Name: measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie R35GM119528 aan Roberta Leonardi.

Alle experimentele procedures op muizen (C57BL/6J, mannetjes, 9-11 weken oud) werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) van de West Virginia University.
1. Hepatocytenisolatie
<ol><li>Voorbereiding<ol>
<li>Bereid in de dagen vóór de hepatocytenisolatie de buffers en celkweekmedia voor die in tabel 1 zijn vermeld. Richt een waterbad op met de temperatuur ingesteld op 37 °C in de buurt van waar de operatie zal worden uitgevoerd.</li>
		...

<ol>
	<li>Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Metabolism+in+the+Liver.">Triglyceride Metabolism in the Liver.</a> Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease.">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).</li><li>Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+organization+of+peroxisomal+beta-oxidation.">Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).</li><li>Kerner, J., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+import+into+mitochondria.">Fatty acid import into mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).</li><li>Baker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+ABC+transporters:+functions+and+mechanism.">Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism.</a> Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PloS One. 5 (6), 11107 (2010).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).</li><li>Richert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+human+hepatocytes+in+suspension+after+isolation+is+similar+to+the+liver+of+origin,+is+not+affected+by+hepatocyte+cold+storage+and+cryopreservation,+but+is+strongly+changed+after+hepatocyte+plating.">Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating.</a> Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).</li><li>Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+expression+of+hepatocyte+protein+gene-products+associated+with+adaptation+of+cells+to+primary+culture.">Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture.</a> Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).</li><li>Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flux+control+coefficient+of+carnitine+palmitoyltransferase+I+on+palmitate+beta-oxidation+in+rat+hepatocyte+cultures.">The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures.</a> Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).</li><li>Consitt, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+coactivator-1alpha+overexpression+increases+lipid+oxidation+in+myocytes+from+extremely+obese+individuals.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals.</a> Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).</li><li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure.">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).</li><li>Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+etomoxiryl-CoA+on+different+carnitine+acyltransferases.">Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases.</a> Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+of+palmitate+change+during+postnatal+development+and+food+deprivation+in+liver,+kidney+and+heart+of+pigs.">Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs.</a> Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+hepatic+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+to+increasing+palmitate+concentrations+in+piglets.">Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets.</a> Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).</li><li>Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+rat+and+human+tissues.+Effect+of+nutritional+state,+clofibrate+treatment+and+postnatal+development+in+the+rat.">Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).</li><li>Hakvoort, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interorgan+coordination+of+the+murine+adaptive+response+to+fasting.">Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).</li><li>Sokolovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptomic+signature+of+fasting+murine+liver.">The transcriptomic signature of fasting murine liver.</a> BMC Genomics. 9, 528 (2008).</li><li>Kersten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+mediates+the+adaptive+response+to+fasting.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Rat+Hepatocytes+with+Multiparameter+Perfusion+Control.">Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).</li><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes.">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li><li>Bougarne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+blocks+glucocorticoid+receptor+alpha-mediated+transactivation+but+cooperates+with+the+activated+glucocorticoid+receptor+alpha+for+transrepression+on+NF-kappaB.">PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).</li></ol>

Tijdens de leverperfusie is het van cruciaal belang om de introductie van luchtbellen te voorkomen, omdat ze de microcapillairen in de lever blokkeren, de buffercirculatie voorkomen of beperken en over het algemeen de opbrengst en levensvatbaarheid van de hepatocyten verminderen20,21. Voorzorgsmaatregelen, zoals het nauwkeurig inspecteren van de met buffer gevulde inlaatlijn vóór het cannuleren van de IVC en het vermijden van het opheffen van de inlaatlijn van ...

