Name: measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant R35GM119528 til Roberta Leonardi.

Alle eksperimentelle prosedyrer på mus (C57BL/6J, menn, 9-11 ukers alder) ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved West Virginia University.
1. Hepatocytisolasjon
<ol><li>Forberedelse<ol>
<li>I dagene før hepatocytisolasjonen forbereder du bufferne og cellekulturmediene som er oppført i tabell 1. Sett opp et vannbad med temperaturen satt til 37 °C i nærheten av der operasjonen skal utføres.</li>
		<li>På dagen for hepatocytisolasjonen, ...

<ol>
	<li>Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Metabolism+in+the+Liver.">Triglyceride Metabolism in the Liver.</a> Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease.">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).</li><li>Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+organization+of+peroxisomal+beta-oxidation.">Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).</li><li>Kerner, J., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+import+into+mitochondria.">Fatty acid import into mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).</li><li>Baker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+ABC+transporters:+functions+and+mechanism.">Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism.</a> Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PloS One. 5 (6), 11107 (2010).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).</li><li>Richert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+human+hepatocytes+in+suspension+after+isolation+is+similar+to+the+liver+of+origin,+is+not+affected+by+hepatocyte+cold+storage+and+cryopreservation,+but+is+strongly+changed+after+hepatocyte+plating.">Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating.</a> Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).</li><li>Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+expression+of+hepatocyte+protein+gene-products+associated+with+adaptation+of+cells+to+primary+culture.">Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture.</a> Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).</li><li>Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flux+control+coefficient+of+carnitine+palmitoyltransferase+I+on+palmitate+beta-oxidation+in+rat+hepatocyte+cultures.">The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures.</a> Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).</li><li>Consitt, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+coactivator-1alpha+overexpression+increases+lipid+oxidation+in+myocytes+from+extremely+obese+individuals.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals.</a> Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).</li><li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure.">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).</li><li>Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+etomoxiryl-CoA+on+different+carnitine+acyltransferases.">Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases.</a> Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+of+palmitate+change+during+postnatal+development+and+food+deprivation+in+liver,+kidney+and+heart+of+pigs.">Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs.</a> Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+hepatic+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+to+increasing+palmitate+concentrations+in+piglets.">Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets.</a> Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).</li><li>Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+rat+and+human+tissues.+Effect+of+nutritional+state,+clofibrate+treatment+and+postnatal+development+in+the+rat.">Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).</li><li>Hakvoort, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interorgan+coordination+of+the+murine+adaptive+response+to+fasting.">Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).</li><li>Sokolovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptomic+signature+of+fasting+murine+liver.">The transcriptomic signature of fasting murine liver.</a> BMC Genomics. 9, 528 (2008).</li><li>Kersten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+mediates+the+adaptive+response+to+fasting.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Rat+Hepatocytes+with+Multiparameter+Perfusion+Control.">Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).</li><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes.">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li><li>Bougarne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+blocks+glucocorticoid+receptor+alpha-mediated+transactivation+but+cooperates+with+the+activated+glucocorticoid+receptor+alpha+for+transrepression+on+NF-kappaB.">PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).</li></ol>

Under leverens perfusjon er det viktig å unngå innføring av luftbobler, da de blokkerer mikrokapillærene i leveren, forhindrer eller begrenser buffersirkulasjonen og generelt reduserer hepatocyttutbyttet og levedyktigheten20,21. Forholdsregler, for eksempel nøye inspeksjon av den bufferfylte innløpslinjen før kanylering av IVC og unngå å løfte innløpslinjen av røret som inneholder Buffer 1 for å bytte til Buffer 2, som beskrevet heri, kan med hell re...

