sul microbioma polmonare della fibrosi cistica e sulle comunità microbiche polmonari e aeree associate non è stato ben studiato.
Gli studi meccanicistici spesso non possono essere eseguiti direttamente su soggetti umani a causa di difficoltà logistiche e potenziali problemi etici associati a interventi di beneficio o danno medico sconosciuto. Gli approcci traslazionali che integrano i biocampioni umani in sistemi modello possono offrire importanti intuizioni biologiche in questi casi. Mentre la capacità di utilizzare o tollerare l'ossigeno è stata tradizionalmente una componente importante della classificazione microbica, poco si sa su come l'introduzione terapeutica di ossigeno supplementare nell'ambiente potrebbe perturbare le comunità microbiche delle vie aeree. Per far luce sugli effetti sconosciuti dell'ossigeno supplementare sui microbiomi delle vie aeree di pwCF, dovevamo affrontare due sfide principali; in primo luogo, la creazione di un terreno di coltura che approssima fisiologicamente la composizione dell'espettorato CF; in secondo luogo, la creazione di un sistema modello che consenta il mantenimento di elevate concentrazioni di ossigeno in coltura per lunghi periodi di tempo.
I mezzi di espettorato artificiale (ASM) sono ampiamente utilizzati per emulare l'espettorato polmonare ex vivo8,9,10, ma non esiste un chiaro consenso su una ricetta specifica. Questo protocollo descrive una ricetta e una strategia di preparazione del mezzo espettorato artificiale attentamente progettata per approssimare fisiologicamente l'espettorato da pwCF. La Tabella 1 delinea i valori delle ricette scelte in base alla letteratura pubblicata. I componenti chimici di base e il pH sono stati abbinati ai valori identificati dagli studi sull'espettorato CF umano11,12,13. Nutrienti fisiologici a bassa concentrazione sono stati aggiunti utilizzando il tuorlo d'uovo, che è stato incluso come 0,25% del volume finale10, così come le miscele di vitamine e traccemetalliche 14,15. La mucina, il componente chiave dell'espettorato16,è stata inclusa all'1% p/v14. Sebbene più laboriosa, la sterilizzazione con filtro è stata scelta rispetto alla pratica più convenzionale della sterilizzazione a caldo per ridurre i potenziali problemi derivanti dalla denaturazione indotta dal calore dei componenti essenziali dei mezzi10. Un ulteriore vantaggio della sterilizzazione con filtro è che genera mezzi trasparenti (la sterilizzazione a caldo può creare mezzi torbidi a causa della precipitazione e della coagulazione di sali e proteine), consentendo a questo mezzo espettorato artificiale di essere utilizzato per seguire la crescita microbica in base all'aumento della torbidità.
Questo sistema modello per la coltura iperossica si basa su tecniche di coltivazione anaerobica in cui l'ossigeno viene aggiunto piuttosto che rimosso, creando un modello per l'effetto dell'uso supplementare di ossigeno per pwCF. La Figura 1 e il protocollo di sparging dell'ossigeno associato delineano i componenti di un sistema di sparging di ossigeno, che può essere ottenuto a basso costo da fornitori generali di laboratorio e ospedalieri. Questo sistema consente la miscelazione di ossigeno compresso e aria a concentrazioni fisse che vanno dal 21% al 100% di ossigeno. L'integrazione di un sensore di ossigeno consente la verifica della concentrazione della miscela di gas in uscita, nonché il controllo della composizione del gas di deflusso di bombole di siero precedentemente spargate per verificare che le condizioni di ossigeno siano state mantenute entro l'intervallo desiderato.
Questo protocollo delinea le procedure per creare un mezzo espettorato artificiale, la costruzione e l'uso di un sistema di spargimento di ossigeno e l'applicazione di entrambi per coltivare l'espettorato CF in condizioni di ossigeno differenziale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME Vitamins (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>B6891</td>
			<td>Concentrated solution of supplemental vitamins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crimper, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224307</td>
			<td>Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaphragm Pump ME 2 NT</td>
			<td>VACUUBRAND</td>
			<td>20730003</td>
			<td>Vacuum pump for vacuum filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Yolk Emulsion</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>FD045</td>
			<td>Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferritin, Cationized from Horse Spleen</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F7879</td>
			<td>Ferritin (iron-storage protein) solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIREBOY plus Safety Bunsen Burner</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>144000</td>
			<td>Bunsen burner with user interface and safety features.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (1.0&#8211;14.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>94</td>
			<td>pH testing paper for the range of 1.0&#8211;14.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (4.0&#8211;9.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>55</td>
			<td>pH testing paper for the range of 4.0&#8211;9.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (6.0&#8211;8.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>345</td>
			<td>pH testing paper for the range of 6.0&#8211;8.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>401815</td>
			<td>18 G needles with safety caps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Pressure Gauge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20469</td>
			<td>Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 42 Incubated Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000756</td>
			<td>Combination incubator/orbital shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with Attached Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309580</td>
			<td>Combination 3 mL syringe and 18 G needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Valve Assortment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14011</td>
			<td>Valves for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Orbital Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6780-NP</td>
			<td>Orbital shaker to agitate media during filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-346-15FM</td>
			<td>Air flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Amino Acids (50x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5550</td>
			<td>Concentrated solution of essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Concentrated solution of non-essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLMP25SS</td>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone membrane sterile syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Academic</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ZMQS60E01</td>
			<td>Milli-Q sterile water filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniOX 3000 Oxygen Monitor</td>
			<td>MSA</td>
			<td>814365</td>
			<td>Gas flow oxygen percentage monitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBM-90</td>
			<td>MOPS buffer for adjusting media pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from Porcine Stomach</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2378</td>
			<td>Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-1413</td>
			<td>Connectors for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td>Library preparation for identification during sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>770-2016-025-N</td>
			<td>Shotgun sequencing platform for generating sample reads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-540-15FM</td>
			<td>Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors</td>
			<td>SunMed</td>
			<td>2001-01</td>
			<td>Tubing for connecting gas system components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>Molecular Biologicals International</td>
			<td>MRGF-6235</td>
			<td>Concentrated phosphate-buffered saline solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 420 Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>CO-PC420</td>
			<td>Combination hot plate/stirrer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Solid potassium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Disposable Stir Bars</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td>Disposable magnetic stir bars.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Thread Seal Teflon Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470042-938</td>
			<td>Teflon tape for reinforcing gas system connections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Gard 2 Purification Cartridge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>QGARD00D2</td>
			<td>Purification cartridge for Milli-Q system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Media Storage Bottles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-423A</td>
			<td>Bottles for mixing and storing culture media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224100-331</td>
			<td>Rubber stoppers for serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>223952</td>
			<td>Glass serum bottles for sealed culturing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Bore Extension Set</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>471960</td>
			<td>Tubing extension with luer lock connectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Solid sodium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-in Control I (High Microbial Load)</td>
			<td>ZymoBIOMICS</td>
			<td>D6320</td>
			<td>Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td>250 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes</td>
			<td>Professional Disposables International</td>
			<td>H04082</td>
			<td>Disposable germicidal wipes for sterilization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metals Mixture, 1000x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0112668</td>
			<td>Concentrated solution of physiological trace metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlined Aluminum Seal, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224187-01</td>
			<td>Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Air Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI USP200</td>
			<td>Compressed air tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Oxygen Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USP200</td>
			<td>Compressed oxygen tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome

Si ritiene che le comunità microbiche delle vie aeree svolgano un ruolo importante nella progressione della fibrosi cistica (FC) e di altre malattie polmonari croniche. I microbi sono stati tradizionalmente classificati in base alla loro capacità di utilizzare o tollerare l'ossigeno. L'ossigeno supplementare è una terapia medica comune somministrata a persone con fibrosi cistica (pwCF); tuttavia, gli studi esistenti sull'ossigeno e sul microbioma delle vie aeree si sono concentrati su come l'ipossia (basso livello di ossigeno) piuttosto che l'iperossia (alto livello di ossigeno) colpisce le comunità microbiche polmonari anaerobiche prevalentemente aerobiche e facoltative. Per affrontare questa lacuna critica di conoscenza, questo protocollo è stato sviluppato utilizzando un mezzo espettorato artificiale che imita la composizione dell'espettorato da pwCF. L'uso della sterilizzazione con filtro, che produce un mezzo trasparente, consente ai metodi ottici di seguire la crescita di microbi unicellulari in colture in sospensione. Per creare condizioni iperossiche, questo sistema modello sfrutta le tecniche di coltivazione anaerobica consolidate per studiare le condizioni iperossiche; invece di rimuovere l'ossigeno, l'ossigeno viene aggiunto alle colture mediante spargimento quotidiano di flaconi di siero con una miscela di ossigeno compresso e aria. L'espettorato da 50 pwCF è stato sottoposto a sparging giornaliero per un periodo di 72 ore per verificare la capacità di questo modello di mantenere condizioni di ossigeno differenziale. Il sequenziamento metagenomico shotgun è stato eseguito su campioni di espettorato in coltura e non coltivati da 11 pwCF per verificare la capacità di questo mezzo di supportare la crescita di microbi commensali e patogeni comunemente presenti nell'espettorato della fibrosi cistica. Le curve di crescita sono state ottenute da 112 isolati ottenuti da pwCF per verificare la capacità di questo mezzo espettorato artificiale di supportare la crescita di comuni patogeni della fibrosi cistica. Troviamo che questo modello può coltivare un'ampia varietà di agenti patogeni e commensali nell'espettorato CF, recupera una comunità molto simile all'espettorato non coltivato in condizioni normossiche e crea diversi fenotipi di coltura in condizioni di ossigeno variabili. Questo nuovo approccio potrebbe portare a una migliore comprensione degli effetti imprevisti indotti dall'uso di ossigeno in pwCF sulle comunità microbiche delle vie aeree e sui comuni patogeni respiratori.

