Name: measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-bevillingen R35GM119528 til Roberta Leonardi.

Alle eksperimentelle procedurer på mus (C57BL /6J, mænd, 9-11 uger gamle) blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved West Virginia University.
1. Hepatocytisolering
<ol><li>Præparation<ol>
<li>I dagene før hepatocytisoleringen skal du forberede bufferne og cellekulturmedierne, der er anført i tabel 1. Opret et vandbad med temperaturen indstillet til 37 ° C tæt på, hvor operationen skal udføres.</li>
		<li>På dagen for hepatocytisoleri...

<ol>
	<li>Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Metabolism+in+the+Liver.">Triglyceride Metabolism in the Liver.</a> Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease.">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).</li><li>Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+organization+of+peroxisomal+beta-oxidation.">Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).</li><li>Kerner, J., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+import+into+mitochondria.">Fatty acid import into mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).</li><li>Baker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+ABC+transporters:+functions+and+mechanism.">Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism.</a> Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PloS One. 5 (6), 11107 (2010).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).</li><li>Richert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+human+hepatocytes+in+suspension+after+isolation+is+similar+to+the+liver+of+origin,+is+not+affected+by+hepatocyte+cold+storage+and+cryopreservation,+but+is+strongly+changed+after+hepatocyte+plating.">Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating.</a> Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).</li><li>Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+expression+of+hepatocyte+protein+gene-products+associated+with+adaptation+of+cells+to+primary+culture.">Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture.</a> Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).</li><li>Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flux+control+coefficient+of+carnitine+palmitoyltransferase+I+on+palmitate+beta-oxidation+in+rat+hepatocyte+cultures.">The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures.</a> Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).</li><li>Consitt, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+coactivator-1alpha+overexpression+increases+lipid+oxidation+in+myocytes+from+extremely+obese+individuals.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals.</a> Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).</li><li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure.">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).</li><li>Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+etomoxiryl-CoA+on+different+carnitine+acyltransferases.">Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases.</a> Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+of+palmitate+change+during+postnatal+development+and+food+deprivation+in+liver,+kidney+and+heart+of+pigs.">Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs.</a> Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+hepatic+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+to+increasing+palmitate+concentrations+in+piglets.">Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets.</a> Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).</li><li>Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+rat+and+human+tissues.+Effect+of+nutritional+state,+clofibrate+treatment+and+postnatal+development+in+the+rat.">Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).</li><li>Hakvoort, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interorgan+coordination+of+the+murine+adaptive+response+to+fasting.">Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).</li><li>Sokolovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptomic+signature+of+fasting+murine+liver.">The transcriptomic signature of fasting murine liver.</a> BMC Genomics. 9, 528 (2008).</li><li>Kersten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+mediates+the+adaptive+response+to+fasting.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Rat+Hepatocytes+with+Multiparameter+Perfusion+Control.">Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).</li><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes.">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li><li>Bougarne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+blocks+glucocorticoid+receptor+alpha-mediated+transactivation+but+cooperates+with+the+activated+glucocorticoid+receptor+alpha+for+transrepression+on+NF-kappaB.">PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).</li></ol>

Under leverperfusionen er det afgørende at undgå introduktion af luftbobler, da de blokerer mikrokapitalillærerne i leveren, forhindrer eller begrænser buffercirkulationen og generelt reducerer hepatocytudbyttet og levedygtigheden20,21. Forholdsregler, såsom nøje inspektion af den bufferfyldte indløbsledning før cannulation af IVC og undgå at løfte indløbsledningen fra røret indeholdende Buffer 1 for at skifte til Buffer 2, som beskrevet heri, kan med...

