Name: measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R35GM119528 إلى روبرتا ليوناردي.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية على الفئران (C57BL/6J ، الذكور ، 9-11 أسبوعا من العمر) من قبل اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) بجامعة ويست فرجينيا.
1. عزل خلايا الكبد
<ol><li>اعداد<ol>
<li>في الأيام التي تسبق عزل خلايا الكبد، قم بإعداد المخازن المؤقتة ووسائط زر...

<ol>
	<li>Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Metabolism+in+the+Liver.">Triglyceride Metabolism in the Liver.</a> Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease.">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).</li><li>Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+organization+of+peroxisomal+beta-oxidation.">Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).</li><li>Kerner, J., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+import+into+mitochondria.">Fatty acid import into mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).</li><li>Baker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+ABC+transporters:+functions+and+mechanism.">Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism.</a> Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PloS One. 5 (6), 11107 (2010).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).</li><li>Richert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+human+hepatocytes+in+suspension+after+isolation+is+similar+to+the+liver+of+origin,+is+not+affected+by+hepatocyte+cold+storage+and+cryopreservation,+but+is+strongly+changed+after+hepatocyte+plating.">Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating.</a> Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).</li><li>Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+expression+of+hepatocyte+protein+gene-products+associated+with+adaptation+of+cells+to+primary+culture.">Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture.</a> Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).</li><li>Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flux+control+coefficient+of+carnitine+palmitoyltransferase+I+on+palmitate+beta-oxidation+in+rat+hepatocyte+cultures.">The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures.</a> Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).</li><li>Consitt, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+coactivator-1alpha+overexpression+increases+lipid+oxidation+in+myocytes+from+extremely+obese+individuals.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals.</a> Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).</li><li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure.">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).</li><li>Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+etomoxiryl-CoA+on+different+carnitine+acyltransferases.">Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases.</a> Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+of+palmitate+change+during+postnatal+development+and+food+deprivation+in+liver,+kidney+and+heart+of+pigs.">Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs.</a> Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+hepatic+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+to+increasing+palmitate+concentrations+in+piglets.">Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets.</a> Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).</li><li>Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+rat+and+human+tissues.+Effect+of+nutritional+state,+clofibrate+treatment+and+postnatal+development+in+the+rat.">Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).</li><li>Hakvoort, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interorgan+coordination+of+the+murine+adaptive+response+to+fasting.">Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).</li><li>Sokolovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptomic+signature+of+fasting+murine+liver.">The transcriptomic signature of fasting murine liver.</a> BMC Genomics. 9, 528 (2008).</li><li>Kersten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+mediates+the+adaptive+response+to+fasting.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Rat+Hepatocytes+with+Multiparameter+Perfusion+Control.">Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).</li><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes.">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li><li>Bougarne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+blocks+glucocorticoid+receptor+alpha-mediated+transactivation+but+cooperates+with+the+activated+glucocorticoid+receptor+alpha+for+transrepression+on+NF-kappaB.">PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).</li></ol>

أثناء تروية الكبد ، من الأهمية بمكان تجنب إدخال فقاعات الهواء ، لأنها تمنع الشعيرات الدموية الدقيقة في الكبد ، مما يمنع أو يقيد الدورة الدموية العازلة ويقلل بشكل عام من غلة خلايا الكبد وقابليتها للحياة20,21. يمكن للاحتياطات ، مثل فحص خط المدخل المملوء بالمخز?...

الأحماض الدهنية β الأكسدة هي عملية أساسية في استقلاب الدهون ، مما يوفر مسارا تقويضيا لتحقيق التوازن بين تخليق الأحماض الدهنية وتناولها من النظام الغذائي. تولد هذه العملية الطاقة لأعضاء متعددة ، بما في ذلك عضلة القلب وقشرة الكلى والكبد الصائم ، وتستخدم الأحماض الدهنية التي تم الحصول عليها من النظام الغذائي ، وتحلل الدهون في الأنسجة الدهنية ، ومخازن الدهون الثلاثية الداخلية 1,2.
تؤدي أكسدة الأحماض الدهنية من خلال مسار أكسدة β إلى تقصير متسلسل لسلسلة الأسيل الدهني بواسطة كربونين في وقت واحد ، يتم إطلاقهما على شكل أسيتيل CoA ، وتحدث هذه العملية في كل من الميتوكوندريا والبيروكسيزومات. في حين أن معظم الأحماض الدهنية تخضع فقط β الأكسدة ، فإن بعضها يتأكسد عند كربونات مختلفة قبل الدخول في هذا المسار. على سبيل المثال ، تخضع الأحماض الدهنية التي يستبدلها 3 ميثيل ، مثل حمض الفيتانيك ، لإزالة كربون واحد عن طريق أكسدة α في البيروكسيزومات قبل الدخول في مسار أكسدة β. وبالمثل ، يتم تحويل بعض الأحماض الدهنية أولا إلى أحماض دهنية ثنائية الكربوكسيل عن طريق أكسدة مجموعة الميثيل الطرفية (ω-oxidation) في الشبكة الإندوبلازمية قبل أن تتأكسد بشكل تفضيلي في البيروكسيزومات عن طريق أكسدة β3.
بغض النظر عن العضية المحددة ، يجب أولا تحويل الحمض الدهني إلى ثيوستر مساعد للإنزيم A (CoA) ، أو acyl-CoA ، ليتم أكسدته من خلال مسار أكسدة β. β-أكسدة الأسيل CoAs طويل السلسلة في مصفوفة الميتوكوندريا يتطلب مكوك كارنيتين لنقلها ، حيث يحفز كارنيتين بالميتويل ترانسفيراز 1 (CPT1) تحويل acyl-CoAs إلى acylcarnitines وهو الإنزيم الذي يحد من المعدل في هذه العملية4. بمجرد نقلها إلى مصفوفة الميتوكوندريا ، يتم إعادة تشكيل acyl-CoAs وتعمل كركائز لآلية أكسدة β الميتوكوندريا. في حالة الصيام ، يتم توجيه الأسيتيل CoA الناتج عن طريق أكسدة β في الميتوكوندريا الكبدية في المقام الأول إلى تكوين الكيتون. تعمل البيروكسيزومات كموقع أساسي للأكسدة β للأحماض الدهنية طويلة السلسلة والمتفرعة السلسلة وثنائية الكربوكسيل. لا تتطلب البيروكسيزومات مكوك الكارنيتين لاستيراد ركائز الأحماض الدهنية ، وبدلا من ذلك استيراد المراسل acyl-CoAs من خلال نشاط ناقلات الكاسيت المرتبطة ب ATP (ABC) ABCD1-35. داخل البيروكسيزومات ، يتم بعد ذلك أكسدة acyl-CoAs بواسطة مجموعة مخصصة من الإنزيمات ، متميزة عن الأحماض الدهنية الميتوكوندريا β الأكسدة. تتطلب كل من الميتوكوندريا والبيروكسيزومات أيضا إمدادات من NAD+ و CoA مجانا لأكسدة سلاسل الأسيل الدهنية. وقد ثبت أن مستويات CoA في الكبد تزداد استجابة للصيام ، مما يدعم زيادة معدل أكسدة الأحماض الدهنية التي تحدث في هذه الحالة6. علاوة على ذلك ، تؤدي زيادة تدهور CoA في البيروكسيزومات إلى انخفاض انتقائي في أكسدة الأحماض الدهنية البيروكسيسومية7. لذلك ، يتم تنظيم عملية أكسدة الأحماض الدهنية داخل الخلية من خلال مستويات التعبير وأنشطة الإنزيمات المشاركة في تنشيط ونقل وأكسدة الأحماض الدهنية ، وكذلك تركيزات العوامل المساعدة والمستقلبات الأخرى في جميع أنحاء مقصورات متعددة دون الخلايا.
الإجراءات التي تستخدم متجانسات الأنسجة لقياس أكسدة الأحماض الدهنية تدمر البنية الخلوية التي تنظم وتدعم هذه العملية ، مما يؤدي إلى جمع البيانات التي لا تعكس بدقة عملية التمثيل الغذائي في الجسم الحي. في حين أن التقنيات التي تستخدم خلايا الكبد الأولية المطلية تحافظ على هذا النظام ، فإن زراعة الخلايا المعزولة لفترات طويلة من الزمن تؤدي إلى فقدان ملف التعبير الجيني في الجسم الحي الذي كان موجودا في الخلايا عندما كانت لا تزال تعيش داخل الحيوان 8,9. يصف البروتوكول التالي طريقة لعزل خلايا الكبد الأولية وفحص قدرتها على أكسدة الأحماض الدهنية مباشرة β بعد العزل وفي التعليق ، باستخدام [1-14C] حمض البالمتيك. يعتمد الفحص على قياس النشاط الإشعاعي المرتبط بمستقلبات الحمض القابلة للذوبان (ASM) أو المنتجات ، مثل الأسيتيل CoA ، التي تنتجها الأكسدة β [1-14C] حمض البالمتيك10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(R)-(+)-Etomoxir sodium salt</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4539/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]-Palmitic acid, 50&#8211;60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals</td>
			<td>ARC 0172A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L, 200 &#181;L, and 10 &#181;L pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Perchloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A2296-1LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fatty acid-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>E-217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200CSPP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, 0.22 &#956;m PES Filter, 500 mL, Sterile</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulphate</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G-400-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDPE, 6.5 mL scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-342-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles 22 G, 1.5 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM Research Grade</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>accuSpin Micro 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>424270010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette MR-10, 10 &#181;L</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>TriCarb 4810 TR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScintiVerse BD cocktail</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath, 30 L capacity</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Model G76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thumb Dressing Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-8120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable-flow peristaltic pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>138762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water baths, 2&#8211;2.5 L capacity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes

الأحماض الدهنية β الأكسدة هو مسار استقلابي رئيسي لتلبية متطلبات الطاقة في الكبد وتوفير الركائز والعوامل المساعدة لعمليات إضافية ، مثل تكوين الكيتون وتكوين الجلوكوز ، والتي تعد ضرورية للحفاظ على توازن الجلوكوز في الجسم كله ودعم وظيفة العضو خارج الكبد في حالة الصيام. يحدث أكسدة β الأحماض الدهنية داخل الميتوكوندريا والبيروكسيزومات ويتم تنظيمها من خلال آليات متعددة ، بما في ذلك امتصاص وتنشيط الأحماض الدهنية ، ومستويات التعبير عن الإنزيم ، وتوافر العوامل المساعدة مثل الإنزيم المساعد A و NAD +. في الفحوصات التي تقيس أكسدة الأحماض الدهنية β في متجانسات الكبد ، يخفي تحلل الخلايا والإضافة الشائعة للمستويات فوق الفسيولوجية للعوامل المساعدة آثار هذه الآليات التنظيمية. علاوة على ذلك ، من الصعب التحكم في سلامة العضيات في المتجانسات ويمكن أن تختلف اختلافا كبيرا بين المستحضرات. قياس الأحماض الدهنية β الأكسدة في خلايا الكبد الأولية السليمة يتغلب على المزالق المذكورة أعلاه. يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس أكسدة الأحماض الدهنية β في تعليق خلايا الكبد الأولية للفئران المعزولة حديثا والمحتضنة ب 14حمض بالمتيك المسمى C. من خلال تجنب ساعات إلى أيام من الثقافة ، تتمتع هذه الطريقة بميزة الحفاظ بشكل أفضل على مستويات التعبير عن البروتين ونشاط المسار الأيضي للكبد الأصلي ، بما في ذلك تنشيط الأحماض الدهنية β الأكسدة التي لوحظت في خلايا الكبد المعزولة من الفئران الصائمة مقارنة بالفئران التي تم إطعامها.

عادة ما ينتج عن تروية الكبد الموصوفة هنا 30-40 مليون خلية / كبد بمتوسط صلاحية يبلغ 80٪ ، كما هو مقدر من خلال استبعاد التربان الأزرق (الشكل 2). التركيز النموذجي للجلوكوز في المخزن المؤقت Krebs-Henseleit (KHB) ، والذي يستخدم لإعداد المخازن المؤقتة للتروية 1 و 2 ، هو 11 mM. عند قياس أكسدة β الأحم?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

Measurement of Fatty Acid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

الأحماض الدهنية β الأكسدة هو مسار استقلابي أساسي مسؤول عن توليد الطاقة في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك خلايا الكبد. هنا ، نصف طريقة لقياس أكسدة β الأحماض الدهنية في خلايا الكبد الأولية المعزولة حديثا باستخدام 14حمض بالمتيك المسمى C.

قياس الأحماض الدهنية β الأكسدة في تعليق خلايا الكبد الفئران المعزولة حديثا

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

تم تطوير هذا البروتوكول لتوفير طريقة قوية لقياس إجمالي أكسدة بيتا للميتوكوندريا والأحماض الدهنية البيروكسيزومية في خلايا الكبد الأولية للفئران. يحافظ استخدام الخلايا السليمة على سلامة العضيات والآليات التنظيمية المعمول بها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن فحص خلايا الكبد المعزولة حديثا يقلل من التغيرات في التعبير الجيني فيما يتعلق بكبد المنشأ.يمكن أن تكون الجراحة صعبة. عليك أن تكون واثقا ومجتهدا ومركزا. بمجرد نجاح القنية ، حاول الاسترخاء ، ولكن انتبه وراقب جودة التروية.لبدء الإجراء ، قم برش بطن وصدر الفأر المخدر بحرية باستخدام 70٪ من الإيثانول. ثم استخدم الملقط لسحب الجلد وجدار البطن بالقرب من قاعدة البطن وقطعه أفقيا على جانبي خط الوسط وحتى الحجاب الحاجز لفضح الأعضاء. كشف الوريد الأجوف السفلي ، أو IVC ، عن طريق تحريك الأمعاء إلى الجانب الأيمن وقلب فصوص الكبد بلطف لأعلى.أدخل جسما أسطوانيا صغيرا ، مثل غطاء إبرة ، تحت الجزء الخلفي من الماوس لإمالة IVC قليلا وتسهيل التعليب. بعد بدء تشغيل المضخة باستخدام المخزن المؤقت بأقل سرعة ، أدخل الإبرة في IVC. ثم قطع الوريد البابي لتخفيف الضغط والسماح بتصريف الدم والمخازن المؤقتة للتروية.قبل زيادة معدل التدفق إلى سبعة مل في الدقيقة. قم بدمج الكبد بمخزن مؤقت دافئ وتأكد من أن الخط الذي يتم إدخاله في الأنبوب الذي يحتوي على المخزن المؤقت الأول يظل مغمورا باستمرار لتجنب إدخال فقاعات الهواء. أثناء حدوث التروية ، أضف 130 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز لتخزين اثنين مؤقتا ، واخلطه عن طريق السحب باستخدام ماصة مصلية.عندما ينخفض الحجم في الأنبوب الذي يحتوي على المخزن المؤقت واحد إلى حوالي خمسة مل ، أضف ببطء خمسة مل من المخزن المؤقت اثنين إلى التخزين المؤقت واحد عن طريق السحب على جانب الأنبوب. كرر الإضافة مرتين قبل إضافة المخزن المؤقت المتبقي إلى الأنبوب. أوقف التروية عند ترك حوالي 5 إلى 10 مل من المخزن المؤقت اثنين في الأنبوب.ثم قم باستئصال الكبد ونقله إلى طبق زراعة 100 مل الذي يحتوي على 20 مل من المخزن المؤقت للثلج والبارد اثنين. تحت غطاء التدفق الرقائقي، قم بتكسير أنسجة الكبد بلطف باستخدام المقص الجراحي والملقط. بعد ذلك ، أضف حوالي 20 مل من المخزن المؤقت M199 البارد إلى تعليق خلايا الكبد وقم بتصفيته من خلال مصفاة خلايا 100 ميكرون باستخدام مكبس حقنة لتعزيز إطلاق خلايا كبدية إضافية بلطف من قطع الكبد الأكبر.اغسل طبق زراعة 100 مل ومصفاة الخلية باستخدام المخزن المؤقت M199 لجمع تعليق الخلية حتى يمتلئ أنبوب التجميع. ثم الطرد المركزي للتعليق عند 50 × g لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. قم بشفط المادة الفائقة قبل إعادة تعليق بيليه خلايا الكبد في 30 مل من M199 البارد عن طريق الدوام .كرر الغسيل مرة واحدة. قم بإذابة حمض البالمتيك وألبومين مصل البقر ، أو BSA ، قبل تحضير خليط الركيزة لتفاعلات متعددة. Aliquot 13.5 ميكرولتر من محلول BSA لكل تفاعل في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.بعد تسخين الأنبوب إلى 41 درجة مئوية ، أضف ميكرولتر واحد من محلول حمض البالمتيك 200 mM لكل تفاعل. دوامة الأنبوب بقوة قبل وأثناء الحضانة عند 41 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة لتسهيل تكوين مركب حمض البالمتيك BSA القابل للذوبان. خلال هذا الوقت ، أليكوت 133 ميكرولتر من 1 م من حمض البيركلوريك الذي سيتم استخدامه لوقف التفاعلات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المنفصلة 1.5 مل.قبل البدء في التفاعلات ، قم باحتضان 485.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت M199 لكل تفاعل في أنبوب عند 37 درجة مئوية لتخفيف مركب حمض البالمتيك BSA-Palmitic المشع المحضر. بعد ذلك ، قم بتوزيع 750 ميكرولتر من M199 مع أو بدون مثبطات في الأنابيب السفلية المستديرة المنفصلة سعة 14 مل كعينات. أثناء خطوات غسل خلايا الكبد ، قبل 10 إلى 15 دقيقة من بدء التفاعلات ، انقل الأنابيب إلى حمام مائي مهتز مضبوط على 37 درجة مئوية عند 180 إلى 200 دورة في الدقيقة.إذا كانت صلاحية خلايا الكبد 75٪ على الأقل ، أكمل إعداد مزيج الركيزة عن طريق نقل 0.8 ميكرولتر من حمض البالمتيك الكربون-14 لكل تفاعل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على محلول حمض البالمتيك BSA-Palmitic الموضح. دوامة قبل إعادة الأنبوب إلى الحمام المائي عند 41 درجة مئوية. مباشرة بعد إعادة التعليق النهائي لخلايا الكبد ، قم بنقل 750 ميكرولتر من تعليق خلايا الكبد إلى كل من الأنابيب السفلية المستديرة سعة 14 مل في الحمام المائي المهتز باستخدام ماصة واحدة مل ودوامة الأنابيب لفترة وجيزة بسرعة منخفضة قبل نقلها إلى حاضنة ، مما يذهل كل إضافة بمقدار 30 ثانية.انقل أليكوت منفصل من خلايا الكبد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل للدوران عند 3000 × جم لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الفائقة قبل تخزين الكريات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لقياس إجمالي كمية البروتين في العينة لتطبيع النتائج. في حين أن خلايا الكبد تحت الحضانة قبل 37 درجة مئوية ، أضف مركب حمض البالمتيك BSA-Palmitic المشع إلى الوسط الدافئ للحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا لبدء التفاعلات.لبدء التفاعلات ، قم بإزالة خلايا الكبد من الحمام المائي وإضافة 500 ميكرولتر من مزيج الركيزة إلى خلايا الكبد. دوامة الخلايا بسرعة منخفضة لمدة خمس ثوان قبل العودة إلى الحمام المائي لاحتضانها لمدة 15 دقيقة. ابدأ مجموعة من التفاعلات وتوقف فورا لتحديد النشاط الإشعاعي في الخلفية.انقل وخصص الأليكوتات المكررة من 200 إلى 250 ميكرولتر من مزيج الركيزة المتبقية في قوارير تلألؤ 6 مل لإجراء العد. لوقف التفاعلات ، قم بإزالة خلايا الكبد من الحمام المائي لإعادة تعليقها عن طريق الدوامة بسرعة معتدلة ثم نقل 400 ميكرولتر من تعليق خلايا الكبد إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على حمض البيركلوريك. قم بتغطية الأنابيب ودوامتها على الفور قبل تكرار التسلسل لجميع العينات ، مما يؤدي إلى التذبذب لمدة 30 ثانية.بعد الدوران أسفل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل عند 13،000 × غرام لمدة 10 دقائق ، انقل 300 ميكرولتر من السوبرنات إلى قارورة تلألؤ 6 مل وأضف 4 مل من سائل التلألؤ لحساب النشاط الإشعاعي في العينات ومزيج الركيزة aliquots في عداد اللمعان. في الدراسة ، أنتجت تروية الكبد 30 إلى 40 مليون خلية لكل كبد ، بمتوسط صلاحية 80٪ لوحظ أيضا أن خفض تركيز الجلوكوز في مجموعة الصيام لم يكن له أي تأثير سلبي على غلة أو بقاء خلايا الكبد. تم فحص تعليق خلايا الكبد ، المعزولة عن الفئران الذكور التي تم تغذيتها وصيامها ، لقدرة أكسدة بيتا للأحماض الدهنية في وجود وغياب الإيتوموكسير ، وهو مثبط قوي ل CPT1 وأكسدة الأحماض الدهنية الميتوكوندريا.تختلف الأعداد في الدقيقة ، أو CPM ، المرتبطة بالنشاط الإشعاعي في الخلفية مع دفعة حمض البالمتيك. ومع ذلك ، كان CPM لا يزال أقل بكثير من العينات المحتضنة مع مزيج الركيزة. تظهر خلايا الكبد المعزولة من الفئران الصائمة زيادة قوية في معدلات أكسدة بيتا للأحماض الدهنية الميتوكوندريا والبيروكسيزوما.تمت دراسة البيانات بشكل أكبر لتحديد معدل أكسدة حمض البالمتيك في خلايا الكبد المعزولة من الفئران التي تتغذى وتصوم. منع الفقاعات من دخول الخط. حافظ على ثبات الإبرة أثناء التروية.كن لطيفا عند التعامل مع خلايا الكبد. احتفظ بها معلقة عند توزيعها. يمكن استخدام خلايا الكبد المعزولة من هذا الإجراء كتعليق لفحص المسارات الأيضية الأخرى ، مثل تخليق الأحماض الدهنية ، أو يمكن طلاؤها لتجارب زراعة الخلايا.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

تحديد الأحماض الدهنية في<em&gt; العصوية الشمعية</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

التحلل من شيف-قاعدة ني مجمع الظروف عن طريق مناسبة للاحتباس حماية المجموعات حمض عطوب

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

تنقية خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد الماوس التروية

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

13ج الأحماض الدهنية إيسوتوبولوجوي التنميط يوفر نظرة ثاقبة نقل الكربون التغذوية والايض الدهني للمستهلكين اللافقاريات

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

تحليلات لتدفق الكالسيوم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المستزرعة

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

دينامية البروتين وميرنا "تحليل بوليسوميس" من "قلب الفأرة متفرقة بعد نضح لانجيندورف"

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

دراسة عن الأيض من المبيدات الحشرية النظامية الستة في ثقافة تعليق الخلية المنشأة حديثا المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) يترك

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

عزل جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج لدراسة دمج الأحماض الدهنية المسببة للأمراض البكتيرية في الدهون الفوسفاتية الغشاء

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

الفحص الحركي للنشاط النواسي باستخدام مجسات الحمض النووي

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...