Fettsyre β-oksidasjon er en viktig prosess i lipidmetabolismen, og gir en katabolsk vei for å balansere fettsyresyntese og inntak fra dietten. Denne prosessen genererer energi for flere organer, inkludert hjertemuskelen, nyrebarken og fastet lever, og bruker fettsyrer hentet fra dietten, fettvev lipolyse og intern triglyserid lagrer 1,2.
Oksidasjon av fettsyre gjennom β-oksidasjonsveien resulterer i sekvensiell forkortelse av fettakylkjeden med to karboner om gangen, utgitt som acetyl-CoA, og denne prosessen skjer både i mitokondriene og peroksisomene. Mens de fleste fettsyrer bare gjennomgår β oksidasjon, oksideres noen ved forskjellige karboner før de kommer inn i denne banen. For eksempel gjennomgår 3-metyl-erstattede fettsyrer, som fytansyre, fjerning av ett karbon ved α-oksidasjon i peroksisomene før de går inn i β-oksidasjonsveien. På samme måte omdannes noen fettsyrer først til dikarboksylfettsyrer ved oksidasjon av terminal metylgruppen (ω-oksidasjon) i endoplasmatisk retikulum før de foretrekkes oksidert i peroksisomene vedβ-oksidasjon 3.
Uavhengig av den spesifikke organellen må en fettsyre først omdannes til et koenzym A (CoA) thioester, eller acyl-CoA, som skal oksideres gjennom β-oksidasjonsveien. β-oksidasjon av langkjedede acyl-coAs i mitokondriematrisen krever karnitinfergen for translokasjon, hvor karnitin palmitoyltransferase 1 (CPT1) katalyserer konverteringen av acyl-coAs til acylcarnitiner og er det hastighetsbegrensende enzymet i denne prosessen4. Når de er omplassert til mitokondriematrisen, blir acyl-coAs re-dannet og tjener som substrater for mitokondrie β-oksidasjonsmaskineri. I fastende tilstand kanaliseres acetyl-CoA produsert gjennom β-oksidasjon i hepatisk mitokondrier primært til ketogenese. Peroksisomer tjener som det primære stedet for β-oksidasjon av svært langkjedede, forgrenede kjede- og dikarboksylfettsyrer. Peroksisomer krever ikke karnitintransport for å importere fettsyresubstrater, i stedet importere korrespondent acyl-coAs gjennom aktiviteten til ATP-bindende kassett (ABC) transportører ABCD1-35. Innenfor peroksisomene oksideres acyl-coAs deretter av et dedikert sett med enzymer, forskjellig fra mitokondriefettsyren β-oksidasjonsmaskineri. Både mitokondrier og peroksisomer krever også tilførsel av NAD+ og gratis CoA for å oksidere fettakylkjeder. CoA nivåer i leveren har vist seg å øke som svar på faste, støtte den økte hastigheten på fettsyre oksidasjon som oppstår i denne tilstanden6. Videre resulterer økt CoA-nedbrytning i peroksisomene i en selektiv reduksjon i peroksimal fettsyreoksidasjon7. Derfor er prosessen med fettsyreoksidasjon i cellen regulert av uttrykksnivåene og aktivitetene til enzymer som er involvert i aktivering, transport og oksidasjon av fettsyrer, samt konsentrasjonen av kofaktorer og andre metabolitter gjennom flere subcellulære rom.
Prosedyrer som bruker vev homogenater for å måle fettsyreoksidasjon ødelegger den cellulære arkitekturen som regulerer og støtter denne prosessen, noe som fører til en samling data som ikke nøyaktig gjenspeiler in vivometabolismen. Mens teknikker som bruker belagte primære hepatocytter bevarer dette systemet, fører dyrking av isolerte celler i lengre perioder til tap av in vivo-genuttrykksprofilen som var tilstede i cellene da de fortsatt bodde i dyret 8,9. Følgende protokoll beskriver en metode for å isolere primære hepatocytter og analyse deres kapasitet for fettsyre β-oksidasjon umiddelbart etter isolasjon og suspensjon, ved hjelp av [1-14C]palmittsyre. Analysen er basert på måling av radioaktiviteten forbundet med de syreløselige metabolittene (ASM) eller produktene, som acetyl-CoA, produsert ved β-oksidasjon av [1-14C]palmitinsyre10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(R)-(+)-Etomoxir sodium salt</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4539/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]-Palmitic acid, 50&#8211;60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals</td>
			<td>ARC 0172A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L, 200 &#181;L, and 10 &#181;L pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Perchloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A2296-1LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fatty acid-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>E-217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200CSPP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, 0.22 &#956;m PES Filter, 500 mL, Sterile</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulphate</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G-400-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDPE, 6.5 mL scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-342-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles 22 G, 1.5 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM Research Grade</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>accuSpin Micro 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>424270010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette MR-10, 10 &#181;L</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>TriCarb 4810 TR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScintiVerse BD cocktail</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath, 30 L capacity</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Model G76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thumb Dressing Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-8120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable-flow peristaltic pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>138762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water baths, 2&#8211;2.5 L capacity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes

Fettsyre β-oksidasjon er en viktig metabolsk vei for å møte leverens energibehov og gi substrater og kofaktorer for flere prosesser, for eksempel ketogenese og glukoneogenese, som er avgjørende for å opprettholde helkropps glukose homeostase og støtte ekstra-leverorganfunksjon i fastet tilstand. Fettsyre β-oksidasjon skjer innenfor mitokondriene og peroksisomene og reguleres gjennom flere mekanismer, inkludert opptak og aktivering av fettsyrer, enzymuttrykksnivåer og tilgjengelighet av kofaktorer som koenzym A og NAD +. I analyser som måler fettsyre β-oksidasjon i lever homogenater, celle lysis og den vanlige tilsetningen av suprafysiologiske nivåer av kofaktorer maskere effekten av disse regulatoriske mekanismene. Videre er organellenes integritet i homogenatene vanskelig å kontrollere og kan variere betydelig mellom preparater. Målingen av fettsyre β-oksidasjon i intakte primære hepatocytter overvinner de ovennevnte fallgruvene. Denne protokollen beskriver en metode for måling av fettsyre β-oksidasjon i en suspensjon av nyisolerte primærmushedocytter inkubert med 14C-merket palmesyre. Ved å unngå timer til dager med kultur, har denne metoden fordelen av bedre å bevare proteinuttrykksnivåene og metabolske baneaktiviteten til den opprinnelige leveren, inkludert aktivering av fettsyre β-oksidasjon observert i hepatocytter isolert fra faste mus sammenlignet med matede mus.

Leverperfusjonen som er beskrevet her, gir vanligvis 30-40 millioner celler/lever med gjennomsnittlig levedyktighet på 80 %, som estimert ved trypanblå ekskludering (figur 2). Den typiske konsentrasjonen av glukose i Krebs-Henseleit-bufferen (KHB), som brukes til å forberede perfusjonsbufferne 1 og 2, er 11 mM. Ved måling av fettsyre β-oksidasjon i hepatocytter isolert fra faste mus, kan konsentrasjonen av glukose i KHB senkes for bedre å representere fastende tilstand. Som vist i <str...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

Measurement of Fatty Acid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fettsyre β-oksidasjon er en viktig metabolsk vei som er ansvarlig for å generere energi i mange forskjellige celletyper, inkludert hepatocytter. Her beskriver vi en metode for å måle fettsyre β-oksidasjon i nyisolerte primære hepatocytter ved hjelp av 14C-merket palmittsyre.