Vetzuur β-oxidatie is een essentieel proces in het lipidenmetabolisme en biedt een katabole route om de vetzuursynthese en inname uit het dieet in evenwicht te brengen. Dit proces genereert energie voor meerdere organen, waaronder de hartspier, de nierschors en de nuchtere lever, en maakt gebruik van vetzuren verkregen uit het dieet, vetweefsellipolie en interne triglyceridenvoorraden 1,2.
Oxidatie van vetzuur door de β-oxidatieroute resulteert in de sequentiële verkorting van de vetacylketen door twee koolstofatomen tegelijk, vrijgegeven als acetyl-CoA, en dit proces vindt zowel in de mitochondriën als in de peroxisomen plaats. Hoewel de meeste vetzuren slechts β-oxidatie ondergaan, worden sommige geoxideerd bij verschillende koolstofatomen voordat ze deze route betreden. Bijvoorbeeld, 3-methyl-gesubstitueerde vetzuren, zoals fytaanzuur, ondergaan verwijdering van één koolstof door α-oxidatie in de peroxisomen voordat ze de β-oxidatieroute betreden. Evenzo worden sommige vetzuren eerst omgezet in dicarbonzuren door oxidatie van de terminale methylgroep (ω-oxidatie) in het endoplasmatisch reticulum voordat ze bij voorkeur worden geoxideerd in de peroxisomen door β-oxidatie3.
Ongeacht het specifieke organel, moet een vetzuur eerst worden omgezet in een co-enzym A (CoA) thioester, of acyl-CoA, om te worden geoxideerd via de β-oxidatieroute. β-oxidatie van lange-keten acyl-CoA's in de mitochondriale matrix vereist de carnitine shuttle voor hun translocatie, waar carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) de omzetting van acyl-CoA's naar acylcarnitines katalyseert en het snelheidsbeperkende enzym in dit proces is4. Eenmaal getransloceerd naar de mitochondriale matrix, worden de acyl-CoA's opnieuw gevormd en dienen ze als substraten voor de mitochondriale β-oxidatiemachines. In nuchtere toestand wordt het acetyl-CoA geproduceerd door β-oxidatie in hepatische mitochondriën voornamelijk gekanaliseerd naar ketogenese. Peroxisomen dienen als de primaire plaats voor de β-oxidatie van zeer lange keten, vertakte keten en dicarbonzuren. Peroxisomen vereisen niet dat de carnitineshuttle vetzuursubstraten importeert, maar importeert in plaats daarvan de correspondent acyl-CoA's via de activiteit van de ATP-binding cassette (ABC) transporters ABCD1-35. Binnen de peroxisomen worden acyl-CoA's vervolgens geoxideerd door een speciale set enzymen, verschillend van de mitochondriale vetzuur- β-oxidatiemachines. Zowel mitochondriën als peroxisomen vereisen ook een voorraad NAD + en vrij CoA om vette acylketens te oxideren. Het is aangetoond dat de CoA-niveaus in de lever toenemen als reactie op vasten, ter ondersteuning van de verhoogde snelheid van vetzuuroxidatie die in deze toestand optreedt6. Bovendien resulteert een verhoogde CoA-afbraak in de peroxisomen in een selectieve afname van peroxisomale vetzuuroxidatie7. Daarom wordt het proces van vetzuuroxidatie in de cel gereguleerd door de expressieniveaus en activiteiten van enzymen die betrokken zijn bij de activering, transport en oxidatie van vetzuren, evenals de concentraties van cofactoren en andere metabolieten in meerdere subcellulaire compartimenten.
Procedures met behulp van weefselhomogenaten om vetzuuroxidatie te meten, vernietigen de cellulaire architectuur die dit proces reguleert en ondersteunt, wat leidt tot een verzameling gegevens die het in vivo metabolisme niet nauwkeurig weergeeft. Hoewel technieken met behulp van vergulde primaire hepatocyten dit systeem behouden, resulteert het kweken van geïsoleerde cellen gedurende langere tijd in een verlies van het in vivo genexpressieprofiel dat aanwezig was in de cellen toen ze nog in het dier leefden 8,9. Het volgende protocol beschrijft een methode om primaire hepatocyten te isoleren en hun capaciteit voor vetzuur β-oxidatie onmiddellijk na isolatie en in suspensie te testen, met behulp van [1-14C] palmitinezuur. De test is gebaseerd op de meting van de radioactiviteit geassocieerd met de zuuroplosbare metabolieten (ASM) of producten, zoals acetyl-CoA, geproduceerd door de β-oxidatie van [1-14C]palmitinezuur10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(R)-(+)-Etomoxir sodium salt</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4539/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]-Palmitic acid, 50&#8211;60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals</td>
			<td>ARC 0172A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L, 200 &#181;L, and 10 &#181;L pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Perchloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A2296-1LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fatty acid-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>E-217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200CSPP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, 0.22 &#956;m PES Filter, 500 mL, Sterile</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulphate</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G-400-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDPE, 6.5 mL scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-342-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles 22 G, 1.5 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM Research Grade</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>accuSpin Micro 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>424270010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette MR-10, 10 &#181;L</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>TriCarb 4810 TR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScintiVerse BD cocktail</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath, 30 L capacity</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Model G76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thumb Dressing Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-8120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable-flow peristaltic pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>138762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water baths, 2&#8211;2.5 L capacity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes

Vetzuur β-oxidatie is een belangrijke metabole route om aan de energiebehoeften van de lever te voldoen en substraten en cofactoren te bieden voor aanvullende processen, zoals ketogenese en gluconeogenese, die essentieel zijn om de glucosehomeostase van het hele lichaam te behouden en de extra-leverorgaanfunctie in de nuchtere toestand te ondersteunen. Vetzuur β-oxidatie treedt op in de mitochondriën en peroxisomen en wordt gereguleerd door meerdere mechanismen, waaronder de opname en activering van vetzuren, enzymexpressieniveaus en beschikbaarheid van cofactoren zoals co-enzym A en NAD +. In assays die vetzuur β-oxidatie in leverhomogenaten meten, maskeren cellyse en de gemeenschappelijke toevoeging van suprafysiologische niveaus van cofactoren de effecten van deze regulerende mechanismen. Bovendien is de integriteit van de organellen in de homogenaten moeilijk te controleren en kan deze aanzienlijk variëren tussen preparaten. De meting van vetzuur β-oxidatie in intacte primaire hepatocyten overwint de bovenstaande valkuilen. Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde primaire muizenhepatocyten geïncubeerd met 14C-gelabeld palmitinezuur. Door uren tot dagen cultuur te vermijden, heeft deze methode het voordeel dat de eiwitexpressieniveaus en metabole routeactiviteit van de oorspronkelijke lever beter behouden blijven, inclusief de activering van vetzuur β-oxidatie waargenomen in hepatocyten geïsoleerd uit nuchtere muizen in vergelijking met gevoede muizen.

De hier beschreven leverperfusie levert doorgaans 30-40 miljoen cellen/lever op met een gemiddelde levensvatbaarheid van 80%, zoals geschat door trypan blue exclusion (figuur 2). De typische concentratie glucose in de Krebs-Henseleit-buffer (KHB), die wordt gebruikt om de perfusiebuffers 1 en 2 te bereiden, is 11 mM. Bij het meten van vetzuur β-oxidatie in hepatocyten geïsoleerd van nuchtere muizen, kan de concentratie van glucose in de KHB worden verlaagd om de nuchtere toestand beter wee...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

Measurement of Fatty Acid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Vetzuur β-oxidatie is een essentiële metabole route die verantwoordelijk is voor het genereren van energie in veel verschillende celtypen, waaronder hepatocyten. Hier beschrijven we een methode om vetzuur β-oxidatie te meten in vers geïsoleerde primaire hepatocyten met behulp van 14C-gelabeld palmitinezuur.

Meting van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde muizenhepatocyten

