Name: measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidraget R35GM119528 till Roberta Leonardi.

Alla experimentella procedurer på möss (C57BL / 6J, män, 9-11 veckors ålder) godkändes av Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) vid West Virginia University.
1. Hepatocytisolering
<ol><li>Förberedelse<ol>
<li>Under dagarna före hepatocytisoleringen, förbered de buffertar och cellodlingsmedier som anges i tabell 1. Ställ in ett vattenbad med temperaturen inställd på 37 °C nära den plats där operationen ska utföras.</li>
		<li>På dagen för hepat...

<ol>
	<li>Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Metabolism+in+the+Liver.">Triglyceride Metabolism in the Liver.</a> Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease.">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).</li><li>Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+organization+of+peroxisomal+beta-oxidation.">Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).</li><li>Kerner, J., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+import+into+mitochondria.">Fatty acid import into mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).</li><li>Baker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+ABC+transporters:+functions+and+mechanism.">Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism.</a> Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PloS One. 5 (6), 11107 (2010).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).</li><li>Richert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+human+hepatocytes+in+suspension+after+isolation+is+similar+to+the+liver+of+origin,+is+not+affected+by+hepatocyte+cold+storage+and+cryopreservation,+but+is+strongly+changed+after+hepatocyte+plating.">Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating.</a> Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).</li><li>Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+expression+of+hepatocyte+protein+gene-products+associated+with+adaptation+of+cells+to+primary+culture.">Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture.</a> Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).</li><li>Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flux+control+coefficient+of+carnitine+palmitoyltransferase+I+on+palmitate+beta-oxidation+in+rat+hepatocyte+cultures.">The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures.</a> Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).</li><li>Consitt, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+coactivator-1alpha+overexpression+increases+lipid+oxidation+in+myocytes+from+extremely+obese+individuals.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals.</a> Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).</li><li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure.">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).</li><li>Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+etomoxiryl-CoA+on+different+carnitine+acyltransferases.">Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases.</a> Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+of+palmitate+change+during+postnatal+development+and+food+deprivation+in+liver,+kidney+and+heart+of+pigs.">Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs.</a> Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+hepatic+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+to+increasing+palmitate+concentrations+in+piglets.">Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets.</a> Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).</li><li>Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+rat+and+human+tissues.+Effect+of+nutritional+state,+clofibrate+treatment+and+postnatal+development+in+the+rat.">Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).</li><li>Hakvoort, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interorgan+coordination+of+the+murine+adaptive+response+to+fasting.">Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).</li><li>Sokolovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptomic+signature+of+fasting+murine+liver.">The transcriptomic signature of fasting murine liver.</a> BMC Genomics. 9, 528 (2008).</li><li>Kersten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+mediates+the+adaptive+response+to+fasting.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Rat+Hepatocytes+with+Multiparameter+Perfusion+Control.">Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).</li><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes.">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li><li>Bougarne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+blocks+glucocorticoid+receptor+alpha-mediated+transactivation+but+cooperates+with+the+activated+glucocorticoid+receptor+alpha+for+transrepression+on+NF-kappaB.">PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).</li></ol>

Under leverperfusionen är det viktigt att undvika införandet av luftbubblor, eftersom de blockerar mikrokapillärerna i levern, förhindrar eller begränsar buffertcirkulationen och totalt sett minskar hepatocytutbytet och livskraften20,21. Försiktighetsåtgärder, såsom att noggrant inspektera den buffertfyllda inloppsledningen före kannulering av IVC och undvika att lyfta inloppsledningen från röret som innehåller buffert 1 för att växla till buffert ...

Fettsyra β-oxidation är en viktig process i lipidmetabolism, vilket ger en katabol väg för att balansera fettsyrasyntes och intag från kosten. Denna process genererar energi för flera organ, inklusive hjärtmuskeln, njurbarken och fastande lever, och använder fettsyror erhållna från kosten, fettvävnadslipolys och inre triglyceridlager 1,2.
Oxidation av fettsyra genom β-oxidationsvägen resulterar i sekventiell förkortning av fettacylkedjan med två kol i taget, frisatt som acetyl-CoA, och denna process sker både i mitokondrierna och peroxisomerna. Medan de flesta fettsyror endast genomgår β oxidation, oxideras vissa vid olika kol innan de går in i denna väg. Till exempel genomgår 3-metylsubstituerade fettsyror, såsom fytansyra, avlägsnande av ett kol genom α-oxidation i peroxisomerna innan de går in i β-oxidationsvägen. På liknande sätt omvandlas vissa fettsyror först till dikarboxylfettsyror genom oxidation av den terminala metylgruppen (ω-oxidation) i endoplasmatisk retikulum innan de företrädesvis oxideras i peroxisomerna genom β-oxidation3.
Oavsett den specifika organellen måste en fettsyra först omvandlas till ett koenzym A (CoA) tioester, eller acyl-CoA, för att oxideras genom β-oxidationsvägen. β-oxidation av långkedjiga acyl-CoAs i mitokondriell matris kräver karnitinskytteln för deras translokation, där karnitinpalmityltransferas 1 (CPT1) katalyserar omvandlingen av acyl-CoAs till acylkarnitiner och är det hastighetsbegränsande enzymet i denna process4. När de väl har translokerats till mitokondriell matris ombildas acyl-CoA och fungerar som substrat för mitokondriella β-oxidationsmaskineriet. I fastande tillstånd kanaliseras acetyl-CoA som produceras genom β-oxidation i hepatiska mitokondrier primärt till ketogenes. Peroxisomer fungerar som den primära platsen för β-oxidation av mycket långkedjiga, grenade kedjor och dikarboxylfettsyror. Peroxisomer kräver inte att karnitinskytteln importerar fettsyrasubstrat, utan importerar korrespondenten acyl-CoAs genom aktiviteten hos ATP-bindande kassetttransportörer ABCD1-35. Inom peroxisomerna oxideras acyl-CoAs sedan av en dedikerad uppsättning enzymer, som skiljer sig från mitokondriell fettsyra β-oxidationsmaskineriet. Både mitokondrier och peroxisomer kräver också en tillförsel av NAD+ och fri CoA för att oxidera fettacylkedjor. CoA-nivåer i levern har visat sig öka som svar på fasta, stödja den ökade hastigheten av fettsyra oxidation som sker i detta tillstånd6. Dessutom resulterar ökad CoA-nedbrytning i peroxisomerna i en selektiv minskning av peroxisomal fettsyraoxidation7. Därför regleras processen med fettsyraoxidation i cellen av uttrycksnivåer och aktiviteter hos enzymer som är involverade i aktivering, transport och oxidation av fettsyror, liksom koncentrationerna av kofaktorer och andra metaboliter genom flera subcellulära fack.
Procedurer som använder vävnadshomogenater för att mäta fettsyraoxidation förstör den cellulära arkitekturen som reglerar och stöder denna process, vilket leder till en insamling av data som inte korrekt återspeglar in vivo-metabolismen. Medan tekniker som använder pläterade primära hepatocyter bevarar detta system, resulterar odling av isolerade celler under längre tidsperioder i en förlust av den in vivo-genuttrycksprofil som fanns i cellerna när de fortfarande levde i djuret 8,9. Följande protokoll beskriver en metod för att isolera primära hepatocyter och analysera deras kapacitet för fettsyra β-oxidation omedelbart efter isolering och suspension, med användning av [1-14C] palmitinsyra. Analysen är baserad på mätningen av radioaktiviteten associerad med de syralösliga metaboliterna (ASM) eller produkter, som acetyl-CoA, som produceras genom β-oxidation av [1-14C] palmitinsyra10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(R)-(+)-Etomoxir sodium salt</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4539/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]-Palmitic acid, 50&#8211;60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals</td>
			<td>ARC 0172A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L, 200 &#181;L, and 10 &#181;L pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Perchloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A2296-1LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fatty acid-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>E-217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200CSPP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, 0.22 &#956;m PES Filter, 500 mL, Sterile</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulphate</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G-400-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDPE, 6.5 mL scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-342-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles 22 G, 1.5 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM Research Grade</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>accuSpin Micro 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>424270010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette MR-10, 10 &#181;L</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>TriCarb 4810 TR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScintiVerse BD cocktail</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath, 30 L capacity</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Model G76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thumb Dressing Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-8120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable-flow peristaltic pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>138762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water baths, 2&#8211;2.5 L capacity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes

Fettsyra β-oxidation är en viktig metabolisk väg för att möta leverns energibehov och tillhandahålla substrat och kofaktorer för ytterligare processer, såsom ketogenes och glukoneogenes, som är väsentliga för att upprätthålla hela kroppens glukoshomeostas och stödja extra-hepatisk organfunktion i fastande tillstånd. Fettsyra β-oxidation sker inom mitokondrierna och peroxisomerna och regleras genom flera mekanismer, inklusive upptag och aktivering av fettsyror, enzymuttrycksnivåer och tillgänglighet av kofaktorer såsom koenzym A och NAD+. I analyser som mäter fettsyra β-oxidation i leverhomogenater maskerar celllys och den vanliga tillsatsen av suprafysiologiska nivåer av kofaktorer effekterna av dessa regleringsmekanismer. Dessutom är organellernas integritet i homogenaten svår att kontrollera och kan variera avsevärt mellan beredningarna. Mätningen av fettsyra β-oxidation i intakta primära hepatocyter övervinner ovanstående fallgropar. Detta protokoll beskriver en metod för mätning av fettsyra β-oxidation i en suspension av nyligen isolerade primära mushepatocyter inkuberade med 14C-märkt palmitinsyra. Genom att undvika timmar till dagar av kultur har denna metod fördelen att bättre bevara proteinuttrycksnivåerna och metaboliska vägaktiviteten hos den ursprungliga levern, inklusive aktivering av fettsyra β-oxidation observerad i hepatocyter isolerade från fastande möss jämfört med matade möss.

Den leverperfusion som beskrivs här ger vanligtvis 30-40 miljoner celler/lever med en genomsnittlig livskraft på 80%, enligt uppskattning av trypan blue exclusion (Figur 2). Den typiska koncentrationen av glukos i Krebs-Henseleit-bufferten (KHB), som används för att framställa perfusionsbuffertarna 1 och 2, är 11 mM. Vid mätning av fettsyra β-oxidation i hepatocyter isolerade från fastande möss kan koncentrationen av glukos i KHB sänkas för att bättre representera det fasta till...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

Measurement of Fatty Acid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fettsyra β-oxidation är en viktig metabolisk väg som är ansvarig för att generera energi i många olika celltyper, inklusive hepatocyter. Här beskriver vi en metod för att mäta fettsyra β-oxidation i nyisolerade primära hepatocyter med 14C-märkt palmitinsyra.

Mätning av fettsyra β-oxidation i en suspension av nyligen isolerade mushepatocyter

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Detta protokoll utvecklades för att ge en robust metod för mätning av total mitokondriell och peroxisomal fettsyra beta-oxidation i primära mushepatocyter. Användningen av intakta celler upprätthåller organellintegritet och de regleringsmekanismer som finns på plats. Dessutom minimerar analys av nyligen isolerade hepatocyter förändringar i genuttryck med avseende på ursprungslevern.Operationen kan vara utmanande. Du måste vara självsäker, flitig och fokuserad. När kannuleringen är framgångsrik, försök att slappna av, men var uppmärksam och övervaka kvaliteten på perfusionen.För att starta proceduren, spraya liberalt buken och bröstet på den bedövade musen med 70% etanol. Använd sedan tången för att dra upp huden och bukväggen nära bukbotten och skär i sidled på vardera sidan av mittlinjen och upp till membranet för att exponera organen. Exponera den underlägsna vena cava, eller IVC, genom att flytta tarmarna till höger sida och försiktigt vända upp leverloberna.Sätt i ett litet cylindriskt föremål, till exempel ett nålskydd, under musens baksida för att luta IVC något och underlätta kannuleringen. När du har startat pumpen med buffert en med lägsta hastighet, sätt in nålen i IVC. Skär sedan portalvenen för att lindra trycket och tillåta dränering av blod- och perfusionsbuffertar.Innan du ökar flödeshastigheten till sju ml per minut. Perfuse levern med varm buffert en och se till att linjen som sätts in i röret som innehåller buffert en förblir kontinuerligt nedsänkt för att undvika att införa luftbubblor. Medan perfusion inträffar, tillsätt 130 mikroliter kollagenaslösning för att buffra två och blanda genom pipettering med en serologisk pipett.När volymen i röret som innehåller buffert minskar man till cirka fem ml, tillsätt långsamt fem ml buffert två för att buffra en genom att pipettera på sidan av röret. Upprepa tillsatsen två gånger innan du tillsätter den återstående bufferttvåan till röret. Stoppa perfusionen när cirka 5 till 10 ml buffert två finns kvar i röret.Skär sedan levern och överför den till 100 ml odlingsskål som innehåller 20 ml iskall buffert två. Under den laminära flödeshuven, bryt försiktigt levervävnaden isär med kirurgisk sax och pincett. Tillsätt sedan cirka 20 ml iskall M199-buffert till hepatocytsupensionen och filtrera den genom en 100-mikron cellsil med hjälp av kolven i en spruta för att försiktigt främja frisättningen av ytterligare hepatocyter från de större leverbitarna.Tvätta odlingsskålen på 100 ml och cellsilen med M199-buffert för att samla upp cellsuspensionen tills uppsamlingsröret är fullt. Centrifugera sedan suspensionen vid 50 x g i två minuter vid fyra grader Celsius. Aspirera supernatanten innan du återsuspar hepatocytpelleten i 30 ml kall M199 genom att virvla.Upprepa tvätten en gång. Tina palmitinsyran och bovint serumalbumin, eller BSA, lösningar innan substrateblandningen bereds för flera reaktioner. Alikvot 13,5 mikroliter BSA-lösning per reaktion i ett mikrocentrifugrör.Efter uppvärmning av röret till 41 grader Celsius, tillsätt en mikroliter av 200 mM palmitinsyralösning per reaktion. Virvla röret kraftigt före och under inkubation vid 41 grader Celsius i 20 till 30 minuter för att underlätta bildandet av det lösliga palmitinsyra-BSA-komplexet. Under denna tid alikvoterar 133 mikroliter av 1 M perklorsyra som kommer att användas för att stoppa reaktionerna i separata 1,5 ml mikrocentrifugrör.Innan reaktionerna påbörjas, alikvotera och inkubera 485,5 mikroliter M199-buffert per reaktion i ett rör vid 37 grader Celsius för att späda det beredda radioaktiva BSA-palmitinsyrakomplexet. Därefter dispenseras 750 mikroliter M199 med eller utan hämmare i de separata 14 ml runda bottenrören som proverna. Under hepatocyttvättstegen, 10 till 15 minuter innan reaktionerna påbörjas, överför rören till ett skakningsvattenbad inställt på 37 grader Celsius vid 180 till 200 rotationer per minut.Om hepatocyternas livskraft är minst 75% slutför beredningen av substratblandningen genom överföring av 0,8 mikroliter kol-14 palmitinsyra per reaktion till mikrocentrifugröret innehållande den klarade BSA-palmitinsyralösningen. Virvel innan du återför röret till vattenbadet vid 41 grader Celsius. Omedelbart efter den slutliga hepatocytåtersuspensionen överför du 750 mikroliter av hepatocytsuspensionen till vart och ett av de 14 ml runda bottenrören i skakningsvattenbadet med en ml pipett och virvlar rören kort med låg hastighet innan de överförs till en inkubator, förskjuter varje tillsats med 30 sekunder.