Kvantifiera nivåer av dopaminerg neuron morfologiska förändring och degeneration i Caenorhabditis elegans

I den här videon visar vi hur man använder ett sju poäng poängsystem för att kvantifiera förändringar i dopaminerg neuron dendrite morfologi i C.elegans. Det finns för närvarande en stor variation i analysmetoder för kvantifiering av neurodegeneration i maskar. Dessutom fokuserar vissa befintliga färdigheter endast på cellkroppar och är inte känsliga för vissa typer och nivåer av skador.

Syftet med att införa detta poängsystem är att ge förmågan att fånga en omfattande bild av neurodegeneration på alla nivåer av skador, och att tillhandahålla ett universellt system för att stödja konsekvens över C.elegans dopaminerg neurodegeneration forskning. Här kommer vi att visa hur man avbildar nervceller under fluorescens, tilldelar poäng till dessa neurons dendriter och förhandsgranskar hur man visar och tolkar resultaten. För varje försöksgrupp, pipetter eller plocka 20 till 30 maskar till en bildplattform som är kompatibel med bildmikroskopet.

De vanligaste plattformarna inkluderar 2% agarose pads monterade på glasrutschbanor med en täcklapp och 96-brunnsplattor som innehåller brunnsvolymer vid eller mindre än 100 mikroliter flytande medium. Låt maskar förlamas helt. Detta kan ta flera minuter.

Ladda den förberedda bildplattformen i ett bildmikroskop som kan z-stack-fångster. Lokalisera maskens huvudregion först i ljust fält och sedan under en enda färg GFP fluorescens med hjälp av bildmikroskopet. Masken visas här i en 400x förstoring.

Bläddra igenom fokus för att hitta övre och nedre gränser där dendriterna är tydliga. Ange dessa som övre och nedre gränser för bildtagning av z-stack. Välj önskad tonhöjd.

Här använder vi en mikrometer. Klicka här om du vill ta z-stackbilder i GFP-fluorescenskanalen. För varje z-stack öppnar du bildfilen med antingen mikroskopprogramvaran eller en extern bildanalysprogramvara.

Läs in stacken i programvaran och komprimera stacken till en enda förenklad bild. Justera bilder mellan och inom behandlingsgrupper manuellt eller med hjälp av automatisk lindningsprogram. Arbeta med en neuronbild i taget.

Välj en av de fyra CEP-dendriterna för att bedöma för blebs, raster och oegentligheter, inklusive böjningar, kinks och kurvor. Poängsättning från vänster till höger när näsan är högst upp i bilden rekommenderas för att säkerställa repeterbarhet vid poängsättning. Med hjälp av dessa riktlinjer tilldelar du ett poängvärde till varje dendrite.

Tilldela en poäng på noll för dendriter utan synliga skador, en poäng på en för dendriter med oegentligheter men ingen blobbing eller brott, en poäng på två för dendriter med mindre än fem blebs, en poäng på tre för mellan fem och 10 blebs, en poäng på fyra för över 10 blebs och / eller brott som tar bort upp till 25% av dendriten, en poäng på fem för brott som tar bort 25 till 75% av dendriten, och en poäng på sex om mer än 75% av dendriten är frånvarande. Om flera villkor uppfylls inom en enda dendrit bör du överväga de villkor som motsvarar den högsta poängen. Dessa representativa poängbilder som finns i figur 1 i artikeln som är associerad med den här videon kan användas som referens.

För att demonstrera poängsättning kommer vi att gå igenom att tilldela poäng till några exempel neuronbilder. Börja med den översta mest dendriten, det finns inga synliga blebs, raster eller oegentligheter. Tilldela en poäng på noll.

Den andra dendriten har cirka 14 blebs och inga synliga pauser. Tilldela en poäng på fyra. Den tredje dendriten kan inte ses i sin helhet på grund av överlappning med dendrite två och kan inte poängsättas.

Den lägsta mest dendriten har cirka 11 blebs och några pauser. Tilldela en poäng på fem. I den här bilden är endast tre dendriter brännbara, eftersom en dendrit inte fångades helt i z-stack-fångsten.

Det finns inget blebbing på de tre synliga dendriterna. Så detta skulle poängsättas från topp till botten som en nolla, en nolla och på grund av kink här, en. Slutligen, i den här bilden är alla fyra dendriter mer än 75%förlorade.

Alla dendriter här får sex poäng. Spela in alla poäng. Poängen kan vara olänkade just nu.

Poängmallen som används här finns i tilläggsfilerna. Dividera neurodegeneration poäng tallies med det totala antalet dendriter poäng i behandlingsgruppen. Presentera data som andel dendriter inom behandlingsgruppen vid varje neurodegenerationpoäng.

Vårt poängsystem användes för att bedöma neurodegeneration i L4 larval stadium BY200 C.elegans efter rotenone exponering. Data visas här som med proportionerna av det totala antalet dendriter vid varje poängvärde för varje experimentell grupp. Vi anser att varje dendrit görs som n 1.

I denna siffra kan ett dosberoende neurodegenerationsvar på rotenonexponering uppskattas, och den specifika uppdelningen av poängfördelningen visas tydligt. Dessa experimentella grupper var statistiskt olika enligt ett Chi-kvadratiskt test för oberoende kompletterat med en Bonferroni korrigering för flera jämförelser. I den här videon har vi visat hur man använder den sjupunktsskala som utvecklats i vårt laboratorium för att kvantifiera nivåerna av dopaminerg neuron morfologisk förändring och degeneration i C.elegans.

Att använda poängsättningsmetoden främjar konsekvens i analysen och möjliggör jämförelse mellan neurodegenerationforskningsstudier i maskar. Vårt poängsystem kan användas för att analysera data som härrör från C.elegans experiment som använder cellspecifika fluorescerande reportrar, såsom dat-1 dopamin transportör gen som möjliggör visualisering av dopaminerga nervceller. Hitta nu en övningsuppsättning bilder med kommentarer som kan användas för att träna, kalibrera och bedöma poängkonsistensen hos forskare som är nya för denna metod i den här artikelns kompletterande material.