Name: measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes
Uploaded: 2021-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Roberta Leonardi'ye R35GM119528 hibesi ile desteklenmiştir.

Fareler (C57BL / 6J, erkekler, 9-11 haftalık) üzerindeki tüm deneysel prosedürler, Batı Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Hepatosit izolasyonu
<ol><li>Hazırlık<ol>
<li>Hepatosit izolasyonundan önceki günlerde, Tablo 1'de listelenen tamponları ve hücre kültürü ortamını hazırlayın. Ameliyatın yapılacağı yere yakın sıcaklık 37 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosu kurun.</li>
		<...

<ol>
	<li>Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Metabolism+in+the+Liver.">Triglyceride Metabolism in the Liver.</a> Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease.">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).</li><li>Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+organization+of+peroxisomal+beta-oxidation.">Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).</li><li>Kerner, J., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+import+into+mitochondria.">Fatty acid import into mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).</li><li>Baker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+ABC+transporters:+functions+and+mechanism.">Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism.</a> Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).</li><li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state.">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PloS One. 5 (6), 11107 (2010).</li><li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver.">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).</li><li>Richert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+human+hepatocytes+in+suspension+after+isolation+is+similar+to+the+liver+of+origin,+is+not+affected+by+hepatocyte+cold+storage+and+cryopreservation,+but+is+strongly+changed+after+hepatocyte+plating.">Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating.</a> Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).</li><li>Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+expression+of+hepatocyte+protein+gene-products+associated+with+adaptation+of+cells+to+primary+culture.">Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture.</a> Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).</li><li>Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flux+control+coefficient+of+carnitine+palmitoyltransferase+I+on+palmitate+beta-oxidation+in+rat+hepatocyte+cultures.">The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures.</a> Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).</li><li>Consitt, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+coactivator-1alpha+overexpression+increases+lipid+oxidation+in+myocytes+from+extremely+obese+individuals.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals.</a> Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).</li><li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure.">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).</li><li>Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+etomoxiryl-CoA+on+different+carnitine+acyltransferases.">Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases.</a> Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+of+palmitate+change+during+postnatal+development+and+food+deprivation+in+liver,+kidney+and+heart+of+pigs.">Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs.</a> Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).</li><li>Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+hepatic+mitochondrial+and+peroxisomal+beta-oxidation+to+increasing+palmitate+concentrations+in+piglets.">Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets.</a> Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).</li><li>Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+rat+and+human+tissues.+Effect+of+nutritional+state,+clofibrate+treatment+and+postnatal+development+in+the+rat.">Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).</li><li>Hakvoort, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interorgan+coordination+of+the+murine+adaptive+response+to+fasting.">Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).</li><li>Sokolovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptomic+signature+of+fasting+murine+liver.">The transcriptomic signature of fasting murine liver.</a> BMC Genomics. 9, 528 (2008).</li><li>Kersten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+mediates+the+adaptive+response+to+fasting.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Rat+Hepatocytes+with+Multiparameter+Perfusion+Control.">Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).</li><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).</li><li>Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+metformin+on+fatty+acid+and+glucose+metabolism+in+freshly+isolated+hepatocytes+and+on+specific+gene+expression+in+cultured+hepatocytes.">Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes.</a> Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).</li><li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance.">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).</li><li>Bougarne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+blocks+glucocorticoid+receptor+alpha-mediated+transactivation+but+cooperates+with+the+activated+glucocorticoid+receptor+alpha+for+transrepression+on+NF-kappaB.">PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).</li></ol>

Karaciğer perfüzyonu sırasında, karaciğerdeki mikrokılcal damarları bloke ettiklerinden, tampon dolaşımını önledikleri veya kısıtladıkları ve genel olarak hepatosit verimini ve canlılığını azalttıkları için hava kabarcıklarının girmesini önlemek çok önemlidir20,21. IVC'nin kanülasyonundan önce tampon dolu giriş hattının yakından incelenmesi ve burada açıklandığı gibi Tampon 2'ye geçmek için Tampon 1'i içeren tüpten gir...