Överför en separat alikvot av hepatocyter till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör för att snurra vid 3000 x g i fem minuter. Ta bort supernatanten innan du förvarar pelleten vid minus 80 grader Celsius för att mäta den totala mängden protein i provet för att normalisera resultaten. Medan hepatocyterna är under förinkubation vid 37 grader Celsius, tillsätt det radioaktiva BSA-palmitinsyrakomplexet till det varma mediet för att hålla vid 37 grader Celsius tills det är klart att starta reaktionerna.För att starta reaktionerna, ta bort hepatocyterna från vattenbadet och tillsätt 500 mikroliter av substratblandningen till hepatocyterna. Virvla cellerna med låg hastighet i fem sekunder innan de återgår till vattenbadet för att inkubera i 15 minuter. Starta en uppsättning reaktioner och sluta omedelbart för att bestämma bakgrundsradioaktiviteten.Överför och lägg de dubbla alikvoterna på 200 till 250 mikroliter av den kvarvarande substratblandningen åt sidan i 6 ml scintillationsflaskor för att utföra räkningen. För att stoppa reaktionerna, ta bort hepatocytocyterna från vattenbadet för att återsuspendera genom virvel med måttlig hastighet och överför sedan 400 mikroliter av hepatocytsuspensionen till mikrocentrifugrören som innehåller perklorsyra. Täck omedelbart och virvla rören innan du upprepar sekvensen för alla prover, svindlande med 30 sekunder.Efter att ha snurrat ner 1,5 ml mikrocentrifugrören vid 13 000 x g i 10 minuter, överför 300 mikroliter av supernatanten till en 6 ml scintillationsflaska och tillsätt 4 ml av scintillationsvätskan för att räkna radioaktiviteten i proverna och substratblandningen alikvoter i en scintillationsräknare. I studien gav leverperfusionen 30 till 40 miljoner celler per lever, med en genomsnittlig livskraft på 80%Det observerades också att sänkning av glukoskoncentrationen i fastegruppen inte hade någon negativ effekt på hepatocyternas utbyte eller livskraft. Hepatocytsuspensionen, isolerad från matade och fastande hanmöss, analyserades för fettsyrabeta-oxidationskapacitet i närvaro och frånvaro av etomoxir, en potent hämmare av CPT1 och mitokondriell fettsyraoxidation.Antalet per minut, eller CPM, associerat med bakgrundsradioaktiviteten varierar med satsen palmitinsyra. CPM var dock fortfarande signifikant lägre än de prover som inkuberades med substratblandningen. Hepatocyterna isolerade från de fastande mössen visar en robust ökning av hastigheterna för både mitokondriell och peroxisomal fettsyra beta-oxidation.Data studerades vidare för att bestämma hastigheten med vilken palmitinsyra oxideras i hepatocyterna isolerade från de matade och fastande mössen. Förhindra att bubblor kommer in i linjen. Håll nålen stadig under perfusionen.Var försiktig när du hanterar hepatocyterna. Håll dem i suspension när du dispenserar dem. Hepatocyterna isolerade från denna procedur kan användas som en suspension för att analysera andra metaboliska vägar, såsom fettsyrasyntes, eller de kan pläteras för cellodlingsexperiment.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identifiering av fettsyror i<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolys av en Ni-Schiff-Base Complex Använda betingelser som är lämpliga för Bibehållande av syralabil skydds Grupper

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detektion och visualisering av DNA-skada-inducerad proteinkomplex i suspensionscellkulturer med användning av Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Rening av hepatocyter och sinusformad Endothelial celler från mus lever Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fettsyra 13C Isotopologue profilering ger inblick i trofiska Carbon överföring och lipidmetabolismen ryggradslösa konsumenternas

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser av mitokondrie kalcium tillströmningen i isolerade mitokondrier och odlade celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamisk proteomiska och miRNA analyser av Polysomes från isolerade mus hjärtat efter av Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie om metabolismen av sex systemiska insekticider i en nyetablerad cell SUS pension kultur härledd från Tea (Camellia sinensis L.) Lämnar

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering av Lipoproteinpartiklar från kyckling äggula för studiet av bakteriell patogen fettsyra inkorporering i Membranfosfolipider

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetisk screening av Nukleasaktivitet med hjälp av Nukleinsyrprober

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...