Fedtsyre β-oxidation er en vigtig proces i lipidmetabolisme, hvilket giver en katabolisk vej til at balancere fedtsyresyntese og indtag fra kosten. Denne proces genererer energi til flere organer, herunder hjertemusklen, nyrebarken og fastende lever, og udnytter fedtsyrer opnået fra kosten, fedtvævslipolyse og interne triglyceridlagre 1,2.
Oxidation af fedtsyre gennem β-oxidationsvejen resulterer i sekventiel forkortelse af fedt acylkæden med to carbonatomer ad gangen, frigivet som acetyl-CoA, og denne proces forekommer både i mitokondrierne og peroxisomerne. Mens de fleste fedtsyrer kun gennemgår β-oxidation, oxideres nogle ved forskellige carbonatomer, før de kommer ind i denne vej. For eksempel gennemgår 3-methylsubstituerede fedtsyrer, såsom phytaninsyre, fjernelse af et kulstof ved α-oxidation i peroxisomerne, inden de kommer ind i β-oxidationsvejen. Tilsvarende omdannes nogle fedtsyrer først til dicarboxylfedtsyrer ved oxidation af den terminale methylgruppe (ω-oxidation) i det endoplasmatiske retikulum, før de fortrinsvis oxideres i peroxisomerne ved β-oxidation3.
Uanset den specifikke organel skal en fedtsyre først omdannes til en coenzym A (CoA) thioester eller acyl-CoA, der skal oxideres gennem β-oxidationsvejen. β-oxidation af langkædede acyl-CoA'er i mitokondriematrixen kræver carnitin-shuttle til deres translokation, hvor carnitinpalmeitoyltransferase 1 (CPT1) katalyserer omdannelsen af acyl-CoAs til acylcarnitiner og er det hastighedsbegrænsende enzym i denne proces4. Når de er translokeret til mitokondriematrixen, omformes acyl-CoA'erne og tjener som substrater for mitokondrie- β-oxidationsmaskineriet. I fastende tilstand kanaliseres acetyl-CoA produceret gennem β-oxidation i lever mitokondrier primært til ketogenese. Peroxisomer tjener som det primære sted for β-oxidation af meget langkædede, forgrenede og dicarboxylfedtsyrer. Peroxisomer kræver ikke carnitin shuttle til at importere fedtsyre substrater, i stedet importere korrespondent acyl-CoAs gennem aktiviteten af ATP-bindende kassette (ABC) transportører ABCD1-35. Inden for peroxisomerne oxideres acyl-CoAs derefter af et dedikeret sæt enzymer, der adskiller sig fra mitokondriefedtsyren β-oxidationsmaskineriet. Både mitokondrier og peroxisomer kræver også en forsyning af NAD + og fri CoA for at oxidere fede acylkæder. CoA-niveauer i leveren har vist sig at stige som reaktion på faste, hvilket understøtter den øgede hastighed af fedtsyreoxidation, der forekommer i denne tilstand6. Desuden resulterer øget CoA-nedbrydning i peroxisomerne i et selektivt fald i peroxisomal fedtsyreoxidation7. Derfor reguleres processen med fedtsyreoxidation i cellen af ekspressionsniveauer og aktiviteter af enzymer involveret i aktivering, transport og oxidation af fedtsyrer samt koncentrationerne af cofaktorer og andre metabolitter gennem flere subcellulære rum.
Procedurer, der bruger vævshomogenater til måling af fedtsyreoxidation, ødelægger den cellulære arkitektur, der regulerer og understøtter denne proces, hvilket fører til en indsamling af data, der ikke nøjagtigt afspejler in vivo-metabolismen. Mens teknikker, der bruger belagte primære hepatocytter, bevarer dette system, resulterer dyrkning af isolerede celler i længere tid i et tab af in vivo-genekspressionsprofilen, der var til stede i cellerne, da de stadig levede i dyret 8,9. Følgende protokol beskriver en metode til at isolere primære hepatocytter og analysere deres kapacitet for fedtsyre β-oxidation umiddelbart efter isolering og i suspension ved anvendelse af [1-14C] palmitinsyre. Assayet er baseret på måling af den radioaktivitet, der er forbundet med de syreopløselige metabolitter (ASM) eller produkter, som acetyl-CoA, produceret ved β-oxidation af [1-14C] palmitinsyre10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(R)-(+)-Etomoxir sodium salt</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4539/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]-Palmitic acid, 50&#8211;60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals</td>
			<td>ARC 0172A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L, 200 &#181;L, and 10 &#181;L pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Perchloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A2296-1LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fatty acid-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>E-217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200CSPP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, 0.22 &#956;m PES Filter, 500 mL, Sterile</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulphate</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G-400-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDPE, 6.5 mL scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-342-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles 22 G, 1.5 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM Research Grade</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>accuSpin Micro 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>424270010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette MR-10, 10 &#181;L</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>TriCarb 4810 TR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScintiVerse BD cocktail</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath, 30 L capacity</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Model G76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thumb Dressing Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-8120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable-flow peristaltic pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>138762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water baths, 2&#8211;2.5 L capacity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes

Fedtsyre β-oxidation er en vigtig metabolisk vej til at imødekomme leverens energibehov og tilvejebringe substrater og cofaktorer til yderligere processer, såsom ketogenese og glukoneogenese, som er afgørende for at opretholde hele kroppen glucosehomeostase og understøtte ekstra-leverorganfunktion i fastende tilstand. Fedtsyre β-oxidation forekommer inden for mitokondrier og peroxisomer og reguleres gennem flere mekanismer, herunder optagelse og aktivering af fedtsyrer, enzymekspressionsniveauer og tilgængelighed af cofaktorer såsom coenzym A og NAD +. I assays, der måler fedtsyre β-oxidation i leverhomogenater, maskerer cellelyseis og den almindelige tilsætning af suprafysiologiske niveauer af cofaktorer virkningerne af disse reguleringsmekanismer. Desuden er integriteten af organellerne i homogenaterne svær at kontrollere og kan variere betydeligt mellem præparaterne. Målingen af fedtsyre β-oxidation i intakte primære hepatocytter overvinder ovenstående faldgruber. Denne protokol beskriver en metode til måling af fedtsyre β-oxidation i en suspension af frisk isolerede primære musehepatocytter inkuberet med 14C-mærket palmitinsyre. Ved at undgå timer til dage med kultur har denne metode fordelen ved bedre at bevare proteinekspressionsniveauer og metabolisk vejaktivitet i den oprindelige lever, herunder aktivering af fedtsyre β-oxidation observeret i hepatocytter isoleret fra fastende mus sammenlignet med fodrede mus.

Leverperfusionen beskrevet her giver typisk 30-40 millioner celler / lever med en gennemsnitlig levedygtighed på 80%, som estimeret ved trypan blå udelukkelse (figur 2). Den typiske koncentration af glucose i Krebs-Henseleit-bufferen (KHB), som bruges til at forberede perfusionsbuffere 1 og 2, er 11 mM. Ved måling af fedtsyre β-oxidation i hepatocytter isoleret fra fastende mus, kan koncentrationen af glucose i KHB sænkes for bedre at repræsentere den fastende tilstand. Som vist i <str...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

Measurement of Fatty Acid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fedtsyre β-oxidation er en væsentlig metabolisk vej, der er ansvarlig for at generere energi i mange forskellige celletyper, herunder hepatocytter. Her beskriver vi en metode til måling af fedtsyre β-oxidation i frisk isolerede primære hepatocytter ved anvendelse af 14C-mærket palmitinsyre.

Måling af fedtsyre β-oxidation i en suspension af frisk isolerede musehepatocytter

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Denne protokol blev udviklet for at give en robust metode til måling af total mitokondrie og peroxisomal fedtsyre beta-oxidation i primære musehepatocytter. Brugen af intakte celler opretholder organelintegritet og reguleringsmekanismerne på plads. Derudover minimerer analyse af frisk isolerede hepatocytter ændringer i genekspression med hensyn til oprindelseslever.Operationen kan være udfordrende. Du skal være selvsikker, flittig og fokuseret. Når kannulationen er vellykket, prøv at slappe af, men vær opmærksom og overvåg kvaliteten af perfusionen.For at starte proceduren skal du sprøjte maven og brystet på den bedøvede mus med 70% ethanol. Brug derefter tangen til at trække huden og mavevæggen op nær bunden af maven og skær sideværts på hver side af midterlinjen og op til membranen for at udsætte organerne. Udsæt den ringere vena cava eller IVC ved at flytte tarmene til højre side og forsigtigt vende leverens lobes op.Indsæt en lille cylindrisk genstand, såsom en nålehætte, under bagsiden af musen for at vippe IVC let og lette kannulationen. Når pumpen er startet med buffer en ved den laveste hastighed, skal du indsætte nålen i IVC. Skær derefter portalvenen for at lette trykket og tillade dræning af blod og perfusionsbuffere.Før du øger strømningshastigheden til syv ml pr. Minut. Gennemfør leveren med varm buffer en og sørg for, at linjen indsat i røret indeholdende buffer en forbliver kontinuerligt nedsænket for at undgå at indføre luftbobler. Mens perfusion forekommer, tilsættes 130 mikroliter collagenaseopløsning til buffer to og blandes ved pipettering med en serologisk pipette.Når volumenet i røret, der indeholder buffer et, falder til ca. fem ml, tilsættes langsomt fem ml buffer to til buffer en ved pipettering på siden af røret. Gentag tilsætningen to gange, før du tilføjer den resterende buffer to til røret. Stop perfusionen, når der er ca. 5 til 10 ml buffer to tilbage i røret.Skær derefter leveren ud og overfør den til 100 ml kulturskål indeholdende 20 ml iskold buffer to. Under den laminære flowhætte skal du forsigtigt bryde levervævet fra hinanden ved hjælp af kirurgisk saks og pincet. Derefter tilsættes ca. 20 ml iskold M199-buffer til hepatocytternes suspension og filtreres gennem en 100 mikron cellesi ved hjælp af stemplet på en sprøjte for forsigtigt at fremme frigivelsen af yderligere hepatocytter fra de større leverstykker.100 ml kulturskålen og cellesien vaskes med M199-buffer for at opsamle cellesuspensionen, indtil opsamlingsrøret er fyldt. Centrifuger derefter suspensionen ved 50 x g i to minutter ved fire grader Celsius. Aspirer supernatanten, før hepatocytpillen genoplives i 30 ml kold M199 ved hvirvling.Gentag vasken en gang. Optø palmitinsyre- og bovint serumalbumin eller BSA-opløsninger, inden substratblandingen fremstilles til flere reaktioner. Aliquot 13,5 mikroliter BSA-opløsning pr. reaktion i et mikrocentrifugerør.Efter opvarmning af røret til 41 grader Celsius tilsættes en mikroliter af 200 mM palmitinsyreopløsningen pr. Reaktion. Vortex røret kraftigt før og under inkubation ved 41 grader Celsius i 20 til 30 minutter for at lette dannelsen af det opløselige palmitinsyre-BSA-kompleks. I løbet af denne tid aliquot 133 mikroliter af 1 M perchlorsyre, som vil blive brugt til at stoppe reaktionerne i separate 1,5 ml mikrocentrifuge rør.Før reaktionerne påbegyndes, aliquot og inkuberes 485,5 mikroliter M199 buffer pr. reaktion i et rør ved 37 grader Celsius for at fortynde det forberedte radioaktive BSA-palmitinsyrekompleks. Derefter udleveres 750 mikroliter M199 med eller uden inhibitorer i de separate 14 ml runde bundrør som prøverne. Under hepatocytvasktrinnene, 10 til 15 minutter før reaktionerne startes, overføres rørene til et rystende vandbad indstillet til 37 grader Celsius ved 180 til 200 rotationer pr. Minut.Hvis hepatocytternes levedygtighed er mindst 75%, fuldføres fremstillingen af substratblandingen ved at overføre 0,8 mikroliter carbon-14 palmitinsyre pr. reaktion på mikrocentrifugerøret indeholdende den klarede BSA-palmitinsyreopløsning. Vortex før du returnerer røret til vandbadet ved 41 grader Celsius. Umiddelbart efter den endelige hepatocytredning overføres 750 mikroliter af hepatocytsuspensionen til hvert af de 14 ml runde bundrør i det rystende vandbad ved hjælp af en ml pipette og hvirvel rørene kort ved lav hastighed, før de overføres til en inkubator, idet hver tilsætning forskydes med 30 sekunder.Overfør en separat aliquot af hepatocytter til et 1,5 ml mikrocentrifugerør for at dreje ved 3000 x g i fem minutter. Fjern supernatanten, før pelleten opbevares ved minus 80 grader Celsius for at måle den samlede mængde protein i prøven for at normalisere resultaterne. Mens hepatocytterne er under præinkubation ved 37 grader Celsius, tilsættes det radioaktive BSA-palmitinsyrekompleks til det varme medium for at holde ved 37 grader Celsius, indtil det er klar til at starte reaktionerne.For at starte reaktionerne skal du fjerne hepatocytterne fra vandbadet og tilsætte 500 mikroliter af substratblandingen til hepatocytterne. Vortex cellerne med lav hastighed i fem sekunder, før de vender tilbage til vandbadet for at inkubere i 15 minutter. Start et sæt reaktioner, og stop straks for at bestemme baggrundsradioaktiviteten.Overfør og sæt de duplikerede aliquoter på 200 til 250 mikroliter af den resterende substratblanding til side i 6 ml hætteglas med scintillation for at udføre tællingen. For at stoppe reaktionerne skal du fjerne hepatocytterne fra vandbadet for at resuspende ved hvirvel ved en moderat hastighed og derefter overføre 400 mikroliter af hepatocytsuspensionen til mikrocentrifugerørene indeholdende perchlorsyre. Hætte og hvirvel straks rørene, før sekvensen for alle prøverne gentages, idet sekvensen forskydes med 30 sekunder.Efter at have drejet 1,5 ml mikrocentrifugerørene ned ved 13.000 x g i 10 minutter, overføres 300 mikroliter af supernatanten til et 6 ml hætteglas med scintillation og tilsættes 4 ml af scintillationsvæsken for at tælle radioaktiviteten i prøverne, og substratet blander aliquoter i en scintillationstæller. I undersøgelsen gav leverperfusionen 30 til 40 millioner celler pr. Lever med en gennemsnitlig levedygtighed på 80%Det blev også observeret, at sænkning af glukosekoncentrationen i fastegruppen ikke havde nogen negativ indvirkning på hepatocytternes udbytte eller levedygtighed. Hepatocytsuspensionen, isoleret fra fodrede og fastede hanmus, blev analyseret for fedtsyre beta-oxidationskapacitet i nærvær og fravær af etomoxir, en potent hæmmer af CPT1 og mitokondriefedtsyreoxidation.Minut eller CPM, der er forbundet med baggrundsradioaktivitet, varierer med batchen af palmitinsyre. CPM var dog stadig signifikant lavere end de prøver, der blev inkuberet med substratblandingen. Hepatocytterne isoleret fra de fastende mus viser en robust stigning i hastigheden af både mitokondrie og peroxisomal fedtsyre beta-oxidation.Dataene blev yderligere undersøgt for at bestemme den hastighed, hvormed palmitinsyre oxideres i hepatocytterne isoleret fra de fodrede og fastende mus. Undgå, at bobler kommer ind i linjen. Hold nålen stabil under perfusionen.Vær forsigtig, når du håndterer hepatocytterne. Opbevar dem i suspension, når du dispenserer dem. Hepatocytterne isoleret fra denne procedure kan anvendes som en suspension til at analysere andre metaboliske veje, såsom fedtsyresyntese, eller de kan belagt til cellekultureksperimenter.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identifikation af fedtsyrer i<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyseprodukter af en Ni-Schiff-Base Complex Brug af betingelser egnet til Bevarelse af syrelabile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Rensning af hepatocytter og sinusformet endotelceller fra mus lever Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fedtsyre 13C Isotopologue profilering giver indblik i trofiske Carbon overførsel og Lipid metabolisme af hvirvelløse forbrugere

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser af mitokondrie Calcium tilstrømning i isolerede mitochondrier og kulturperler celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamisk proteom og miRNA analyse af Polysomes fra isolerede mus hjertet efter Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Undersøgelse af metabolismen af seks systemiske insekticider i en nyetableret celle affjedrings kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) Blade

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering af lipoprotein partikler fra hønseæg æggeblomme til undersøgelse af bakteriel Patogenchlorid fedtsyre inkorporering i membran Fosfolipids

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetisk screening af Nukleaseaktivitet ved hjælp af nukleinsyre sonder

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...