Yağ asidi β-oksidasyonu, lipid metabolizmasında önemli bir süreçtir ve yağ asidi sentezini ve diyetten alımını dengelemek için katabolik bir yol sağlar. Bu süreç, kalp kası, böbrek korteksi ve oruç tutmuş karaciğer dahil olmak üzere birçok organ için enerji üretir ve diyet, yağ dokusu lipolizi ve iç trigliserit depolarından elde edilen yağ asitlerini kullanır 1,2.
Yağ asidinin β-oksidasyon yolundan oksidasyonu, yağ açil zincirinin bir seferde iki karbon tarafından sırayla kısalmasına neden olur, asetil-CoA olarak salınır ve bu işlem hem mitokondride hem de peroksizomlarda gerçekleşir. Çoğu yağ asidi sadece β oksidasyona uğrarken, bazıları bu yola girmeden önce farklı karbonlarda oksitlenir. Örneğin, fitanik asit gibi 3-metil ikame edilmiş yağ asitleri, α-oksidasyon yoluna girmeden önce peroksizomlarda β-oksidasyon ile bir karbonun uzaklaştırılmasına uğrar. Benzer şekilde, bazı yağ asitleri ilk önce endoplazmik retikulumdaki terminal metil grubunun (ω-oksidasyon) oksidasyonu ile dikarboksilik yağ asitlerine dönüştürülür ve tercihen peroksizomlarda β-oksidasyon3 ile oksitlenir.
Spesifik organelden bağımsız olarak, bir yağ asidi önce β-oksidasyon yolundan oksitlenmek üzere bir koenzim A (CoA) tiyoesterine veya açil-CoA'ya dönüştürülmelidir. β-Mitokondriyal matriksteki uzun zincirli açil-CoAs'ın oksidasyonu, translokasyonları için karnitin mekiğine ihtiyaç duyar, burada karnitin palmitoyltransferaz 1 (CPT1), açil-CoAs'ın asilkarnitinlere dönüşümünü katalize eder ve bu işlemde hız sınırlayıcı enzimdir4. Mitokondriyal matrise aktarıldıktan sonra, açil-CoAs yeniden oluşturulur ve mitokondriyal β-oksidasyon makineleri için substratlar olarak işlev görür. Oruç tutulan durumda, hepatik mitokondride β-oksidasyon yoluyla üretilen asetil-CoA öncelikle ketogeneze kanalize edilir. Peroksizomlar, çok uzun zincirli, dallı zincirli ve dikarboksilik yağ asitlerinin β oksidasyonu için birincil bölge olarak işlev görür. Peroksizomlar, karnitin mekiğinin yağ asidi substratlarını ithal etmesini gerektirmez, bunun yerine ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları ABCD1-35'in aktivitesi yoluyla karşılık gelen açil-CoAs'ı ithal eder. Peroksizomlar içinde, açil-CoA'lar daha sonra mitokondriyal yağ asidi β-oksidasyon makinesinden farklı olarak özel bir enzim seti tarafından oksitlenir. Hem mitokondri hem de peroksizomlar, yağlı açil zincirlerini oksitlemek için NAD + ve serbest CoA tedariki gerektirir. Karaciğerdeki CoA seviyelerinin, açlığa yanıt olarak arttığı ve bu durumda meydana gelen yağ asidi oksidasyon oranının artmasını desteklediği gösterilmiştir6. Ayrıca, peroksizomlarda artan CoA bozunumu, peroksizomal yağ asidi oksidasyonunda seçici bir azalmaya nedenolur 7. Bu nedenle, hücre içindeki yağ asidi oksidasyon süreci, yağ asitlerinin aktivasyonu, taşınması ve oksidasyonunda yer alan enzimlerin ekspresyon seviyeleri ve aktivitelerinin yanı sıra çoklu hücre altı bölmeler boyunca kofaktörlerin ve diğer metabolitlerin konsantrasyonları ile düzenlenir.
Yağ asidi oksidasyonunu ölçmek için doku homojenatları kullanan prosedürler, bu süreci düzenleyen ve destekleyen hücresel mimariyi tahrip eder ve bu da in vivo metabolizmayı doğru bir şekilde yansıtmayan bir veri toplanmasına yol açar. Kaplanmış primer hepatositleri kullanan teknikler bu sistemi korurken, izole hücrelerin uzun süre kültürlenmesi, hala hayvan içinde yaşarken hücrelerde bulunan in vivo gen ekspresyon profilinin kaybına neden olur 8,9. Aşağıdaki protokol, primer hepatositleri izole etmek ve [1-14C] palmitik asit kullanarak, izolasyondan hemen sonra ve süspansiyonda yağ asidi β-oksidasyon kapasitelerini test etmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Tahlil, asitte çözünür metabolitler (ASM) veya [1-14 C] palmitik asit10,11'in β-oksidasyonu ile üretilen asetil-CoA gibi ürünlerle ilişkili radyoaktivitenin ölçümüne dayanmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(R)-(+)-Etomoxir sodium salt</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4539/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-14C]-Palmitic acid, 50&#8211;60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals</td>
			<td>ARC 0172A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L, 200 &#181;L, and 10 &#181;L pipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Perchloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A2296-1LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fatty acid-free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>E-217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200CSPP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, 0.22 &#956;m PES Filter, 500 mL, Sterile</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulphate</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G-400-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDPE, 6.5 mL scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-342-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles 22 G, 1.5 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM Research Grade</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>accuSpin Micro 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>424270010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette MR-10, 10 &#181;L</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>TriCarb 4810 TR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScintiVerse BD cocktail</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath, 30 L capacity</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Model G76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thumb Dressing Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>RS-8120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25900CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable-flow peristaltic pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>138762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water baths, 2&#8211;2.5 L capacity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated mouse hepatocytes