Måling av fettsyre β-oksidasjon i en suspensjon av nyisolerte musehpopatocytter

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Denne protokollen ble utviklet for å gi en robust metode for måling av total mitokondrie og peroksisom fettsyre beta-oksidasjon i primære mus hepatocytter. Bruken av intakte celler opprettholder organellets integritet og reguleringsmekanismene på plass. I tillegg minimerer analyse av nyisolerte hepatocytter endringer i genuttrykk med hensyn til opprinnelseslever.Operasjonen kan være utfordrende. Du må være selvsikker, flittig og fokusert. Når kannasjonen er vellykket, prøv å slappe av, men vær oppmerksom og overvåk kvaliteten på perfusjonen.For å starte prosedyren, spray magen og brystet til den bedøvede musen med 70% etanol. Bruk deretter tangene til å trekke opp huden og bukveggen nær bunnen av magen og kutt lateralt på hver side av midtlinjen og opp til membranen for å eksponere organene. Utsett den dårligere vena cava, eller IVC, ved å flytte tarmene til høyre side og forsiktig snu leverens lober opp.Sett inn et lite sylindrisk objekt, for eksempel en nålehette, under baksiden av musen for å vippe IVC litt og lette kanyleringen. Etter å ha startet pumpen med buffer en med lavest hastighet, sett nålen inn i IVC. Klipp deretter portalvenen for å lindre trykket og tillate drenering av blod og perfusjonsbuffere.Før du øker strømningshastigheten til syv ml per minutt. Perfuse leveren med varm buffer en og sørg for at linjen satt inn i røret som inneholder buffer man forblir kontinuerlig nedsenket for å unngå å introdusere luftbobler. Mens perfusjon oppstår, tilsett 130 mikroliter kollagenoppløsning for å buffere to, og bland ved pipettering med en serologisk pipette.Ettersom volumet i røret som inneholder buffer en reduseres til omtrent fem ml, legger du sakte til fem ml buffer to for å buffere en ved å pipettere på siden av røret. Gjenta tilsetningen to ganger før du legger til den gjenværende bufferen to i røret. Stopp perfusjonen når ca. 5 til 10 ml buffer to er igjen i røret.Sluk leveren og overfør den deretter til 100 ml kulturfat som inneholder 20 ml iskald buffer to. Under laminær strømningshette bryter du forsiktig levervevet fra hverandre ved hjelp av kirurgisk saks og pinsett. Deretter legger du til omtrent 20 ml iskald M199-buffer til hepatocytterfjæringen og filtrerer den gjennom en 100-mikron cellesil ved hjelp av stempelet på en sprøyte for forsiktig å fremme frigjøring av ekstra hepatocytter fra de større leverstykkene.Vask 100 ml kulturfatet og cellesilen med M199 buffer for å samle cellefjæringen til oppsamlingsrøret er fullt. Sentrifuger deretter suspensjonen på 50 x g i to minutter ved fire grader Celsius. Aspirer supernatanten før du bruker hepatocyttpellets på nytt i 30 ml kaldt M199 ved å virvle.Gjenta vasken én gang. Tine palmittsyren og bovint serumalbumin, eller BSA, løsninger før du forbereder substratblandingen for flere reaksjoner. Aliquot 13,5 mikroliter BSA-oppløsning per reaksjon i et mikrosenterrør.Etter oppvarming av røret til 41 grader Celsius, tilsett en mikroliter av 200 mM palmitinsyreoppløsning per reaksjon. Virvel røret kraftig før og under inkubasjon ved 41 grader Celsius i 20 til 30 minutter for å lette dannelsen av det oppløselige palmittsyre-BSA-komplekset. I løpet av denne tiden, aliquot 133 mikroliter av 1 M perklorsyre som vil bli brukt til å stoppe reaksjonene i separate 1,5 ml mikrocentrifuge rør.Før du starter reaksjonene, aliquot og inkubere 485,5 mikroliter M199 buffer per reaksjon i et rør ved 37 grader Celsius for å fortynne det forberedte radioaktive BSA-palmittsyrekomplekset. Deretter dispenserer du 750 mikroliter M199 med eller uten hemmere i de separate 14 ml runde bunnrørene som prøvene. Under hepatocytvasktrinnene, 10 til 15 minutter før du starter reaksjonene, overfør rørene til et ristende vannbad satt til 37 grader Celsius ved 180 til 200 rotasjoner per minutt.Hvis hepatocyttenes levedyktighet er minst 75%fullføre preparatet av substratblandingen ved å overføre 0,8 mikroliter karbon-14 palmitinsyre per reaksjon på mikrocentrifugerøret som inneholder den avklarte BSA-palmittsyreoppløsningen. Virvel før du returnerer røret til vannbadet ved 41 grader Celsius. Umiddelbart etter den endelige hepatocytt-resuspensionen, overfør 750 mikroliter av hepatocyttfjæringen til hver av de 14 ml runde bunnrørene i det ristende vannbadet ved hjelp av en ml pipette og virvel rørene kort ved lav hastighet før overføring til en inkubator, svimlende hvert tillegg med 30 sekunder.Overfør en separat aliquot av hepatocytter til et 1,5 ml mikrosenterrør for å spinne på 3000 x g i fem minutter. Fjern supernatanten før du lagrer pellet ved minus 80 grader Celsius for å måle den totale mengden protein i prøven for å normalisere resultatene. Mens hepatocyttene er under pre-inkubasjon ved 37 grader Celsius, legg til det radioaktive BSA-palmittsyrekomplekset til det varme mediet for å holde på 37 grader Celsius til du er klar til å starte reaksjonene.For å starte reaksjonene, fjern hepatocyttene fra vannbadet og tilsett 500 mikroliter av substratblandingen til hepatocyttene. Virvel cellene med lav hastighet i fem sekunder før du går tilbake til vannbadet for å inkubere i 15 minutter. Start et sett med reaksjoner og stopp umiddelbart for å bestemme bakgrunnen radioaktivitet.Overfør og sett til side dupliserte aliquots av 200 til 250 mikroliter av rester substrat blanding i 6 ml scintillation hetteglass for å utføre tellingen. For å stoppe reaksjonene, fjern hepatocyttene fra vannbadet for å gjenopplive ved virveling med moderat hastighet og overfør deretter 400 mikroliter av hepatocyttfjæringen til mikrocentrifugerørene som inneholder perklorsyre. Hette og virvel straks rørene før du gjentar sekvensen for alle prøvene, svimlende med 30 sekunder.Etter å ha spinnet ned de 1,5 ml mikrocentrifugerørene ved 13 000 x g i 10 minutter, overfør 300 mikroliter av supernatanten til et 6 ml scintillasjonsglass og tilsett 4 ml scintillasjonsvæske for å telle radioaktiviteten i prøvene og substratblandingen aliquots i en scintillasjonsteller. I studien ga leverperfusjonen 30 til 40 millioner celler per lever, med gjennomsnittlig levedyktighet på 80%Det ble også observert at senking av glukosekonsentrasjonen i fastinggruppen ikke hadde noen negativ effekt på utbyttet eller levedyktigheten til hepatocyttene. Hepatocytt suspensjonen, isolert fra matet og fastet mannlige mus, ble analysert for fettsyre beta-oksidasjonskapasitet i nærvær og fravær av etomoksir, en potent hemmer av CPT1 og mitokondriefettsyreoksidasjon.Antallene per minutt, eller CPM, som er forbundet med bakgrunnsradioaktiviteten, varierer med batchen av palmittsyre. Imidlertid var CPM fortsatt betydelig lavere enn prøvene inkubert med substratblandingen. Hepatocyttene isolert fra de faste musene viser en robust økning i frekvensen av både mitokondrie og peroksisomal fettsyre betaoksidasjon.Dataene ble videre studert for å bestemme hastigheten som palmittsyre oksideres i hepatocyttene isolert fra de matede og faste musene. Forhindre at bobler kommer inn i linjen. Hold nålen stødig under perfusjonen.Vær forsiktig når du håndterer hepatocyttene. Hold dem i suspensjon når du dispenserer dem. Hepatocyttene isolert fra denne prosedyren kan brukes som en suspensjon for å analyse andre metabolske veier, for eksempel fettsyresyntese, eller de kan belagt for cellekultureksperimenter.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identifisering av fettsyrer i<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyse av en Ni-Schiff-basekompleks ved hjelp av betingelser som er egnet for oppbevaring av syre-labil beskyttelsesgrupper

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Deteksjon og visualisering av DNA-skadeinducerte proteinkomplekser i suspensjoncellekulturer ved bruk av næringslysanalysen

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Rensing av hepatocytter og sinusformet endotelceller fra musen leveren perfusjon

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fettsyrer 13C Isotopologue profilering gir innsikt i Trophic karbon overføring og Lipid metabolismen av virvelløse forbrukere

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser av mitokondrie kalsium tilstrømning av isolerte mitokondrier og kultivert celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamisk Proteomic og miRNA analyse av Polysomes fra isolert musen hjertet etter Langendorff perfusjon

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studier på metabolismen av seks systemiske insektmidler i en nylig etablert Cell suspensjon kultur avledet fra Tea (Camellia Sinensis L.) Blader

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering av lipoprotein partikler fra Chicken egg eggeplomme for studier av bakteriell patogen fatty acid innlemmelse i membran fosfolipider

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetic screening av Nuklease aktivitet ved hjelp nukleinsyre acid sonder

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...