בסרטון זה, אנו מראים כיצד להשתמש במערכת ניקוד שבע נקודות כדי לכמת שינויים במורפולוגיה של נוירון דנדריט דופאמין ב- C.elegans. יש כיום שונות גדולה בשיטות אנליטיות לכימות ניוון עצבי בתולעים. בנוסף, חלק מהמיומנויות הקיימות מתמקדות רק בגופי תאים ואינן רגישות לסוגים מסוימים ורמות נזק מסוימות.
מטרת החדרת מערכת ניקוד זו היא לספק את היכולת ללכוד תמונה מקיפה של ניוון עצבי בכל רמות הנזק, ולספק מערכת אוניברסלית לתמיכה בעקביות על פני מחקר ניוון עצבי דופאמין C.elegans. כאן, אנו להדגים כיצד לדמיין נוירונים תחת פלואורסצנטיות, להקצות ציונים דנדריטים של נוירון אלה, ולהציג בתצוגה מקדימה כיצד להציג ולפרש את התוצאות. עבור כל קבוצת ניסוי, pipette או לבחור 20 עד 30 תולעים לפלטפורמת הדמיה תואמת מיקרוסקופ הדמיה.
הפלטפורמות הנפוצות ביותר כוללות 2% רפידות אגרוז המותקנות על מגלשות זכוכית עם פתק כיסוי, וצלחות של 96 באר המכילות נפחים טובים בפחות מ-100 מיקרוליטרים של מדיום נוזלי. אפשר לתולעים לשתק לחלוטין. פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות.
טען את פלטפורמת ההדמיה המוכנה למיקרוסקופ הדמיה המסוגל ללכוד מחסנית z. אתר את אזור הראש של התולעת תחילה בשדה בהיר, ולאחר מכן תחת פלואורסצנטיות GFP בצבע יחיד באמצעות מיקרוסקופ ההדמיה. התולעת מוצגת כאן בהגדלה של פי 400.
גלול בין המוקד כדי למצוא גבולות עליונים ותחתונים שבהם הדנדריטים ברורים. הגדר אותם כגבולות עליונים ותחתונים ללכידת תמונת ערימת z. בחר את ההגשה הרצויה.
כאן אנו משתמשים במיקרומטר אחד. לחץ כדי ללכוד תמונות z-stack בערוץ פלואורסצנטי GFP. עבור כל מחסנית z, פתח את קובץ התמונה באמצעות תוכנת המיקרוסקופ או תוכנת ניתוח תמונה חיצונית.
טען את המחסנית לתוך התוכנה ודוחס את הערימה לתמונה שטוחה אחת. ישר תמונות בין קבוצות טיפול ובתוך באופן ידני או באמצעות תוכנת פיתול אוטומטית. עבוד עם תמונת נוירון אחת בכל פעם.
בחר אחד מארבעת דנדריטים CEP להערכה עבור blebs, הפסקות, ואי סדרים, כולל כיפופים, סטיות, ועקומות. מומלץ להבקיע משמאל לימין כאשר האף נמצא בחלק העליון של התמונה כדי להבטיח יכולת חזרה לניקוד. באמצעות קווים מנחים אלה, הקצה ערך ניקוד אחד לכל דנדריט.
הקצה ציון אפס לדנדריטים ללא נזק נראה לעין, ציון של אחד עבור דנדריטים עם אי סדרים אך ללא חבטות או שבירה, ציון של שניים לדנדריטים עם פחות מחמישה blebs, ציון של שלושה בין חמישה לעשרה blebs, ציון של ארבעה עבור מעל 10 blebs ו / או שבירה הסרת עד 25% של dendrite, ציון של חמישה עבור שבירה הסרת 25 עד 75% של דנדריט, וציון של שישה אם יותר מ 75% של dendrite נעדר. אם מתקיימים קריטריונים מרובים בתוך דנדריט יחיד, שקול את הקריטריונים המתאימים לציון הגבוה ביותר. תמונות ניקוד מייצגות אלה שנמצאו באיור 1 של המאמר המשויך לסרטון זה עשויות לשמש כהפניה.
כדי להדגים ניקוד, נלך דרך הקצאת ציונים לכמה תמונות נוירון לדוגמה. התחל עם הדנדריט העליון ביותר, אין blebs גלוי, הפסקות, או אי סדרים. הקצה ציון אפס.
בדנדריט השני יש כ-14 ג'בי ואין הפסקות נראות לעין. הקצה ציון של ארבעה. לא ניתן לראות את הדנדריט השלישי בשלמותו בשל חפיפה עם דנדריט 2 ולא ניתן להבקיע אותו.
בדנדריט התחתון ביותר יש כ -11 blebs וכמה הפסקות. הקצה ציון של חמש. בתמונה זו, רק שלושה דנדריטים ניתנים לניקוד, שכן דנדריט אחד לא נלכד במלואו בלכידת הערימה z.
אין פעיגה על שלושת הדנדריטים הנראים לעין. אז זה יהיה ציון מלמעלה למטה כאפס, אפס, ובשל העיוות כאן, אחד. לבסוף, בתמונה זו, כל ארבעת הדנדריטים אבודים ביותר מ-75%.
כל הדנדריטים כאן מקבלים ציון של שש. להקליט את כל התוצאות. ציונים עשויים להיות מאושרים בשלב זה.
ניתן למצוא את תבנית הניקוד המשמשת כאן בקבצים המשלימים. חלק את ציוני ניוון עצבי במספר הכולל של דנדריטים הבקיע בקבוצת הטיפול. הצג נתונים כשיעור של דנדריטים בתוך קבוצת הטיפול בכל ציון ניוון עצבי.
מערכת הניקוד שלנו שימשה להערכת ניוון עצבי בשלב L4 זחל על ידי 200 C.elegans לאחר חשיפה רוטנון. הנתונים מוצגים כאן כמו עם הפרופורציות של המספר הכולל של דנדריטים בכל ערך ציון עבור כל קבוצת ניסוי. אנחנו מחשיבים כל דנדריט ציון כמו n 1.
באיור זה ניתן להעריך תגובת ניוון עצבי תלוי מינון לחשיפה לרוטנון, והפילוח הספציפי של התפלגות הניקוד מוצג בבירור. קבוצות ניסוי אלה היו שונות מבחינה סטטיסטית על פי מבחן צ'י בריבוע לעצמאות בתוספת תיקון Bonferroni להשוואות מרובות. בסרטון זה, הדגמנו כיצד להשתמש בסולם שבע הנקודות שפותח במעבדה שלנו כדי לכמת רמות של נוירון דופאמין שינוי מורפולוגי ניוון ב C.elegans.
שימוש בשיטת הניקוד מקדם עקביות בניתוח ומאפשר השוואה בין מחקרי ניוון עצבי בתולעים. מערכת הניקוד שלנו עשויה לשמש לניתוח נתונים הנגזרים מניסויים C.elegans המשתמשים בכתבים פלואורסצנטיים ספציפיים לתא, כגון גן טרנספורטר דופמין dat-1 המאפשרים הדמיה של נוירונים דופאמין. עכשיו, אנא מצא ערכת תרגול של תמונות עם פרשנות שניתן להשתמש בה כדי לאמן, לכייל, ולהעריך את עקביות הניקוד של חוקרים חדשים לשיטה זו בחומר המשלים של מאמר זה.