Questi protocolli sono stati applicati a 50 campioni di espettorato da pwCF che si presentano per cure di routine a una clinica ambulatoriale per la fibrosi cistica presso il Massachusetts General Hospital di Boston, Massachusetts. L'espettorato di ogni paziente è stato coltivato in condizioni di ossigeno al 21%, 50% e 100% utilizzando il mezzo artificiale dell'espettorato, con aliquote di 0,5 ml prelevate da ciascuna coltura a 24 ore, 48 ore e 72 ore di tempo di coltura per il test. Le culture sono state fotografate qu...

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Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

L'obiettivo di questo protocollo è quello di sviluppare un sistema modello per l'effetto dell'iperossia sulle comunità microbiche delle vie aeree della fibrosi cistica. Il mezzo espettorato artificiale emula la composizione dell'espettorato e le condizioni di coltura iperossica modellano gli effetti dell'ossigeno supplementare sulle comunità microbiche polmonari.

Progettazione e sviluppo di un modello per studiare l'effetto dell'ossigeno supplementare sul microbioma delle vie aeree della fibrosi cistica

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

Questi protocolli sono progettati per modellare gli effetti in vitro dell'uso supplementare di ossigeno sul microbioma polmonare dei pazienti con fibrosi cistica. Questa ricetta multimediale è adattata per rispecchiare la composizione fisiologica dell'espettorato per le persone che vivono con la fibrosi cistica. Il processo di sparging introduce la capacità di coltivare in diverse condizioni di ossigeno.Le alterazioni del mezzo espettorato artificiale consentono di imitare altre malattie polmonari croniche e modellare comunità microbiche in altre condizioni, come diverse concentrazioni di glucosio in pazienti concomitanti con fibrosi cistica e diabete. Una panoramica dei passaggi per la preparazione del mezzo espettorato artificiale mostra la miscelazione di ASCM, ASMM e ASBM preparati. Il tampone mops viene utilizzato per titolare il pH a 6,3 e la sterilizzazione del filtro del mezzo viene effettuata in una cella frigorifera su uno shaker orbitale.Per cominciare, preparare un mezzo espettorato artificiale aggiungendo 250 millilitri di ASCM alla bottiglia da un litro contenente ASMM. Quindi aggiungere 250 millilitri di ASBM alla bottiglia media. Titolare il mezzo con un tampone mops molare di base per raggiungere un pH di 6,3 su una carta a pH.Refrigerare il mezzo espettorato artificiale a quattro gradi Celsius fino alla filtrazione. Quindi, per avviare il processo di filtrazione, trasferire 200 millilitri di mezzo espettorato artificiale non filtrato a un sistema di filtrazione a vuoto con un filtro di dimensioni dei pori di 0,22 micrometri. Dopo aver collegato il sistema di filtrazione alla pompa per vuoto, accendere la pompa per vuoto, quindi posizionare la camera su uno shaker orbitale, agitando a 90 rotazioni al minuto in una cella frigorifera a quattro gradi Celsius.Cambia il filtro dopo che 350 millilitri di mezzo vengono filtrati per superare il problema dell'intasamento. Dopo che una quantità considerevole è filtrata, a un mezzo extra di 150 millilitri per la filtrazione. Ripetere la filtrazione con camere aggiuntive fino a quando tutto il fluido non viene filtrato.Panoramica dello spargimento di ossigeno che dimostra l'aggiunta dell'espettorato del paziente al mezzo espettorato artificiale in un flacone di siero autoclavato. Quindi spargere la bottiglia di siero sigillata con una miscela di gas. Infine, il flacone di siero viene incubato per ottenere la coltura di Alec Watts all'intervallo di 24 ore per il successivo sequenziamento meta genomico.Per iniziare lo sparging della coltura del flacone di siero, etichettare i flaconi di siero autoclavati da 500 millilitri con identificatori del campione, data e ora di inoculazione e percentuale di ossigeno target. In un cappuccio biologico, aggiungere 24 millilitri del mezzo espettorato artificiale a ciascun flacone di siero in fase di installazione. Per ottenere un volume di campione sufficiente per ogni condizione di coltura, se necessario, diluire il campione con soluzione salina tamponata con fosfato sterile, quindi omogeneizzare l'espettorato con un ago da 18 gauge e aggiungere un millilitro dell'espettorato del paziente a ciascun flacone di siero.Successivamente, utilizzando una pinzetta sterile, posizionare i tappi di gomma autoclavati sulla parte superiore di ciascun flacone di siero, premere verso il basso i tappi di gomma senza toccare la parte inferiore del tappo. Dopo aver rimosso le bottiglie dal cappuccio, applicare e crimpare i sigilli in alluminio. Rimuovere il