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Dit protocol is ontwikkeld om een robuuste methode te bieden voor het meten van totale mitochondriale en peroxisomale vetzuur bèta-oxidatie in primaire muizenhepatocyten. Het gebruik van intacte cellen handhaaft de integriteit van organel en de regulerende mechanismen. Bovendien minimaliseert het testen van vers geïsoleerde hepatocyten veranderingen in genexpressie met betrekking tot de lever van herkomst.De operatie kan een uitdaging zijn. Je moet zelfverzekerd, ijverig en gefocust zijn. Zodra de cannulatie succesvol is, probeer dan te ontspannen, maar let op en controleer de kwaliteit van de perfusie.Om de procedure te starten, spuit u royaal de buik en borst van de verdoofde muis met 70% ethanol. Gebruik vervolgens de tang om de huid en buikwand in de buurt van de basis van de buik omhoog te trekken en zijdelings aan weerszijden van de middellijn en tot aan het middenrif te snijden om de organen bloot te leggen. Stel de inferieure vena cava, of IVC, bloot door de darmen naar de rechterkant te verplaatsen en de lobben van de lever voorzichtig omhoog te draaien.Plaats een klein cilindrisch voorwerp, zoals een naalddop, onder de achterkant van de muis om de IVC enigszins te kantelen en de cannulatie te vergemakkelijken. Nadat u de pomp met buffer één op de laagste snelheid hebt gestart, steekt u de naald in het IVC. Snijd vervolgens de poortader om de druk te verlichten en drainage van bloed- en perfusiebuffers mogelijk te maken.Voordat u het debiet verhoogt tot zeven ml per minuut. Perfuseer de lever met warme buffer één en zorg ervoor dat de lijn die in de buis met buffer één is ingebracht, continu ondergedompeld blijft om te voorkomen dat luchtbellen worden geïntroduceerd. Terwijl perfusie optreedt, voegt u 130 microliter collagenaseoplossing toe om er twee te bufferen en mengt u door te pipetteren met een serologische pipet.Naarmate het volume in de buis met buffer één afneemt tot ongeveer vijf ml, voegt u langzaam vijf ml buffer twee toe om er één te bufferen door aan de zijkant van de buis te pipetteren. Herhaal de toevoeging tweemaal voordat u de resterende buffer twee aan de buis toevoegt. Stop de perfusie wanneer er ongeveer 5 tot 10 ml buffer twee in de buis achterblijft.Snijd vervolgens de lever weg en breng deze over in de kweekschaal van 100 ml met 20 ml ijskoude buffer twee. Breek onder de laminaire stromingskap het leverweefsel voorzichtig uit elkaar met een chirurgische schaar en een pincet. Voeg vervolgens ongeveer 20 ml ijskoude M199-buffer toe aan de hepatocytensuspensie en filter deze door een celzeef van 100 micron met behulp van de zuiger van een spuit om de afgifte van extra hepatocyten uit de grotere leverstukken voorzichtig te bevorderen.Was de kweekschaal van 100 ml en de celzeef met M199-buffer om de celsuspensie op te vangen totdat de opvangbuis vol is. Centrifugeer vervolgens de suspensie bij 50 x g gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Aspirateer het supernatant voordat u de hepatocytenkorrel in 30 ml koude M199 resuspendeert door te wervelen.Herhaal de wasbeurt één keer. Ontdooi het palmitinezuur en runderserumalbumine, of BSA, oplossingen voordat u het substraatmengsel voorbereidt op meerdere reacties. Aliquot 13,5 microliter BSA-oplossing per reactie in een microcentrifugebuis.Voeg na het verwarmen van de buis tot 41 graden Celsius één microliter van de 200 mM palmitinezuuroplossing per reactie toe. Vortex de buis krachtig voor en tijdens incubatie bij 41 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten om de vorming van het oplosbare palmitinezuur-BSA-complex te vergemakkelijken. Gedurende deze tijd, aliquot 133 microliter van 1 M perchloorzuur die zal worden gebruikt om de reacties te stoppen in afzonderlijke 1,5 ml microcentrifugebuizen.Voordat de reacties worden gestart, aliquot en incubeer 485,5 microliter M199-buffer per reactie in een buis bij 37 graden Celsius om het bereide radioactieve BSA-palmitinezuurcomplex te verdunnen. Doseer vervolgens 750 microliter M199 met of zonder remmers in de afzonderlijke 14 ml ronde bodembuizen als de monsters. Breng tijdens de hepatocytenwasstappen, 10 tot 15 minuten voordat de reacties beginnen, de buizen over naar een schuddend waterbad dat is ingesteld op 37 graden Celsius bij 180 tot 200 rotaties per minuut.Als de levensvatbaarheid van de hepatocyten ten minste 75% is voltooid, is de bereiding van het substraatmengsel voltooid door 0,8 microliter koolstof-14 palmitinezuur per reactie over te brengen op de microcentrifugebuis die de geklaarde BSA-palmitinezuuroplossing bevat. Vortex voordat de buis terugkeert naar het waterbad bij 41 graden Celsius. Onmiddellijk na de laatste hepatocytenreuspensie brengt u 750 microliter van de hepatocytensuspensie over naar elk van de ronde bodembuizen van 14 ml in het schudwaterbad met behulp van een pipet van één ml en vortex de buizen kort op de lage snelheid voordat u deze overbrengt naar een incubator, waarbij elke toevoeging met 30 seconden wordt gespreid.Breng een afzonderlijke aliquot hepatocyten over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml om gedurende vijf minuten op 3000 x g te draaien. Verwijder het supernatant voordat u de pellet bij min 80 graden Celsius bewaart om de totale hoeveelheid eiwit in het monster te meten om de resultaten te normaliseren. Terwijl de hepatocyten onder pre-incubatie zijn bij 37 graden Celsius, voegt u het radioactieve BSA-palmitinezuurcomplex toe aan het warme medium om op 37 graden Celsius te blijven totdat u klaar bent om de reacties te starten.Om de reacties te starten, verwijdert u de hepatocyten uit het waterbad en voegt u 500 microliter van het substraatmengsel toe aan de hepatocyten. Vortex de cellen op een lage snelheid gedurende vijf seconden voordat ze terugkeren naar het waterbad om gedurende 15 minuten te incuberen. Start een reeks reacties en stop onmiddellijk om de achtergrondradioactiviteit te bepalen.Breng de dubbele aliquots van 200 tot 250 microliter van het overgebleven substraatmengsel over en zet opzij in scintillatieflacons van 6 ml om het tellen uit te voeren. Om de reacties te stoppen, verwijdert u de hepatocyten uit het waterbad om te resuspenderen door met een gematigde snelheid te vortexen en vervolgens 400 microliter van de hepatocytensuspensie over te brengen naar de microcentrifugebuizen die perchloorzuur bevatten. Dop en vortex onmiddellijk de buizen voordat u de reeks herhaalt voor alle monsters, duizelingwekkend met 30 seconden.Nadat u de microcentrifugebuizen van 1,5 ml gedurende 10 minuten op 13.000 x g hebt laten draaien, brengt u 300 microliter van het supernatant over naar een scintillatieflacon van 6 ml en voegt u 4 ml van de scintillatievloeistof toe om de radioactiviteit in de monsters en de substraatmix aliquots in een scintillatieteller te tellen. In de studie leverde de leverperfusie 30 tot 40 miljoen cellen per lever op, met een gemiddelde levensvatbaarheid van 80% Er werd ook waargenomen dat het verlagen van de glucoseconcentratie in de nuchtere groep geen negatief effect had op de opbrengst of levensvatbaarheid van de hepatocyten. De hepatocytensuspensie, geïsoleerd van gevoede en nuchtere mannelijke muizen, werden getest op vetzuur bèta-oxidatiecapaciteit in de aan- en afwezigheid van etomoxir, een krachtige remmer van CPT1 en mitochondriale vetzuuroxidatie.De tellingen per minuut, of CPM, geassocieerd met de achtergrondradioactiviteit variëren met de partij palmitinezuur. De CPM was echter nog steeds aanzienlijk lager dan de monsters die met de substraatmix werden geïncubeerd. De hepatocyten geïsoleerd uit de nuchtere muizen vertonen een robuuste toename van de snelheid van zowel mitochondriale als peroxisomale vetzuur bèta-oxidatie.De gegevens werden verder bestudeerd om de snelheid te bepalen waarmee palmitinezuur wordt geoxideerd in de hepatocyten geïsoleerd uit de gevoede en nuchtere muizen. Voorkom dat bubbels de lijn binnendringen. Houd de naald stabiel tijdens de perfusie.Wees voorzichtig bij het hanteren van de hepatocyten. Houd ze in suspensie wanneer u ze uitdeelt. De hepatocyten die uit deze procedure worden geïsoleerd, kunnen worden gebruikt als een suspensie om andere metabole routes te testen, zoals vetzuursynthese, of ze kunnen worden gebruikt voor celkweekexperimenten.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identificatie van vetzuren in<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyse van een Ni-Schiff Base-complex onder omstandigheden geschikt voor het bewaren van zuur-labiele Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Zuivering van hepatocyten en sinusvormige endotheliale cellen van lever muis perfusie

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Profilering van vetzuur 13C Isotopologue geeft inzicht in de trofische Carbon overdracht en lipide metabolisme van ongewervelde consumenten

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie over het metabolisme van zes systemische insecticiden in een nieuw opgerichte cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) Bladeren

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolatie van lipoproteïne deeltjes uit kippenei dooier voor de studie van bacteriële pathogeen vetzuur opname in membraan fosfolipiden

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...