Name: measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00
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この研究は、国立衛生研究所がロベルタ・レオナルディに助成金R35GM119528を供与した。

マウス(C57BL/6J、雄、9〜11週齢)に対するすべての実験手順は、ウェストバージニア大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認された。
1. 肝細胞の単離
<ol><li>準備<ol>
<li>肝細胞単離の数日前に、 表1に記載の緩衝液及び細胞培養培地を調製した。手術が行われる場所の近くで温度を37°Cに設定したウォーターバスを設置します。</li>
		<li>肝細胞単?...

<ol>
	<li>Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Metabolism+in+the+Liver.">Triglyceride Metabolism in the Liver.</a> Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease.">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).</li><li>Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+organization+of+peroxisomal+beta-oxidation.">Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).</li><li>Kerner, J., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+import+into+mitochondria.">Fatty acid import into mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).</li><li>Baker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+ABC+transporters:+functions+and+mechanism.">Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism.</a> Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PloS One. 5 (6), 11107 (2010).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).</li><li>Richert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+human+hepatocytes+in+suspension+after+isolation+is+similar+to+the+liver+of+origin,+is+not+affected+by+hepatocyte+cold+storage+and+cryopreservation,+but+is+strongly+changed+after+hepatocyte+plating.">Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating.</a> Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).</li><li>Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+expression+of+hepatocyte+protein+gene-products+associated+with+adaptation+of+cells+to+primary+culture.">Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture.</a> Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).</li><li>Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flux+control+coefficient+of+carnitine+palmitoyltransferase+I+on+palmitate+beta-oxidation+in+rat+hepatocyte+cultures.">The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures.</a> Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).</li><li>Consitt, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+coactivator-1alpha+overexpression+increases+lipid+oxidation+in+myocytes+from+extremely+obese+individuals.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals.</a> Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).</li><li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure.">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).</li><li>Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+etomoxiryl-CoA+on+different+carnitine+acyltransferases.">Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases.</a> Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+of+palmitate+change+during+postnatal+development+and+food+deprivation+in+liver,+kidney+and+heart+of+pigs.">Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs.</a> Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+hepatic+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+to+increasing+palmitate+concentrations+in+piglets.">Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets.</a> Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).</li><li>Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+rat+and+human+tissues.+Effect+of+nutritional+state,+clofibrate+treatment+and+postnatal+development+in+the+rat.">Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).</li><li>Hakvoort, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interorgan+coordination+of+the+murine+adaptive+response+to+fasting.">Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).</li><li>Sokolovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptomic+signature+of+fasting+murine+liver.">The transcriptomic signature of fasting murine liver.</a> BMC Genomics. 9, 528 (2008).</li><li>Kersten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+mediates+the+adaptive+response+to+fasting.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Rat+Hepatocytes+with+Multiparameter+Perfusion+Control.">Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).</li><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes.">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li><li>Bougarne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+blocks+glucocorticoid+receptor+alpha-mediated+transactivation+but+cooperates+with+the+activated+glucocorticoid+receptor+alpha+for+transrepression+on+NF-kappaB.">PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).</li></ol>

肝臓灌流の間、気泡は肝臓内の微小毛細血管を遮断し、緩衝循環を防止または制限し、肝細胞の収量および生存率を全体的に低下させるので、気泡の導入を避けることが重要である20,21。IVCのカニューレ前にバッファーで満たされた入口ラインを綿密に検査し、バッファー1を含むチューブから入口ラインを持ち上げてバッファー2に切り替えること?...

脂肪酸β酸化は脂質代謝に不可欠なプロセスであり、脂肪酸合成と食事からの摂取のバランスをとるための異化経路を提供する。このプロセスは、心筋、腎臓皮質、絶食肝臓を含む複数の臓器にエネルギーを生成し、食事から得られる脂肪酸、脂肪組織の脂肪分解、および内部トリグリセリドストア1,2を利用します。
β酸化経路を介した脂肪酸の酸化は、アセチルCoAとして放出される一度に2つの炭素による脂肪酸アシル鎖の逐次的な短縮をもたらし、このプロセスはミトコンドリアおよびペルオキシソームの両方で起こる。ほとんどの脂肪酸はβ酸化のみを受けるが、一部はこの経路に入る前に異なる炭素で酸化される。例えば、フィタン酸などの3-メチル置換脂肪酸は、α酸化経路に入る前にペルオキシソーム中のβ酸化によって1つの炭素の除去を受ける。同様に、一部の脂肪酸は、小胞体における末端メチル基の酸化(ω-酸化)によって最初にジカルボン酸脂肪酸に変換され、その後、β酸化3によってペルオキシソーム内で優先的に酸化される。
特定の細胞小器官に関係なく、脂肪酸は、β酸化経路を介して酸化されるためには、まず補酵素A(CoA)チオエステル、またはアシルCoAに変換されなければならない。ミトコンドリアマトリックス中の長鎖アシルCoAsのβ-酸化は、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ1(CPT1)がアシル-CoAsのアシルカルニチンへの変換を触媒し、このプロセス4における律速酵素であるカルニチンシャトルを必要とする。一旦ミトコンドリアマトリックスに転移すると、アシルCoAsは再形成され、ミトコンドリアβ酸化機構の基質として役立つ。絶食状態では、肝ミトコンドリアにおけるβ酸化によって産生されたアセチルCoAは、主にケトジェネシスにチャネリングされる。ペルオキシソームは、非常に長鎖、分岐鎖、およびジカルボン酸のβ酸化の一次部位として役立つ。ペルオキシソームは、脂肪酸基質を輸入するためにカルニチンシャトルを必要とせず、代わりにATP結合カセット(ABC)トランスポーターの活性を介して対応するアシル-CoAsを輸入する1-35。ペルオキシソーム内では、アシルCoAsは、ミトコンドリア脂肪酸β酸化機構とは異なる専用の酵素セットによって酸化される。ミトコンドリアとペルオキシソームの両方はまた、脂肪アシル鎖を酸化するためにNAD+ および遊離CoAの供給を必要とする。肝臓中のCoAレベルは絶食に応答して増加することが示されており、この状態で起こる脂肪酸酸化の速度の増加を支持している6。さらに、ペルオキシソームにおけるCoA分解の増加は、ペルオキシソーム脂肪酸酸化7の選択的減少をもたらす。したがって、細胞内の脂肪酸酸化のプロセスは、脂肪酸の活性化、輸送、および酸化に関与する酵素の発現レベルおよび活性、ならびに複数の細胞内区画にわたる補因子および他の代謝産物の濃度によって調節される。
脂肪酸酸化を測定するために組織ホモジネートを使用する手順は、このプロセスを調節およびサポートする細胞アーキテクチャを破壊し、in vivo代謝を正確に反映しないデータの収集につながる。播種された初代肝細胞を用いた技術はこの系を保持するが、単離された細胞を長期間培養すると、動物内にまだ生きていたときに細胞内に存在していたin vivo遺伝子発現プロファイルが失われる結果となる8,9。以下のプロトコールは、[1-14C]パルミチン酸を用いて、初代肝細胞を単離し、単離直後および懸濁液中で脂肪酸β酸化に対するそれらの能力をアッセイする方法を記載している。このアッセイは、[1-14C]パルミチン酸10,11のβ酸化によって生成されるアセチルCoAのような酸可溶性代謝産物(ASM)または生成物に関連する放射能の測定に基づいている。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(R)-(+)-Etomoxir sodium salt</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4539/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]-Palmitic acid, 50&#8211;60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals</td>
			<td>ARC 0172A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L, 200 &#181;L, and 10 &#181;L pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Perchloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A2296-1LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fatty acid-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>E-217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200CSPP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, 0.22 &#956;m PES Filter, 500 mL, Sterile</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulphate</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G-400-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDPE, 6.5 mL scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-342-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles 22 G, 1.5 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM Research Grade</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>accuSpin Micro 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>424270010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette MR-10, 10 &#181;L</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>TriCarb 4810 TR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScintiVerse BD cocktail</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath, 30 L capacity</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Model G76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thumb Dressing Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-8120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable-flow peristaltic pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>138762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water baths, 2&#8211;2.5 L capacity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes

脂肪酸β酸化は、肝臓のエネルギー需要を満たすための重要な代謝経路であり、全身のグルコース恒常性を維持し、絶食状態での肝外器官機能をサポートするために不可欠なケトジェネシスおよび糖新生などの追加プロセスのための基質および補因子を提供する。脂肪酸β酸化は、ミトコンドリアおよびペルオキシソーム内で起こり、脂肪酸の取り込みおよび活性化、酵素発現レベル、補酵素AおよびNAD+などの補因子の利用可能性を含む複数のメカニズムによって調節される。肝臓ホモジネート中の脂肪酸β酸化を測定するアッセイでは、細胞溶解および補因子の超生理学的レベルの一般的な添加は、これらの調節機構の影響を隠す。さらに、ホモジネート中の細胞小器官の完全性は制御が困難であり、調製物間で大きく異なる可能性がある。無傷の初代肝細胞における脂肪酸β酸化の測定は、上記の落とし穴を克服する。このプロトコールは、 14C標識パルミチン酸と共にインキュベートされた新たに単離された初代マウス肝細胞の懸濁液中の脂肪酸β酸化の測定のための方法を記載する。数時間から数日の培養を避けることによって、この方法は、摂食マウスと比較して絶食マウスから単離された肝細胞において観察される脂肪酸β酸化の活性化を含む、元の肝臓のタンパク質発現レベルおよび代謝経路活性をよりよく保存するという利点を有する。

ここで説明する肝臓灌流は、トリパンブルー排除によって推定されるように、典型的には3000万〜4000万個の細胞/肝臓を生じ、平均生存率は80%である(図2)。灌流バッファー 1 および 2 の調製に使用される Krebs-Henseleit バッファー (KHB) 中のグルコースの典型的な濃度は 11 mM です。絶食マウスから単離した肝細胞における脂肪酸β酸化を測定する場合、KHB中のグルコース濃度?...

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Measurement of Fatty Acid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

脂肪酸β酸化は、肝細胞を含む多くの異なる細胞型においてエネルギーを生成する役割を担う必須代謝経路である。ここでは、 14C標識パルミチン酸を用いて新たに単離した初代肝細胞における脂肪酸β酸化を測定する方法について述べる。

単離したてのマウス肝細胞の懸濁液中の脂肪酸β酸化の測定

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

このプロトコルは、初代マウス肝細胞における総ミトコンドリアおよびペルオキシソーム脂肪酸β酸化の測定のための堅牢な方法を提供するために開発された。無傷の細胞を使用することで、オルガネラの完全性と調節機構が維持されます。さらに、新たに単離された肝細胞をアッセイすることにより、起源の肝臓に対する遺伝子発現の変化が最小限に抑えられます。手術は困難な場合があります。自信を持ち,勤勉で,集中しなければなりません。カニューレが成功したら、リラックスしてみますが、注意を払って灌流の質を監視してください。手順を開始するには、麻酔をかけられたマウスの腹部および胸部に70%エタノールを自由に噴霧する。次に、鉗子を使用して腹部の基部近くの皮膚および腹壁を引き上げ、正中線の両側および横隔膜まで横方向に切断して器官を露出させる。腸を右側に動かし、肝臓の葉を静かに上にひっくり返すことによって、下大静脈、またはIVCを露出させる。ニードルキャップなどの小さな円筒形の物体をマウスの背面の下に挿入して、IVCをわずかに傾けてカニューレを容易にします。バッファー1でポンプを最低速度で始動した後、IVCに針を挿入します。その後、門脈を切断して圧力を和らげ、血液および灌流緩衝液の排液を可能にする。流量を毎分7mLに増加させる前に。温かいバッファー 1 で肝臓を灌流し、バッファー 1 を含むチューブに挿入されたラインが気泡の導入を避けるために連続的に沈んだままであることを確認します。灌流が起こる間、130マイクロリットルのコラゲナーゼ溶液を緩衝液2個に加え、血清学的ピペットでピペッティングして混合する。緩衝液1を含むチューブ内の体積が約5mLに減少するように、チューブの側面にピペッティングにより緩衝液1に緩衝液2を5mLずつ加える。残りの緩衝液を2本チューブに加える前に、添加を2回繰り返した。約5〜10mLの緩衝液2本がチューブ内に残されたら灌流を停止する。次いで肝臓を切除し、20mLの氷冷緩衝液2つを含む100mL培養皿に移す。層流フードの下で、外科用はさみとピンセットを使用して肝臓組織を静かに分解します。次に、約20mLの氷冷M199緩衝液を肝細胞懸濁液に加え、シリンジのプランジャーを使用して100ミクロンの細胞ストレーナーを通して濾過し、より大きな肝臓片からの追加の肝細胞の放出を穏やかに促進する。100mL培養皿とセルストレーナーをM199バッファーで洗浄し、回収チューブがいっぱいになるまで細胞懸濁液を回収した。次いで、懸濁液を50 x gで摂氏4度で2分間遠心分離する。肝細胞ペレットを旋回させて30mLの冷たいM199に再懸濁させる前に上清を吸引する。洗濯を1回繰り返します。パルミチン酸とウシ血清アルブミン、またはBSA溶液を解凍してから、複数の反応のための基質混合物を調製する。微量遠心管内の反応あたり13.5マイクロリットルのBSA溶液をアリコートする。チューブを摂氏41度に加温した後、反応ごとに1マイクロリットルの200mMパルミチン酸溶液を加える。可溶性パルミチン酸 - BSA複合体の形成を促進するために、摂氏41度で20〜30分間インキュベートの前後にチューブを激しく渦巻きます。