Name: measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות R35GM119528 לרוברטה לאונרדי.

כל ההליכים הניסיוניים על עכברים (C57BL/6J, זכרים, בני 9-11 שבועות) אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת מערב וירג'יניה.
1. בידוד הפטוציטים
<ol><li>הכנה<ol>
<li>בימים שלפני בידוד הפטוציטים, הכינו את המאגרים ואת אמצעי תרביות התאים המפורטים בטבלה 1</st...

<ol>
	<li>Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Metabolism+in+the+Liver.">Triglyceride Metabolism in the Liver.</a> Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease.">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).</li><li>Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+organization+of+peroxisomal+beta-oxidation.">Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).</li><li>Kerner, J., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+import+into+mitochondria.">Fatty acid import into mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).</li><li>Baker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+ABC+transporters:+functions+and+mechanism.">Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism.</a> Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PloS One. 5 (6), 11107 (2010).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).</li><li>Richert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+human+hepatocytes+in+suspension+after+isolation+is+similar+to+the+liver+of+origin,+is+not+affected+by+hepatocyte+cold+storage+and+cryopreservation,+but+is+strongly+changed+after+hepatocyte+plating.">Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating.</a> Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).</li><li>Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+expression+of+hepatocyte+protein+gene-products+associated+with+adaptation+of+cells+to+primary+culture.">Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture.</a> Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).</li><li>Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flux+control+coefficient+of+carnitine+palmitoyltransferase+I+on+palmitate+beta-oxidation+in+rat+hepatocyte+cultures.">The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures.</a> Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).</li><li>Consitt, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+coactivator-1alpha+overexpression+increases+lipid+oxidation+in+myocytes+from+extremely+obese+individuals.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals.</a> Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).</li><li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure.">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).</li><li>Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+etomoxiryl-CoA+on+different+carnitine+acyltransferases.">Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases.</a> Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+of+palmitate+change+during+postnatal+development+and+food+deprivation+in+liver,+kidney+and+heart+of+pigs.">Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs.</a> Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+hepatic+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+to+increasing+palmitate+concentrations+in+piglets.">Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets.</a> Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).</li><li>Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+rat+and+human+tissues.+Effect+of+nutritional+state,+clofibrate+treatment+and+postnatal+development+in+the+rat.">Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).</li><li>Hakvoort, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interorgan+coordination+of+the+murine+adaptive+response+to+fasting.">Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).</li><li>Sokolovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptomic+signature+of+fasting+murine+liver.">The transcriptomic signature of fasting murine liver.</a> BMC Genomics. 9, 528 (2008).</li><li>Kersten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+mediates+the+adaptive+response+to+fasting.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Rat+Hepatocytes+with+Multiparameter+Perfusion+Control.">Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).</li><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes.">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li><li>Bougarne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+blocks+glucocorticoid+receptor+alpha-mediated+transactivation+but+cooperates+with+the+activated+glucocorticoid+receptor+alpha+for+transrepression+on+NF-kappaB.">PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).</li></ol>

במהלך זלוף הכבד, חשוב להימנע מהכנסת בועות אוויר, שכן הן חוסמות את המיקרו-קפילרים בכבד, מונעות או מגבילות את זרימת החיץ ומפחיתות באופן כללי את תפוקת הפטוציטים ואת הכדאיות20,21. אמצעי זהירות, כגון בדיקה מדוקדקת של קו הכניסה הממולא במאגר לפני התותח של ה-IVC והימנעו...