centrotavola dei sigilli e pulire la parte superiore delle bottiglie con una salvietta imbevuta di alcool e passare il sigillo della bottiglia attraverso una fiamma del bruciatore Bunsen.Ora fissare un ago sterile calibro 18 a una siringa a stantuffo con un filtro, inserire prima la siringa di rilascio del gas apposta nella bottiglia. Ora fissare un ago sterile calibro 18 all'uscita del gas dal sistema e inserire anche l'ago di uscita del gas nella bottiglia. Instradare le giunzioni a T dai serbatoi attraverso il monitor dell'ossigeno.Dopo aver verificato la concentrazione di ossigeno target che scorre attraverso il sistema, mirare a circa cinque litri al minuto di flusso di gas. Reindirizzare le giunzioni a T dai serbatoi fino all'uscita del gas. Quando il gas inizia a fluire attraverso la bombola di siero, prestare molta attenzione al manometro e, se la pressione aumenta inaspettatamente, spegnere immediatamente il sistema.Dopo la corsa, l'ossigeno scorre attraverso la bottiglia di siero per un minuto a cinque litri al minuto, le impostazioni consentono 10 scambi d'aria e assicurano che l'atmosfera interna raggiunga la concentrazione desiderata di ossigeno al 100%. Rimuovere il rilascio di gas, ago calibro 18. Dopo aver lasciato che la pressione nella bottiglia di siero si accumulasse in un'atmosfera, rimuovere immediatamente l'ago di uscita del gas.Incubare i flaconi di siero in uno shaker per incubatore a 37 gradi Celsius a 150 rotazioni al minuto per intervalli di 3, 24 ore. Alec Watts vengono prelevati ad ogni intervallo di 24 ore per l'analisi a valle e i campioni vengono rigenerati ogni volta. L'esempio qui mostra come può apparire una cultura prima e dopo l'incubazione.I livelli di ossigeno e pH di deflusso sono stati misurati nel corso del processo di coltura per i campioni di espettorato mantenuti a 37 gradi Celsius. Con entrambi gli intervalli di sparging di 12 ore e 24 ore, le concentrazioni di ossigeno sono state approssimativamente mantenute nel tempo con un moderato calo della concentrazione di ossigeno osservato per tutte e tre le condizioni. I livelli di pH misurati erano all'interno dell'intervallo fisiologico senza cambiamenti significativi nel tempo.Il confronto tra carica microbica, diversità e composizione della comunità tra espettorato non coltivato e in coltura ha rivelato un aumento di 20 volte della carica microbica nell'espettorato in coltura. Le metriche di diversità indicavano la conservazione della composizione della comunità con differenze globali minime introdotte dal processo culturale. L'analisi comparativa delle 120 specie microbiche nell'espettorato in coltura e non coltivato è stata eseguita mediante sequenziamento meta genomico.46 di queste specie sono state identificate sia in campioni non coltivati che coltivati. Mentre 35 sono stati identificati esclusivamente in campioni non coltivati e 39 sono stati identificati esclusivamente in campioni coltivati. Sono state generate curve di crescita basate sull'assorbimento per i comuni patogeni polmonari CF coltivati in mezzi espettorati artificiali da isolati di campioni di pazienti con una normale concentrazione di ossigeno del 21%.Nessun cambiamento nel tempo nella densità ottica a 600 nanometri nell'ASM solo il controllo negativo ha indicato una coltura priva di contaminazione. I tipici modelli di curva di crescita osservati indicano che il mezzo ASM può essere utilizzato per la generazione di curve di crescita utilizzando metodi ottici. Il sequenziamento metagenomico viene qui utilizzato per descrivere la composizione della comunità microbica.Altre tecniche come il sequenziamento metatrascrittomico possono essere utilizzate per valutare l'espressione genica o la metabolomica per valutare la produzione di metaboliti.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Trapianto ortotopico aortica: un modello di ratto per studiare lo sviluppo di vasculopatia cronica

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Ricerca

Medicina

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarcatori in un modello animale per Rivelare correlati neurali, ematologiche, e comportamentali di PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Il dimetilnitrosamina indotta fibrosi epatica modello nel ratto

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Topico Airway Anestesia per intubazione da sveglio-endoscopica Utilizzando la Spray-as-you-go Tecnica con alto flusso di ossigeno

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Un modello di trofoblasto umano primario per studiare l'effetto di infiammazione associata con l'obesità materna sulla regolazione dell'autofagia nella Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato