3.6K Views
•
06:17 min
•
November 20th, 2021
DOI :
November 20th, 2021
•Transcript
I denne video viser vi, hvordan du bruger et syvpunkts scoringssystem til at kvantificere ændringer i dopaminergisk neuron dendrit morfologi i C.elegans. Der er i øjeblikket en stor variation i analytiske metoder til kvantificering neurodegeneration i orme. Derudover fokuserer nogle eksisterende færdigheder kun på cellekroppe og er ikke følsomme over for visse typer og niveauer af skader.
Formålet med at indføre dette scoringssystem er at give mulighed for at fange et omfattende billede af neurodegeneration på alle niveauer af skader, og at give et universelt system til at støtte konsistens på tværs af C.elegans dopaminergisk neurodegeneration forskning. Her vil vi demonstrere, hvordan man forestiller neuroner under fluorescens, tildeler scoringer til disse neurons dendritter og forhåndsviser, hvordan man viser og fortolker resultaterne. For hver eksperimentel gruppe skal pipette eller plukke 20 til 30 orme til en billedplatform, der er kompatibel med billedmikroskopet.
De mest almindelige platforme omfatter 2% agarose puder monteret på glas dias med et dæksel slip, og 96-brønd plader, der indeholder godt volumener på eller mindre end 100 mikroliter af flydende medium. Lad orme lamme helt. Dette kan tage flere minutter.
Indlæs den forberedte billedbehandlingsplatform i et billedmikroskop, der kan z-stack-opsamlinger. Find ormens hovedområde først i lyse felt, derefter under en enkelt farve GFP fluorescens ved hjælp af billeddannelse mikroskop. Ormen vises her i en 400x forstørrelse.
Rul gennem fokus for at finde øvre og nedre grænser, hvor dendritterne er tydelige. Angiv disse som øvre og nedre grænser for z-stack billedoptagelse. Vælg den ønskede tonehøjde.
Her bruger vi et mikrometer. Klik her for at tage z-stack-billeder i GFP-fluorescenskanalen. For hver z-stack skal du åbne billedfilen ved hjælp af enten mikroskopsoftwaren eller en ekstern billedanalysesoftware.
Indlæs stakken i softwaren, og komprimer stakken til et enkelt fladt billede. Juster billeder mellem og inden for behandlingsgrupper manuelt eller ved hjælp af automatisk viklingssoftware. Arbejd med et neuronbillede ad gangen.
Vælg en af de fire CEP dendritter til at vurdere for blebs, pauser og uregelmæssigheder, herunder bøjninger, kinks og kurver. Scoring fra venstre mod højre, når næsen er øverst på billedet anbefales for at sikre repeterbarhed i scoring. Ved hjælp af disse retningslinjer skal du tildele en pointværdi til hver dendrit.
Tildele en score på nul for dendritter uden synlige skader, en score på en for dendritter med uregelmæssigheder, men ingen oppustethed eller brud, en score på to for dendritter med mindre end fem blebs, en score på tre for mellem fem og 10 blebs, en score på fire for over 10 blebs og / eller brud fjerne op til 25% af dendrit, en score på fem for brud fjerne 25 til 75% af dendrit, og en score på seks, hvis mere end 75% af dendrit er fraværende. Hvis flere kriterier er opfyldt inden for en enkelt dendrit, skal du overveje de kriterier, der svarer til den højeste score. Disse repræsentative scoringsbilleder, der findes i figur 1 i den artikel, der er knyttet til denne video, kan bruges som reference.
For at demonstrere scoring, vil vi gå gennem tildele scoringer til et par eksempel neuron billeder. Start med den øverste mest dendrit, der er ingen synlige blebs, pauser eller uregelmæssigheder. Tildel en score på nul.
Den anden dendrit har omkring 14 blebs og ingen synlige pauser. Tildel en score på fire. Den tredje dendrit kan ikke ses i sin helhed på grund af overlapning med dendrit to og kan ikke scores.
Den nederste mest dendrit har omkring 11 blebs og et par pauser. Tildel en score på fem. På dette billede er kun tre dendritter brændbare, da en dendrit ikke blev fuldt fanget i z-stack-optagelsen.
Der er ingen brølende på de tre synlige dendritter. Det her ville altså blive scoret fra top til bund som et nul, et nul, og på grund af knæk her, en en. Endelig, i dette billede, alle fire dendritter er mere end 75% tabt.
Alle dendritter her får en score på seks. Optag alle scoringer. Scores kan være unblinded på dette tidspunkt.
Den scoreskabelon, der bruges her, findes i de supplerende filer. Divider neurodegeneration score tallies med det samlede antal dendritter scoret i behandlingsgruppen. Nuværende data som andel af dendritter inden for behandlingsgruppen ved hver neurodegenerationsscore.
Vores scoringssystem blev brugt til at vurdere neurodegeneration i L4 larvestadiet BY200 C.elegans efter rotenoneksponering. Dataene vises her som med proportionerne af det samlede antal dendritter ved hver scoreværdi for hver eksperimentel gruppe. Vi betragter hver dendrit scoret som n 1.
I dette tal kan en dosisafhængig neurodegenerationsrespons på rotenoneksponering værdsættes, og den specifikke opdeling af scorefordelingen vises tydeligt. Disse eksperimentelle grupper var statistisk forskellige i henhold til en Chi-kvadreret test for uafhængighed suppleret med en Bonferroni korrektion for flere sammenligninger. I denne video har vi vist, hvordan man bruger syvpunktsskalaen udviklet i vores laboratorium til at kvantificere niveauer af dopaminergisk neuronmorfologisk ændring og degeneration i C.elegans.
Brug af scoringsmetoden fremmer konsistens i analysen og giver mulighed for sammenligning mellem neurodegenerationsforskningsundersøgelser i orme. Vores scoringssystem kan bruges til at analysere data fra C.elegans eksperimenter, der bruger cellespecifikke fluorescerende journalister, såsom dat-1 dopamin transporter gen, der giver mulighed for visualisering af dopaminerge neuroner. Nu kan du finde en praksis sæt af billeder med kommentarer, der kan bruges til at træne, kalibrere, og vurdere scoring konsistens af forskere nye til denne metode i denne artikel supplerende materiale.
I denne artikel viser vi, hvordan du bruger et syv-punkts scoringssystem til konsekvent at kvantificere ændringer i dopaminergisk neuron dendritmorfologi i C. elegans. Dette system er beregnet til analyser af dopaminergiske neurodegeneration assays udnytte genetiske, kemiske, og aldersbaserede modeller af neurodegenerative lidelser.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved