Name: measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00
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이 연구는 Roberta Leonardi에게 국립 보건원 보조금 R35GM119528에 의해 지원되었습니다.

마우스 (C57BL / 6J, 남성, 9-11 주령)에 대한 모든 실험 절차는 웨스트 버지니아 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committees)의 승인을 받았다.
1. 간세포 분리
<ol><li>준비<ol>
<li>간세포 분리 전날에, 표 1에 열거된 완충액 및 세포 배양 배지를 준비한다. 수술이 수행 될 곳 근처에서 온도를 37 ° C로 설정한 수조를 설치하십시오.</li>
		<li>간세포 분리 당일에, 층류 후?...

<ol>
	<li>Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Metabolism+in+the+Liver.">Triglyceride Metabolism in the Liver.</a> Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease.">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).</li><li>Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+organization+of+peroxisomal+beta-oxidation.">Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).</li><li>Kerner, J., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+import+into+mitochondria.">Fatty acid import into mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).</li><li>Baker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+ABC+transporters:+functions+and+mechanism.">Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism.</a> Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PloS One. 5 (6), 11107 (2010).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).</li><li>Richert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+human+hepatocytes+in+suspension+after+isolation+is+similar+to+the+liver+of+origin,+is+not+affected+by+hepatocyte+cold+storage+and+cryopreservation,+but+is+strongly+changed+after+hepatocyte+plating.">Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating.</a> Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).</li><li>Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+expression+of+hepatocyte+protein+gene-products+associated+with+adaptation+of+cells+to+primary+culture.">Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture.</a> Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).</li><li>Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flux+control+coefficient+of+carnitine+palmitoyltransferase+I+on+palmitate+beta-oxidation+in+rat+hepatocyte+cultures.">The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures.</a> Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).</li><li>Consitt, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+coactivator-1alpha+overexpression+increases+lipid+oxidation+in+myocytes+from+extremely+obese+individuals.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals.</a> Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).</li><li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure.">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).</li><li>Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+etomoxiryl-CoA+on+different+carnitine+acyltransferases.">Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases.</a> Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+of+palmitate+change+during+postnatal+development+and+food+deprivation+in+liver,+kidney+and+heart+of+pigs.">Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs.</a> Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+hepatic+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+to+increasing+palmitate+concentrations+in+piglets.">Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets.</a> Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).</li><li>Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+rat+and+human+tissues.+Effect+of+nutritional+state,+clofibrate+treatment+and+postnatal+development+in+the+rat.">Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).</li><li>Hakvoort, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interorgan+coordination+of+the+murine+adaptive+response+to+fasting.">Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).</li><li>Sokolovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptomic+signature+of+fasting+murine+liver.">The transcriptomic signature of fasting murine liver.</a> BMC Genomics. 9, 528 (2008).</li><li>Kersten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+mediates+the+adaptive+response+to+fasting.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Rat+Hepatocytes+with+Multiparameter+Perfusion+Control.">Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).</li><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes.">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li><li>Bougarne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+blocks+glucocorticoid+receptor+alpha-mediated+transactivation+but+cooperates+with+the+activated+glucocorticoid+receptor+alpha+for+transrepression+on+NF-kappaB.">PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).</li></ol>

간 관류 중에는 기포가 간에서 미세 모세 혈관을 차단하고 완충액 순환을 예방하거나 제한하며 간세포 수율과 생존력을 전반적으로 감소시키기 때문에 기포의 도입을 피하는 것이 중요합니다20,21. IVC의 캐뉼레이션 전에 버퍼 충전된 유입 라인을 면밀히 검사하고, 본원에 기술된 바와 같이, 버퍼 1을 포함하는 튜브로부터 유입 라인을 들어 올려 버퍼 2로...

지방산 β산화는 지질 대사에 필수적인 과정으로식이 요법에서 지방산 합성과 섭취의 균형을 맞추는 이화 경로를 제공합니다. 이 과정은 심장 근육, 신장 피질 및 금식 간을 포함한 여러 장기에 대한 에너지를 생성하고식이 요법, 지방 조직 지방 분해 및 내부 트리글리 세라이드 저장 1,2에서 얻은 지방산을 활용합니다.
β산화 경로를 통한 지방산의 산화는 아세틸-CoA로서 방출되는 한 번에 두 개의 탄소에 의한 지방 아실 사슬의 순차적 단축을 초래하며, 이 과정은 미토콘드리아와 퍼옥시솜 모두에서 발생한다. 대부분의 지방산은 β산화만을 겪지만, 일부는 이 경로에 들어가기 전에 다른 탄소에서 산화됩니다. 예를 들어, 피탄산과 같은 3-메틸-치환 지방산은 α산화 경로에 들어가기 전에 퍼옥시솜에서 β산화에 의해 하나의 탄소의 제거를 겪는다. 유사하게, 일부 지방산은 먼저 소포체에서 말단 메틸기의 산화(ω-oxidation)에 의해 디카르복실산으로 전환되고, β산화에 의해 퍼옥시좀에서 우선적으로 산화된다(3).
특정 소기관에 관계없이, 지방산은 먼저 조효소 A(CoA) 티오에스테르 또는 아실-CoA로 전환되어야 하며, β산화 경로를 통해 산화되어야 한다. 미토콘드리아 매트릭스에서 장쇄 아실-CoAs의 β-산화는 그들의 전좌를 위해 카르니틴 셔틀을 필요로 하며, 여기서 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제 1(CPT1)은 아실-CoAs를 아실카르니틴으로의 전환을 촉매하고, 이 과정4에서 속도 제한 효소이다. 일단 미토콘드리아 매트릭스로 전좌되면, 아실-CoAs는 재형성되어 미토콘드리아 β산화 기계장치의 기질 역할을 한다. 금식 상태에서, 간에서 β산화를 통해 생성된 아세틸-CoA는 주로 케토제네시스로 채널링된다. 퍼옥시솜은 매우 긴 사슬, 분지쇄 및 디카르복실산의 β산화를 위한 주요 부위로서 작용한다. 페록시솜은 지방산 기질을 수입하기 위해 카르니틴 셔틀을 필요로하지 않으며, 대신 ATP 결합 카세트 (ABC) 수송체 ABCD1-35의 활성을 통해 특파원 아실-CoAs를 수입합니다. 퍼옥시좀 내에서 아실-CoAs는 미토콘드리아 지방산 β산화 기계와 구별되는 전용 효소 세트에 의해 산화됩니다. 미토콘드리아와 퍼옥시솜 모두 지방 아실 사슬을 산화시키기 위해 NAD+ 와 유리 CoA의 공급이 필요합니다. 간에서의 CoA 수준은 금식에 대한 반응에서 증가하는 것으로 나타났으며, 이 상태6에서 발생하는 지방산 산화의 증가된 속도를 지지한다. 더욱이, 퍼옥시좀에서의 증가된 CoA 분해는 퍼옥시솜 지방산 산화의 선택적 감소를 초래한다7. 따라서, 세포 내 지방산 산화의 과정은 지방산의 활성화, 수송 및 산화에 관여하는 효소의 발현 수준 및 활성뿐만 아니라 여러 세포 구획에 걸친 보조인자 및 다른 대사산물의 농도에 의해 조절된다.
지방산 산화를 측정하기 위해 조직 균질물을 사용하는 절차는 이러한 과정을 조절하고 지원하는 세포 구조를 파괴하여, 생체내 대사를 정확하게 반영하지 않는 데이터의 수집으로 이어진다. 플레이팅된 원발성 간세포를 사용하는 기술이 이 시스템을 보존하는 반면, 단리된 세포를 장기간 배양하는 것은 동물 8,9 내에 여전히 살고 있을 때 세포에 존재했던 생체내 유전자 발현 프로파일의 손실을 초래한다. 다음 프로토콜은 일차 간세포를 분리하고 [1-14C]팔미트산을 사용하여 단리 직후 및 현탁액에서 지방산 β산화에 대한 그들의 능력을 분석하는 방법을 기술한다. 상기 분석은 [1-14C]팔미트산10,11의 β산화에 의해 생성된 아세틸-CoA와 같은 산성 가용성 대사산물(ASM) 또는 생성물과 관련된 방사능의 측정에 기초한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(R)-(+)-Etomoxir sodium salt</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4539/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]-Palmitic acid, 50&#8211;60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals</td>
			<td>ARC 0172A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L, 200 &#181;L, and 10 &#181;L pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Perchloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A2296-1LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fatty acid-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>E-217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200CSPP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, 0.22 &#956;m PES Filter, 500 mL, Sterile</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulphate</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G-400-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDPE, 6.5 mL scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-342-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles 22 G, 1.5 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM Research Grade</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>accuSpin Micro 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>424270010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette MR-10, 10 &#181;L</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>TriCarb 4810 TR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScintiVerse BD cocktail</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath, 30 L capacity</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Model G76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thumb Dressing Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-8120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable-flow peristaltic pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>138762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water baths, 2&#8211;2.5 L capacity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes

지방산 β산화는 간장의 에너지 요구를 충족시키고 전신 포도당 항상성을 유지하고 금식 상태에서 간 외 장기 기능을 지원하는 데 필수적인 케톤 생성 및 글루코 신 생성과 같은 추가 과정을위한 기질 및 보조 인자를 제공하는 핵심 대사 경로입니다. 지방산 β산화는 미토콘드리아와 퍼옥시좀 내에서 발생하며 지방산의 흡수 및 활성화, 효소 발현 수준 및 조효소 A 및 NAD+와 같은 보조인자의 가용성을 포함한 여러 메커니즘을 통해 조절됩니다. 간 균질물에서 지방산 β 산화를 측정하는 분석에서, 세포 용해 및 보조인자의 초생리학적 수준의 일반적인 첨가는 이러한 조절 메카니즘의 효과를 가린다. 또한, 균질물에서 소기관의 완전성은 제어하기가 어렵고 제제마다 크게 다를 수 있습니다. 온전한 원발성 간세포에서 지방산 β산화의 측정은 위의 함정을 극복합니다. 이 프로토콜은 14C표지된 팔미트산과 함께 인큐베이션된 갓 단리된 일차 마우스 간세포의 현탁액에서 지방산 β산화를 측정하는 방법을 기술한다. 배양의 시간 내지 수일을 피함으로써, 이 방법은 먹이를 먹인 마우스에 비해 금식 마우스로부터 분리된 간세포에서 관찰된 지방산 β산화의 활성화를 포함하여 본래의 간장의 단백질 발현 수준 및 대사 경로 활성을 더 잘 보존할 수 있는 장점이 있다.

여기에 설명 된 간 관류는 일반적으로 트리판 블루 배제로 추정 된 바와 같이 평균 생존율이 80 %인 30-40 백만 세포 / 간을 산출합니다 (그림 2). 관류 완충액 1 및 2를 제조하는데 사용되는 크렙스-헨셀릿 완충액(KHB) 내의 글루코스의 전형적인 농도는 11 mM이다. 공복 마우스로부터 분리된 간세포에서 지방산 β산화를 측정할 때, KHB 내의 글루코스의 농도는 공복 상태를 더 잘 나타...

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Measurement of Fatty Acid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

지방산 β산화는 간세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 에너지를 생성하는 데 필수적인 대사 경로입니다. 여기에서, 우리는 14C표지된 팔미트산을 사용하여 갓 분리된 원발성 간세포에서 지방산 β산화를 측정하는 방법을 설명한다.

갓 분리된 마우스 간세포의 현탁액에서의 지방산 β산화의 측정

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

이 프로토콜은 일차 마우스 간세포에서 총 미토콘드리아 및 퍼옥시솜 지방산 베타 산화의 측정을 위한 강력한 방법을 제공하기 위해 개발되었다. 무손상 세포의 사용은 소기관 완전성과 조절 메커니즘을 유지합니다. 추가적으로, 갓 분리된 간세포를 분석하면 기원의 간에서 유전자 발현의 변화를 최소화할 수 있다.수술은 어려울 수 있습니다. 자신감 있고 부지런하며 집중해야합니다. 통조림이 성공하면 시도하고 긴장을 풀지 만주의를 기울이고 관류의 품질을 모니터링하십시오.절차를 시작하려면 마취 된 마우스의 복부와 가슴에 70 % 에탄올을 자유롭게 뿌리십시오. 그런 다음 포셉을 사용하여 복부 바닥 근처의 피부와 복벽을 당기고 중간 선의 양쪽과 횡격막까지 옆으로 잘라 장기를 노출시킵니다. 창자를 오른쪽으로 움직이고 간장의 엽을 부드럽게 뒤집어 열등한 정맥 카바 (IVC)를 노출시킵니다.바늘 뚜껑과 같은 작은 원통형 물체를 마우스 뒤쪽 아래에 삽입하여 IVC를 약간 기울이고 통조림을 용이하게하십시오. 가장 낮은 속도로 버퍼 하나로 펌프를 시작한 후 바늘을 IVC에 삽입하십시오. 그런 다음 포털 정맥을 잘라 압력을 완화하고 혈액 및 관류 버퍼의 배수를 허용하십시오.유속을 분당 일곱 mL로 증가시키기 전에. 따뜻한 버퍼 하나로 간을 관류시키고 버퍼 하나가 들어있는 튜브에 삽입 된 라인이 기포가 유입되지 않도록 지속적으로 잠겨 있는지 확인하십시오. 관류가 발생하는 동안 130 마이크로 리터의 콜라게나제 용액을 첨가하여 두 개의 완충액을 넣고 혈청 학적 피펫으로 피펫팅하여 혼합하십시오.버퍼 하나를 포함하는 튜브 내의 부피가 약 다섯 mL로 감소함에 따라, 튜브의 측면에 피펫팅하여 버퍼 하나를 버퍼링하기 위해 버퍼 두 mL의 다섯 mL를 천천히 첨가한다. 튜브에 나머지 버퍼 두 개를 추가하기 전에 추가를 두 번 반복하십시오. 약 5 내지 10 mL의 완충액 두 개가 튜브에 남아있을 때 관류를 중단한다.그런 다음 간을 절제하고 얼음처럼 차가운 완충액 20mL를 함유하는 100-mL 배양 접시로 옮깁니다. 층류 후드 아래에서 외과 용 가위와 핀셋을 사용하여 간 조직을 부드럽게 분리하십시오. 다음으로 간세포 현탁액에 약 20mL의 얼음처럼 차가운 M199 완충액을 첨가하고 주사기의 플런저를 사용하여 100미크론 세포 스트레이너를 통해 여과하여 더 큰 간 조각으로부터 추가적인 간세포의 방출을 부드럽게 촉진한다.100-mL 배양 접시 및 세포 스트레이너를 M199 완충액으로 세척하여 수집 튜브가 가득 찰 때까지 세포 현탁액을 수집한다. 이어서, 현탁액을 섭씨 네 도에서 두 분 동안 50 x g에서 원심분리한다. 소용돌이에 의해 차가운 M199의 30 mL에 간세포 펠릿을 재현탁시키기 전에 상청액을 흡인시킨다.세탁을 한 번 반복하십시오. 다중 반응을 위한 기질 혼합물을 제조하기 전에 팔미트산 및 소 혈청 알부민, 또는 BSA, 용액을 해동시킨다. 분취량 13.5 마이크로리터의 BSA 용액을 마이크로원심분리 튜브에서 반응시켰다.튜브를 섭씨 41도까지 따뜻하게 한 후, 반응 당 200 mM 팔미트산 용액 1 마이크로리터를 첨가한다. 가용성 팔미트산-BSA 복합체의 형성을 촉진하기 위해 섭씨 41도에서 20 내지 30분 동안 인큐베이션 전과 도중에 튜브를 격렬하게 소용돌이친다. 이 시간 동안, 1 M의 과염소산의 분취량 133 마이크로리터는 분리된 1.5-mL 마이크로원심분리 튜브에서 반응을 중지시키는데 사용될 것이다.반응을 시작하기 전에, 분취량 및 반응당 485.5 마이크로리터의 M199 완충액을 섭씨 37도의 튜브에 인큐베이션하여 제조된 방사성 BSA-팔미트산 복합체를 희석시킨다. 다음으로 억제제가 있든 없든 750 마이크로리터의 M199를 샘플로서 분리된 14-mL 둥근 바닥 튜브에 분배한다. 간세포 세척 단계 동안, 반응을 시작하기 10 내지 15분 전에, 튜브를 분당 180 내지 200회 회전으로 섭씨 37도로 설정된 진탕 수조로 옮긴다.간세포의 생존율이 75% 이상인 경우 반응 당 0.8 마이크로리터의 탄소-14 팔미트산을 정화된 BSA-팔미트산 용액을 함유하는 미세원심분리 튜브로 옮겨 기질 믹스의 제조를 완료한다. 섭씨 41도에서 수조로 튜브를 반환하기 전에 소용돌이. 