Yağ asidi β-oksidasyonu, karaciğerin enerji taleplerini karşılamak ve tüm vücut glikoz homeostazını korumak ve açlık durumunda ekstra-hepatik organ fonksiyonunu desteklemek için gerekli olan ketogenez ve glukoneogenez gibi ek işlemler için substratlar ve kofaktörler sağlamak için önemli bir metabolik yoldur. Yağ asidi β-oksidasyonu, mitokondri ve peroksizomlarda meydana gelir ve yağ asitlerinin alımı ve aktivasyonu, enzim ekspresyon seviyeleri ve koenzim A ve NAD + gibi kofaktörlerin mevcudiyeti dahil olmak üzere çoklu mekanizmalarla düzenlenir. Karaciğer homojenatlarında yağ asidi β-oksidasyonunu ölçen tahlillerde, hücre lizisi ve kofaktörlerin suprafizyolojik seviyelerinin yaygın olarak eklenmesi, bu düzenleyici mekanizmaların etkilerini maskelemektedir. Ayrıca, homojenatlardaki organellerin bütünlüğünün kontrol edilmesi zordur ve preparatlar arasında önemli ölçüde değişebilir. Bozulmamış primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunun ölçümü yukarıdaki tuzakların üstesinden gelir. Bu protokol, 14C etiketli palmitik asit ile inkübe edilmiş taze izole edilmiş birincil fare hepatositlerinin bir süspansiyonunda yağ asidi β-oksidasyonunun ölçülmesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Saatlerce kültürden kaçınarak, bu yöntem, beslenen farelere kıyasla oruç tutan farelerden izole edilen hepatositlerde gözlenen yağ asidi β-oksidasyonunun aktivasyonu da dahil olmak üzere, orijinal karaciğerin protein ekspresyon seviyelerini ve metabolik yol aktivitesini daha iyi koruma avantajına sahiptir.

Burada tarif edilen karaciğer perfüzyonu tipik olarak, tripan mavisi dışlaması ile tahmin edildiği gibi, ortalama% 80 canlılığa sahip 30-40 milyon hücre / karaciğer verir (Şekil 2). Perfüzyon Tamponları 1 ve 2'yi hazırlamak için kullanılan Krebs-Henseleit tamponundaki (KHB) tipik glikoz konsantrasyonu 11 mM'dir. Oruç tutan farelerden izole edilen hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçerken, KHB'deki glikoz konsantrasyonu, açlık durumunu daha iyi temsil etmek iç...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Fatty Acid ÃŽÂ²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes at JoVE.com