この間、133マイクロリットルの1Mの過塩素酸をアリコートし、これを別々の1.5mLマイクロ遠心管で反応を停止するために使用する。反応を開始する前に、反応ごとに485.5マイクロリットルのM199バッファーを摂氏37度のチューブにアリコートしてインキュベートし、調製した放射性BSA−パルミチン酸複合体を希釈する。次に、インヒビターの有無にかかわらず750マイクロリットルのM199を別々の14mL丸底チューブにサンプルとして分注する。肝細胞洗浄ステップの間、反応を開始する10〜15分前に、毎分180〜200回転で摂氏37度に設定した振とう水浴にチューブを移す。肝細胞の生存率が少なくとも75%である場合、澄化されたBSA−パルミチン酸溶液を含む微量遠心管に反応当たり0.8マイクロリットルの炭素−14パルミチン酸を移すことによって基質混合物の調製を完了する。チューブを摂氏41度の水浴に戻す前の渦。最終的な肝細胞再懸濁の直後に、750マイクロリットルの肝細胞懸濁液を1mLピペットを用いて振とう水浴中の14mL丸底チューブの各々に移し、チューブを低速で短時間渦巻き、インキュベーターに移す前に、各添加を30秒ずつずらした。肝細胞の別のアリコートを1.5mL微量遠心チューブに移し、3000 x gで5分間スピンする。ペレットをマイナス80°Cで保存する前に上清を除去し、サンプル中のタンパク質の総量を測定し、結果を正規化した。肝細胞が摂氏37度でプレイインキュベーションされている間、放射性BSA-パルミチン酸複合体を温かい培地に加え、反応を開始する準備ができるまで摂氏37度に保ちます。反応を開始するには、肝細胞をウォーターバスから取り出し、500マイクロリットルの基質混合物を肝細胞に加える。細胞を低速で5秒間渦巻き、その後水浴に戻り、15分間インキュベートする。一連の反応を開始し、バックグラウンド放射能を決定するために直ちに停止する。残りの基質混合物の200〜250マイクロリットルの重複アリコートを6mLシンチレーションバイアルに移して脇に置いて、計数を行う。反応を止めるには、肝細胞をウォーターバスから取り出し、適度な速度でボルテックスすることによって再懸濁し、次いで400マイクロリットルの肝細胞懸濁液を過塩素酸を含む微量遠心チューブに移す。すべてのサンプルについてシーケンスを繰り返す前に、直ちにチューブをキャップして渦巻き、30秒ずらす。1.5 mL マイクロ遠心チューブを 13, 000 x g で 10 分間スピンダウンした後、上清 300 マイクロリットルを 6 mL シンチレーションバイアルに移し、4 mL のシンチレーション液を加えて、サンプル中の放射能をカウントし、シンチレーションカウンターで基質混合アリコートをカウントします。研究では、肝臓灌流は、肝臓あたり30〜4000万個の細胞を産生し、平均生存率は80%であり、空腹時群のグルコース濃度を低下させることは肝細胞の収量または生存率に悪影響を及ぼさなかったことも観察された。給餌および絶食雄マウスから単離された肝細胞懸濁液を、CPT1およびミトコンドリア脂肪酸酸化の強力な阻害剤であるエトモキシルの存在下および非存在下での脂肪酸β酸化能についてアッセイした。バックグラウンド放射能に関連する1分あたりのカウント(CPM)は、パルミチン酸のバッチによって異なります。しかしながら、CPMは依然として基質混合物と共にインキュベートされたサンプルよりも有意に低かった。絶食マウスから単離された肝細胞は、ミトコンドリアおよびペルオキシソーム脂肪酸β酸化の両方の速度の堅調な増加を示す。データはさらに研究され、給餌および絶食マウスから単離された肝細胞においてパルミチン酸が酸化される速度を決定した。気泡が線に入らないようにします。灌流中は針を安定させてください。肝細胞を取り扱うときは優しくしてください。それらを分配するときは、それらを懸濁させてください。この手順から単離された肝細胞は、脂肪酸合成などの他の代謝経路をアッセイするための懸濁液として使用することができ、またはそれらは細胞培養実験のために播種され得る。

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Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

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