최종 간세포 재현탁 직후, 750 마이크로리터의 간세포 현탁액을 하나의 mL 피펫을 사용하여 진탕 수조의 각 14-mL 둥근 바닥 튜브로 옮기고 튜브를 저속으로 잠깐 와류시킨 후 인큐베이터로 옮기기 전에 30초 동안 각 첨가를 비틀었다.간세포의 분리된 분취량을 1.5-mL 마이크로원심분리 튜브에 옮겨 5분 동안 3000 x g에서 회전시킨다. 펠렛을 영하 80도에서 보관하기 전에 상층액을 제거하여 시료 중의 단백질 총량을 측정하여 결과를 정상화한다. 간세포가 섭씨 37도에서 예비 배양되는 동안, 방사성 BSA-팔미트산 복합체를 따뜻한 배지에 첨가하여 반응을 시작할 준비가 될 때까지 섭씨 37도에서 유지하십시오.반응을 시작하려면 수조에서 간세포를 제거하고 500 마이크로 리터의 기질 믹스를 간세포에 첨가하십시오. 세포를 5초 동안 저속으로 소용돌이 치고, 수조로 복귀하기 전에 15분 동안 인큐베이션한다. 일련의 반응을 시작하고 즉시 멈추고 배경 방사능을 결정하십시오.200 내지 250 마이크로리터의 남은 기질 믹스의 중복 분취량을 6-mL 섬광 바이알에 옮기고 따로 놓아 계수를 수행한다. 반응을 중지하려면 수조에서 간세포를 제거하고 적당한 속도로 볼텍싱하여 재현탁 한 다음 400 마이크로 리터의 간세포 현탁액을 과염소산이 함유 된 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 모든 샘플에 대한 서열을 반복하기 전에 튜브를 즉시 캡하고 와류하여 30 초까지 비틀 거립니다.1.5-mL 마이크로원심분리 튜브를 13, 000 x g에서 10분 동안 방사한 후, 상층액 300 마이크로리터를 6-mL 섬광 바이알로 옮기고 섬광 유체 4 mL를 첨가하여 섬광 계수기에서 샘플과 기질 혼합 분취액의 방사능을 계수한다. 이 연구에서 간 관류는 간 당 30 ~ 40 백만 개의 세포를 산출했으며 평균 생존력은 80 %였으며 공복 그룹의 포도당 농도를 낮추면 간세포의 수율이나 생존력에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것도 관찰되었습니다. 먹이를 먹고 금식한 수컷 마우스로부터 분리된 간세포 현탁액을, CPT1 및 미토콘드리아 지방산 산화의 강력한 억제제인 에토목시르의 존재 및 부재 하에서의 지방산 베타 산화 능력에 대해 검정하였다.배경 방사능과 관련된 분당 카운트 또는 CPM은 팔미트산의 배치에 따라 다릅니다. 그러나, CPM은 여전히 기질 믹스와 함께 인큐베이션된 샘플보다 상당히 낮았다. 금식 마우스로부터 분리된 간세포는 미토콘드리아 및 퍼옥시솜 지방산 베타 산화 속도의 강력한 증가를 보여준다.데이터는 먹이를 먹고 금식한 마우스로부터 분리된 간세포에서 팔미트산이 산화되는 속도를 결정하기 위해 추가로 연구되었다. 거품이 선으로 들어가지 않도록 합니다. 관류 중에 바늘을 일정하게 유지하십시오.간세포를 다룰 때 부드럽게하십시오. 분배 할 때 서스펜션에 보관하십시오. 이 절차로부터 분리된 간세포는 지방산 합성과 같은 다른 대사 경로를 분석하기 위한 현탁액으로서 사용될 수 있거나, 또는 이들은 세포 배양 실험을 위해 플레이팅될 수 있다.

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Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

지방산의 확인 시험<em&gt; 바실러스 세레 우스</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

연구

생화학

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

보호 그룹 산 - 불안정의 보존에 적합한 니켈 쉬프 - 자료의 가수 분해 복잡한 사용 조건

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

영양 탄소 전송 및 무척 추 동물 소비자의 지질 대사에 대 한 통찰력을 제공 합니다 지방산 13C Isotopologue 프로 파일링

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

차에서 파생된 새로 설립된 세포 현탁액 배양에서 6개의 전신 살충제의 물질대사에 관한 연구(동백나무시넨시스 L.) 잎

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

핵산 프로브를 이용한 뉴클레아제 활성의 운동 스크리닝

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...