Measurement of Fatty Acid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Yağ asidi β-oksidasyonu, hepatositler de dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde enerji üretmekten sorumlu önemli bir metabolik yoldur. Burada, 14C etiketli palmitik asit kullanarak taze izole edilmiş primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Bu protokol, primer fare hepatositlerinde total mitokondriyal ve peroksizomal yağ asidi beta-oksidasyonunun ölçümü için sağlam bir yöntem sağlamak amacıyla geliştirilmiştir. Sağlam hücrelerin kullanımı organel bütünlüğünü ve düzenleyici mekanizmaları yerinde tutar. Ek olarak, taze izole edilmiş hepatositlerin tahlili, orijin karaciğerine göre gen ekspresyonundaki değişiklikleri en aza indirir.Ameliyat zor olabilir. Kendinden emin, gayretli ve odaklanmış olmalısın. Kanülasyon başarılı olduktan sonra, deneyin ve rahatlayın, ancak perfüzyonun kalitesine dikkat edin ve izleyin.Prosedürü başlatmak için, anestezi uygulanan farenin karnını ve göğsünü % 70 etanol ile serbestçe püskürtün. Daha sonra forsepsleri kullanarak karın tabanının yakınındaki cildi ve karın duvarını yukarı çekin ve organları açığa çıkarmak için orta hattın her iki tarafında ve diyaframa kadar yanal olarak kesin. Bağırsakları sağ tarafa hareket ettirerek ve karaciğerin loblarını hafifçe yukarı çevirerek inferior vena kava veya IVC'yi açığa çıkarın.IVC'yi hafifçe eğmek ve kanülasyonu kolaylaştırmak için farenin arkasına iğne kapağı gibi küçük bir silindirik nesne yerleştirin. Pompayı tamponla en düşük hızda çalıştırdıktan sonra, iğneyi IVC'ye yerleştirin. Daha sonra basıncı hafifletmek ve kan ve perfüzyon tamponlarının drenajına izin vermek için portal damarı kesin.Akış hızını dakikada yedi mL'ye çıkarmadan önce. Karaciğeri ılık tamponla perfüze edin ve hava kabarcıklarının ortaya çıkmasını önlemek için tampon içeren tüpe yerleştirilen çizginin sürekli olarak suya batırıldığından emin olun. Perfüzyon meydana gelirken, ikisini tamponlamak için 130 mikrolitre kollajenaz çözeltisi ekleyin ve serolojik bir pipetle pipetleyerek karıştırın.Tampon içeren tüpteki hacim yaklaşık beş mL'ye düştüğünde, tüpün yan tarafına pipetleme yaparak birini tamponlamak için yavaşça beş mL tampon iki ekleyin. Kalan tampon ikisini tüpe eklemeden önce eklemeyi iki kez tekrarlayın. Tüpte yaklaşık 5 ila 10 mL tampon iki bırakıldığında perfüzyonu durdurun.Daha sonra karaciğeri tüketin ve 20 mL buz gibi soğuk tampon iki içeren 100 mL kültür kabına aktarın. Laminer akış başlığının altında, cerrahi makas ve cımbız kullanarak karaciğer dokusunu yavaşça ayırın. Daha sonra hepatositlerin süspansiyonuna yaklaşık 20 mL buz gibi soğuk M199 tamponu ekleyin ve daha büyük karaciğer parçalarından ek hepatositlerin salınmasını nazikçe teşvik etmek için bir şırınganın pistonunu kullanarak 100 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün.Toplama tüpü dolana kadar hücre süspansiyonunu toplamak için 100 mL kültür kabını ve hücre süzgecini M199 tamponu ile yıkayın. Daha sonra süspansiyonu dört santigrat derecede iki dakika boyunca 50 x g'de santrifüj edin. Hepatosit peletini 30 mL soğuk M199'da döndürerek yeniden askıya almadan önce süpernatantı aspire edin.Yıkamayı bir kez tekrarlayın. Substrat karışımını çoklu reaksiyonlar için hazırlamadan önce palmitik asit ve sığır serum albümini veya BSA çözeltilerini çözün. Bir mikrosantrifüj tüpünde reaksiyon başına Aliquot 13.5 mikrolitre BSA çözeltisi.Tüpü 41 santigrat dereceye ısıttıktan sonra, reaksiyon başına 200 mM palmitik asit çözeltisinden bir mikrolitre ekleyin. Çözünür palmitik asit-BSA kompleksinin oluşumunu kolaylaştırmak için tüpü 41 santigrat derecede inkübasyondan önce ve sırasında 20 ila 30 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde vorteksleyin. Bu süre zarfında, ayrı 1.5-mL mikrosantrifüj tüplerindeki reaksiyonları durdurmak için kullanılacak olan 133 mikrolitre 1 M perklorik asit aliquot.Reaksiyonlara başlamadan önce, hazırlanan radyoaktif BSA-palmitik asit kompleksini seyreltmek için reaksiyon başına 485.5 mikrolitre M199 tamponunu 37 santigrat derecede bir tüpe inkübe edin ve inkübe edin. Daha sonra, numuneler olarak ayrı 14-mL yuvarlak tabanlı tüplerde inhibitörlü veya inhibitörsüz 750 mikrolitre M199 dağıtın. Hepatosit yıkama adımları sırasında, reaksiyonlara başlamadan 10 ila 15 dakika önce, tüpleri dakikada 180 ila 200 dönüşte 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir sallanan su banyosuna