חמצון β של חומצות שומן הוא תהליך חיוני בחילוף החומרים של השומנים, המספק מסלול קטבולי לאיזון סינתזת חומצות השומן וצריכתן מהתזונה. תהליך זה מייצר אנרגיה עבור איברים רבים, כולל שריר הלב, קליפת הכליות והכבד הצום, ומשתמש בחומצות שומן המתקבלות מהתזונה, ליפוליזה של רקמת השומן ומאגריהטריגליצרידים הפנימיים 1,2.
חמצון של חומצת שומן דרך מסלול החמצון β גורם לקיצור רציף של שרשרת האציל השומנית על ידי שני פחמנים בו זמנית, המשתחררים כאצטיל-CoA, ותהליך זה מתרחש הן במיטוכונדריה והן בפרוקסיזומים. בעוד שרוב חומצות השומן עוברות רק חמצון β, חלקן מתחמצנות בפחמנים שונים לפני שהן נכנסות למסלול זה. לדוגמה, חומצות שומן בתחליפי 3-מתיל, כגון חומצה פיטנית, עוברות הסרה של פחמן אחד על ידי חמצון α בפרוקסיזומים לפני שהן נכנסות למסלול החמצון β. באופן דומה, חומצות שומן מסוימות מומרות תחילה לחומצות שומן דיקרבוקסיליות על ידי חמצון של קבוצת המתיל הטרמינלית (ω-חמצון) ברשתית האנדופלסמית לפני שהן עוברות חמצון מועדף בפרוקסיזומים על ידי חמצון β3.
ללא קשר לאברון הספציפי, יש להמיר תחילה חומצת שומן לתיואסטר קו-אנזים A (CoA), או אציל-CoA, כדי להתחמצן דרך מסלול החמצון β. β-חמצון של אציל-CoAs ארוכי שרשרת במטריצה המיטוכונדרית דורש את מעבורת קרניטין לטרנסלוקציה שלהם, כאשר קרניטין פלמיטואיל-טרנספראז 1 (CPT1) מזרז את ההמרה של אציל-CoAs לאציל-קרניטין והוא האנזים המגביל את הקצב בתהליך זה4. לאחר שהם עוברים טרנסלוקציה למטריצה המיטוכונדרית, האציל-CoAs נוצרים מחדש ומשמשים כמצעים למכונות החמצון β המיטוכונדריה. במצב של צום, האצטיל-CoA המיוצר באמצעות חמצון β במיטוכונדריה בכבד מתועל בעיקר לקטוזגנזה. פרוקסיזומים משמשים כאתר העיקרי לחמצון β של חומצות שומן ארוכות מאוד, שרשרת מסועפת ודיקרבוקסיליות. פרוקסיזומים אינם דורשים ממעבורת קרניטין לייבא מצעי חומצות שומן, ובמקום זאת מייבאים את הכתב אציל-CoAs באמצעות פעילותם של מובילי הקלטת הקושרים ATP (ABC) ABCD1-35. בתוך הפרוקסיזומים, אציל-CoAs מתחמצנים לאחר מכן על-ידי קבוצה ייעודית של אנזימים, הנבדלים מחומצת השומן המיטוכונדרית β-חמצון." גם מיטוכונדריה וגם פרוקסיזומים דורשים אספקה של NAD+ ו-CoA חופשי כדי לחמצן שרשראות אציל שומניות. רמות CoA בכבד הוכחו כגוברות בתגובה לצום, מה שתומך בקצב המוגבר של חמצון חומצות שומן המתרחש במצב זה6. יתר על כן, פירוק מוגבר של CoA בפרוקסיזומים גורם לירידה סלקטיבית בחמצון חומצות שומן פרוקסיסומליות7. לכן, התהליך של חמצון חומצות שומן בתוך התא מווסת על ידי רמות הביטוי והפעילויות של אנזימים המעורבים בהפעלה, הובלה וחמצון של חומצות שומן, כמו גם ריכוזים של קו-פקטורים ומטבוליטים אחרים לאורך תאים תת-תאיים מרובים.
פרוצדורות המשתמשות בהומוגנטים של רקמות למדידת חמצון חומצות שומן הורסות את הארכיטקטורה התאית המסדירה ותומכת בתהליך זה, מה שמוביל לאיסוף נתונים שאינם משקפים במדויק את חילוף החומרים in vivo. בעוד שטכניקות המשתמשות בהפטוציטים ראשוניים מצופים משמרות את המערכת הזו, גידול תאים מבודדים לפרקי זמן ממושכים גורם לאובדן פרופיל ביטוי הגנים in vivo שהיה קיים בתאים כאשר הם עדיין חיו בתוך החיה 8,9. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה לבודד הפטוציטים ראשוניים ולבחון את יכולתם לחומצת שומן β-חמצון מיד לאחר הבידוד ובתרחיף, באמצעות [1-14C]חומצה פלמיטית. הבדיקה מבוססת על מדידת הרדיואקטיביות הקשורה למטבוליטים המסיסים בחומצה (ASM) או למוצרים, כמו אצטיל-CoA, המיוצרים על ידי חמצון β של [1-14C] חומצה פלמיטית10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(R)-(+)-Etomoxir sodium salt</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4539/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]-Palmitic acid, 50&#8211;60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals</td>
			<td>ARC 0172A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L, 200 &#181;L, and 10 &#181;L pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Perchloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A2296-1LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fatty acid-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>E-217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200CSPP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, 0.22 &#956;m PES Filter, 500 mL, Sterile</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulphate</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G-400-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDPE, 6.5 mL scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-342-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles 22 G, 1.5 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM Research Grade</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>accuSpin Micro 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>424270010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette MR-10, 10 &#181;L</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>TriCarb 4810 TR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScintiVerse BD cocktail</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath, 30 L capacity</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Model G76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thumb Dressing Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-8120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable-flow peristaltic pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>138762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water baths, 2&#8211;2.5 L capacity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes

חמצון β של חומצות שומן הוא מסלול מטבולי מרכזי כדי לענות על דרישות האנרגיה של הכבד ולספק מצעים וקו-פקטורים לתהליכים נוספים, כגון קטוגנזה וגלוקונאוגנזה, החיוניים לשמירה על הומאוסטזיס של גלוקוז בכל הגוף ולתמיכה בתפקוד איברים חוץ-כבדיים במצב של צום. חומצת שומן β-חמצון מתרחשת בתוך המיטוכונדריה והפרוקסיזומים ומווסתת באמצעות מנגנונים מרובים, כולל ספיגה והפעלה של חומצות שומן, רמות ביטוי אנזימים וזמינות של קו-פקטורים כגון קו-אנזים A ו-NAD+. במבחנים המודדים חומצות שומן β-חמצון בהומוגנטים של הכבד, ליזה של תאים והתוספת הנפוצה של רמות סופראפיזיולוגיות של קו-פקטורים מסווים את ההשפעות של מנגנוני ויסות אלה. יתר על כן, שלמות האברונים בהומוגנטים קשה לשליטה ויכולה להשתנות באופן משמעותי בין ההכנות. המדידה של חומצת שומן β חמצון בהפטוציטים ראשוניים שלמים מתגברת על המלכודות הנ"ל. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת חומצת שומן β-חמצון בתרחיף של הפטוציטים של עכברים ראשוניים שבודדו זה עתה, עם 14חומצה פלמיטית עם תווית C. על ידי הימנעות משעות עד ימים של תרבית, לשיטה זו יש יתרון בכך שהיא משמרת טוב יותר את רמות ביטוי החלבון ואת פעילות המסלולים המטבוליים של הכבד המקורי, כולל הפעלת חומצת שומן β חמצון שנצפתה בהפטוציטים שבודדו מעכברים בצום בהשוואה לעכברים שניזונו.

זלוף הכבד המתואר כאן מניב בדרך כלל 30-40 מיליון תאים/כבד עם כדאיות ממוצעת של 80%, כפי שהוערך על ידי הרחקה כחולה של טריפאן (איור 2). הריכוז האופייני של גלוקוז במאגר Krebs-Henseleit (KHB), המשמש להכנת מאגרי הזלוף 1 ו -2, הוא 11 mM. כאשר מודדים חומצת שומן β-חמצון בהפטוציטים המבודדים מעכברים בצום, נ?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

Measurement of Fatty Acid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

חמצון β חומצות שומן הוא מסלול מטבולי חיוני האחראי על הפקת אנרגיה בסוגי תאים רבים ושונים, כולל הפטוציטים. כאן אנו מתארים שיטה למדידת חמצון-β חומצות שומן בהפטוציטים ראשוניים שזה עתה בודדו באמצעות 14חומצה פלמיטית המסומנת כ-C.

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

פרוטוקול זה פותח כדי לספק שיטה חזקה למדידת סך כל חומצות השומן המיטוכונדריאליות והפרוקסיסומליות בטא-חמצון בפטוציטים ראשוניים של עכברים. השימוש בתאים שלמים שומר על שלמות האברונים ועל מנגנוני הוויסות הקיימים. בנוסף, בדיקת הפטוציטים שבודדו זה עתה ממזערת את השינויים בביטוי הגנים ביחס לכבד המוצא.הניתוח יכול להיות מאתגר. אתה צריך להיות בטוח, חרוץ וממוקד. לאחר שהתותח מצליח, נסו להירגע, אך שימו לב ועקבו אחר איכות הזלוף.כדי להתחיל את ההליך, לרסס בנדיבות את הבטן והחזה של העכבר המרדים עם 70% אתנול. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי למשוך את העור ואת דופן הבטן ליד בסיס הבטן ולחתוך לרוחב משני צדי קו האמצע ועד הסרעפת כדי לחשוף את האיברים. חשוף את הווריד הנבוב התחתון, או IVC, על ידי הזזת המעיים לצד ימין והפיכה עדינה של אונות הכבד כלפי מעלה.הכנס אובייקט גלילי קטן, כגון מכסה מחט, מתחת לגב העכבר כדי להטות מעט את ה- IVC ולהקל על התותח. לאחר הפעלת המשאבה עם buffer אחד במהירות הנמוכה ביותר, להכניס את המחט לתוך IVC. לאחר מכן חותכים את וריד הפורטל כדי להקל על הלחץ ולאפשר ניקוז של מאגרי דם וזלוף.לפני הגדלת קצב הזרימה לשבעה מ"ל לדקה. הוסיפו לכבד חיץ חם אחד וודאו שהקו המוחדר לצינור המכיל חיץ אחד נשאר שקוע באופן רציף כדי למנוע החדרת בועות אוויר. בזמן שמתרחשת זלוף, מוסיפים 130 מיקרוליטרים של תמיסת קולגן כדי לאגור שניים, ומערבבים על ידי צנרת עם פיפטה סרולוגית.כאשר הנפח בצינור המכיל חיץ אחד יורד לכ-5 מ"ל, הוסיפו באיטיות חמישה מ"ל של חיץ שניים כדי לאגור אחד על ידי צנרת בצד הצינור. חזור על התוספת פעמיים לפני שתוסיף את שני המאגרים הנותרים לצינור. עצור את הזלוף כאשר כ 5 עד 10 מ"ל של חיץ שני נשארים בצינור.לאחר מכן הוציאו את הכבד והעבירו אותו לתבשיל התרבית של 100 מ"ל המכיל 20 מ"ל של חיץ קר כקרח שניים. מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, מפרקים בעדינות את רקמת הכבד באמצעות מספריים כירורגיים ופינצטה. לאחר מכן מוסיפים כ-20 מ"ל של חיץ M199 קר כקרח לתרחיף הפטוציטים ומסננים אותו דרך מסננת תאים של 100 מיקרון באמצעות בוכנה של מזרק כדי לקדם בעדינות את שחרורם של הפטוציטים נוספים מחתיכות הכבד הגדולות יותר.יש לשטוף את תבשיל התרבית של 100 מ"ל ואת מסננת התאים עם מאגר M199 כדי לאסוף את תרחיף התא עד שצינור האיסוף מתמלא. לאחר מכן צנטריפוגה את ההשעיה ב 50 x g במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. לשאוף את supernatant לפני החייאה של כדור hepatocyte ב 30 מ"ל של M199 קר על ידי מערבולת.חזור על הכביסה פעם אחת. להפשיר את החומצה הדקלמית ואת אלבומין סרום בקר, או BSA, תמיסות לפני הכנת תערובת המצע לתגובות מרובות. אליקוט 13.5 מיקרוליטרים של תמיסת BSA לכל תגובה בצינור מיקרוצנטריפוגה.לאחר חימום הצינור ל-41 מעלות צלזיוס, הוסיפו מיקרוליטר אחד של תמיסת החומצה הדקלמית של 200 mM לכל תגובה. מערבולת הצינור במרץ לפני ובמהלך הדגירה ב 41 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 30 דקות כדי להקל על היווצרות של קומפלקס חומצה פלמיטית מסיסה-BSA. במהלך תקופה זו, aliquot 133 microliters של 1 M של חומצה פרכלורית אשר ישמשו כדי לעצור את התגובות בצינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים 1.5 מ"ל.לפני תחילת התגובות, aliquot ודגירה של 485.5 מיקרוליטרים של חיץ M199 לכל תגובה לתוך צינור ב 37 מעלות צלזיוס כדי לדלל את קומפלקס החומצה הרדיואקטיבית BSA-palmitic מוכן. לאחר מכן מחלקים 750 מיקרוליטרים של M199 עם או בלי מעכבים בצינורות התחתונים העגולים הנפרדים של 14 מ"ל כדגימות. במהלך שלבי שטיפת הפטוציטים, 10 עד 15 דקות לפני תחילת התגובות, מעבירים את הצינורות לאמבטיית מים רועדת שנקבעה ל-37 מעלות צלזיוס ב-180 עד 200 סיבובים לדקה.אם הכדאיות של hepatocytes הוא לפחות 75% להשלים את ההכנה של תערובת המצע על ידי העברת 0.8 microliters של פחמן-14 חומצה פלמיטית לכל תגובה לצינור microcentrifuge המכיל את תמיסת חומצה BSA-palmitic הבהיר. מערבולת לפני החזרת הצינור לאמבטיית המים בטמפרטורה של 41 מעלות צלזיוס. מיד לאחר ההחייאה הסופית של הפטוציטים, העבירו 750 מיקרוליטרים של תרחיף הפטוציטים לכל אחד מהצינורות התחתונים העגולים של 14 מ"ל באמבט המים הרועד באמצעות פיפטה אחת של מ"ל ומערבולת הצינורות לזמן קצר במהירות הנמוכה לפני המעבר לחממה, מה שמזעזע כל תוספת ב-30 שניות.מעבירים אליקוט נפרד של הפטוציטים לצינור מיקרו-צנטריפוג של 1.5 מ"ל כדי להסתובב ב-3000 x גרם במשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט לפני אחסון הכדור במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי למדוד את כמות החלבון הכוללת בדגימה כדי לנרמל את התוצאות. בזמן שההפטוציטים נמצאים תחת דגירה מוקדמת ב-37 מעלות צלזיוס, הוסיפו את קומפלקס החומצה הרדיואקטיבית BSA-palmitic למדיום החם כדי לשמור על 37 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים להתחיל את התגובות.כדי להתחיל את התגובות, להסיר את hepatocytes מן האמבטיה מים ולהוסיף 500 microliters של תערובת המצע hepatocytes. מערבולת את התאים במהירות נמוכה במשך חמש שניות לפני שהם חוזרים לאמבטיית המים כדי לדגור במשך 15 דקות. התחל קבוצה של תגובות ומיד עצור כדי לקבוע את הרדיואקטיביות ברקע.מעבירים ומניחים בצד את האליקוטים הכפולים של 200 עד 250 מיקרוליטרים של שאריות המצע בתערובת המצע הנותרת בבקבוקוני 6 מ"ל כדי לבצע את הספירה. כדי לעצור את התגובות, הסר את הפטוציטים מאמבט המים כדי לבצע החייאה על ידי מערבולת במהירות מתונה ולאחר מכן העבר 400 מיקרוליטרים של תרחיף הפטוציטים לצינורות microcentrifuge המכילים חומצה פרכלורית. מיד מכסה ומסובב את הצינורות לפני שחוזרים על הרצף של כל הדגימות, מזעזע ב -30 שניות.לאחר סיבוב במורד צינורות המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ב-13, 000 x g למשך 10 דקות, מעבירים 300 מיקרוליטרים של ה-supernatant לבקבוקון ציצית של 6 מ"ל ומוסיפים 4 מ"ל מ"ל של נוזל הציצית כדי לספור את הרדיואקטיביות בדגימות ואת תערובת המצעים אליקוטים במונה סקינטילציה. במחקר, זלוף הכבד הניב 30 עד 40 מיליון תאים לכל כבד, עם כדאיות ממוצעת של 80%, כמו כן נצפתה כי הורדת ריכוז הגלוקוז בקבוצת הצום לא השפיעה לרעה על התשואה או הכדאיות של הפטוציטים. תרחיף הפטוציטים, שבודד מעכברים זכרים שניזונו וצום, נבדקו לצורך יכולת חמצון בטא של חומצת שומן בנוכחות ובהיעדר אטומוקסיר, מעכב רב עוצמה של CPT1 וחמצון חומצות שומן מיטוכונדריאליות.הספירות לדקה, או CPM, הקשורות לרדיואקטיביות הרקע משתנות עם קבוצת החומצה הדקלמית. עם זאת, CPM עדיין היה נמוך משמעותית מהדגימות שהודגמו בתערובת המצע. ההפטוציטים שבודדו מהעכברים הצומים מראים עלייה חזקה בשיעורי החמצון של חומצת שומן מיטוכונדריאלית ופרוקסיזומית.הנתונים נחקרו עוד יותר כדי לקבוע את הקצב שבו חומצה פלמיטית מתחמצנת בהפטוציטים המבודדים מהעכברים המוזנים והצומים. מנעו מבועות להיכנס לקו. שמור על המחט יציבה במהלך הזלוף.היו עדינים בעת הטיפול בהפטוציטים. שמור אותם במתלים בעת חלוקתם. הפטוציטים המבודדים מהליך זה יכולים לשמש כתרחיף כדי לבחון מסלולים מטבוליים אחרים, כגון סינתזה של חומצות שומן, או שניתן לצפות אותם לניסויים בתרביות תאים.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

זיהוי של חומצות שומן ב<em&gt; Cereus בצילוס</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

הידרוליזה של תנאי Ni-שיף-Base מורכבים באמצעות מתאים שמירת חומצה-רָפִיף קבוצות הגנה

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

טיהור של Hepatocytes ותאי אנדותל Sinusoidal מן הכבד העכבר זלוף

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

חומצת שומן 13C איזוטופולוג פרופיל מספק תובנה מטבולי של הגעה צרכנים והעברת פחמן עם מחלות

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

מחקר על חילוף החומרים של שישה קוטלי חרקים מערכתית החדש הוקמה התא תרבות ההשעיה נגזר תה (Camellia Sinensis L.) עלים

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

בידוד של חלקיקי ליפופרוטאין מעוף חלמון ביצה לחקר הפתוגן חומצות שומן בקטריאלי התאגדות לתוך ממברנה פוספוליפידים

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...