aktarın.Hepatositlerin yaşayabilirliği en az% 75 ise, arıtılmış BSA-palmitik asit çözeltisini içeren mikrosantrifüj tüpüne reaksiyon başına 0.8 mikrolitre karbon-14 palmitik asit aktarılarak substrat karışımının hazırlanması. Tüpü 41 santigrat derecede su banyosuna döndürmeden önce vorteks. Son hepatosit süspansiyonundan hemen sonra, bir mL pipet kullanarak sallanan su banyosundaki 14 mL'lik yuvarlak alt tüplerin her birine 750 mikrolitre hepatosit süspansiyonu aktarın ve tüpleri bir inkübatöre aktarmadan önce kısa bir süre düşük hızda vorteksleyin, her bir ilaveyi 30 saniye kademelendirin.Ayrı bir hepatosit aliquotunu beş dakika boyunca 3000 x g'de döndürmek için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Sonuçları normalleştirmek için numunedeki toplam protein miktarını ölçmek için peleti eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce süpernatantı çıkarın. Hepatositler 37 santigrat derecede ön inkübasyon altındayken, reaksiyonlara başlamaya hazır olana kadar 37 santigrat derecede tutmak için radyoaktif BSA-palmitik asit kompleksini ılık ortama ekleyin.Reaksiyonları başlatmak için, hepatositleri su banyosundan çıkarın ve hepatositlere 500 mikrolitre substrat karışımı ekleyin. 15 dakika boyunca inkübe etmek için su banyosuna dönmeden önce hücreleri beş saniye boyunca düşük bir hızda vorteksleyin. Bir dizi reaksiyon başlatın ve arka plan radyoaktivitesini belirlemek için hemen durun.Sayımı gerçekleştirmek için artık substrat karışımının 200 ila 250 mikrolitrelik yinelenen alikotlarını 6-mL sintilasyon şişelerine aktarın ve bir kenara koyun. Reaksiyonları durdurmak için, hepatositleri su banyosundan çıkarın ve orta hızda vorteks yaparak yeniden askıya alın ve ardından hepatosit süspansiyonunun 400 mikrolitresini perklorik asit içeren mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Tüm numuneler için sırayı tekrarlamadan önce tüpleri hemen kapatın ve vorteksleyin, 30 saniye boyunca kademelendirin.1.5-mL mikrosantrifüj tüplerini 10 dakika boyunca 13.000 x g'de döndürdükten sonra, süpernatantın 300 mikrolitresini 6-mL'lik bir sintilasyon şişesine aktarın ve numunelerdeki radyoaktiviteyi saymak için parıltı sıvısının 4 mL'sini ekleyin ve substrat bir sintilasyon sayacındaki alikotları karıştırın. Çalışmada, karaciğer perfüzyonu karaciğer başına 30 ila 40 milyon hücre verdi, ortalama% 80 canlılık ileAçlık grubundaki glikoz konsantrasyonunun düşürülmesinin hepatositlerin verimi veya canlılığı üzerinde olumsuz bir etkisi olmadığı da gözlendi. Beslenen ve oruç tutan erkek farelerden izole edilen hepatosit süspansiyonu, CPT1 ve mitokondriyal yağ asidi oksidasyonunun güçlü bir inhibitörü olan etomoksir varlığında ve yokluğunda yağ asidi beta-oksidasyon kapasitesi açısından test edildi.Arka plan radyoaktivitesi ile ilişkili dakika başına sayım veya BGBM, palmitik asit grubuna göre değişir. Bununla birlikte, CPM, substrat karışımı ile inkübe edilen örneklerden hala önemli ölçüde daha düşüktü. Açlık çeken farelerden izole edilen hepatositler, hem mitokondriyal hem de peroksizomal yağ asidi beta-oksidasyon oranlarında sağlam bir artış göstermektedir.Veriler, beslenen ve oruç tutan farelerden izole edilen hepatositlerde palmitik asidin oksitlenme oranını belirlemek için daha fazla çalışılmıştır. Kabarcıkların çizgiye girmesini önleyin. Perfüzyon sırasında iğneyi sabit tutun.Hepatositleri kullanırken nazik olun. Onları dağıtırken süspansiyonda tutun. Bu prosedürden izole edilen hepatositler, yağ asidi sentezi gibi diğer metabolik yolları test etmek için bir süspansiyon olarak kullanılabilir veya hücre kültürü deneyleri için kaplanabilirler.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Yağ Asitlerinin Tanımlanması içinde<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Koruma Grupları aside dayanıksız Saklanmasına için uygun bir Ni-Schiff-Base hidrolizi Kompleksi kullanma Koşullar

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Yağ asidi 13C profil oluşturma Isotopologue trofik karbon Transfer ve Lipid metabolizması, omurgasız tüketicilerin sağlar

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Çay (Camellia sinensis L.) türetilmiştir yeni kurulan hücre süspansiyon kültürü altı sistemik Böcek Ilacı metabolizması üzerinde çalışma Yaprak -ları

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nükleik Asit Probları Kullanılarak Nükleaz Aktivitesinin Kinetik Taraması

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...