Name: determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples
Uploaded: 2021-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples at JoVE.com

Diese Arbeit wird durch das Intramurale Forschungsprogramm des National Eye Institute (ZIAEY000450 und ZIAEY000546) unterstützt.

Alle Mausprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee des National Eye Institute (NEI ASP# 650) genehmigt. Die Mäuse wurden unter 12-stündigen Hell-Dunkel-Bedingungen untergebracht und nach den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren, des Instituts für Labortierressourcen und der Politik des öffentlichen Gesundheitsdienstes zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren versorgt.
1. Hydratisierende Sensorkartusche und Vorbereitung des Assay-Medium...

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Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>Fan, Y. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+outer+retina+contributes+to+light-evoked+increase+in+hydration+in+vivo.">Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li></ol>

Hier finden Sie detaillierte Anweisungen zur Durchführung von Mikroplatten-basierten Assays der mitochondrialen Atmung und Glykolyseaktivität unter Verwendung von ex vivo, frisch sezierten netztinalen Lochscheiben. Das Protokoll wurde optimiert, um: 1) die Verwendung eines geeigneten Assay-Mediums für ex vivo Netzhautgewebe sicherzustellen; 2) Verwenden Sie die richtige Größe von netztinalen Stanzscheiben, um OCR- und ECAR-Messwerte zu erhalten, die in den optimalen Erfassungsbereich der Maschine f...

Mitochondrien sind essentielle Organellen, die den Zellstoffwechsel, die Signalübertragung, die Homöostase und die Apoptose regulieren, indem sie mehrere entscheidende physiologische Prozesse koordinieren1. Mitochondrien dienen als Kraftpaket in der Zelle, um Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) zu erzeugen und Energie bereitzustellen, die fast alle zellulären Ereignisse unterstützt. Der Großteil des zellulären Sauerstoffs wird in Mitochondrien metabolisiert, wo er während der aeroben Atmung als letzter Elektronenakzeptor in der Elektronentransportkette (ETC) dient. Geringe Mengen an ATP können auch aus der Glykolyse im Zytosol hergestellt werden, wo Glukose in Pyruvat umgewandelt wird, das weiter in Laktat umgewandelt oder in Mitochondrien transportiert und zu Acetyl-CoA, einem Substrat im Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus), oxidiert werden kann.
Die Netzhaut ist eines der metabolisch aktivsten Gewebe bei Säugetieren2 und weist eine hohe mitochondriale Atmung und einen extrem hohen Sauerstoffverbrauch auf3. Die Stäbchen- und Zapfenphotorezeptoren enthalten eine hohe Dichte an Mitochondrien4, und OXPHOS erzeugt das meiste ATP in der Netzhaut5. Darüber hinaus stützt sich die Netzhaut auch stark auf die aerobe Glykolyse6,7, indem sie Glukose in Laktat umwandelt5. Mitochondriale Defekte sind mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert8,9; und mit ihrem einzigartigen hohen Energiebedarf ist die Netzhaut besonders anfällig für Stoffwechseldefekte, einschließlich solcher, die mitochondriales OXPHOS4 und Glykolyse10 betreffen. Mitochondriale Dysfunktion und Defekte in der Glykolyse sind an degenerativen Erkrankungen der Netzhaut11,12 und Makula 13, altersbedingter Makuladegeneration10,14,15,16 und diabetischer Retinopathie 17,18 beteiligt. Daher können genaue Messungen der mitochondrialen Atmung und Glykolyse wichtige Parameter für die Beurteilung der Integrität und Gesundheit der Netzhaut liefern.
Die mitochondriale Atmung kann durch die Bestimmung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) gemessen werden. Da die Umwandlung von Glukose in Pyruvat und anschließend in Laktat zur Extrusion von Protonen in die extrazelluläre Umgebung und zur Versauerung der extrazellulären Umgebung führt, liefern Messungen der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) einen Hinweis auf den Glykolysefluss. Da die Netzhaut aus mehreren Zelltypen mit intimen Beziehungen und aktiver Synergie besteht, einschließlich des Austauschs von Substraten6, ist es unerlässlich, die mitochondriale Funktion und den Stoffwechsel im Kontext des gesamten Netzhautgewebes mit intakter Laminierung und Schaltkreise zu analysieren. In den letzten Jahrzehnten wurden die Clark-O2-Elektroden und andere Sauerstoffmikroelektroden verwendet, um den Sauerstoffverbrauch in der Netzhaut zu messen19,20,21. Diese Sauerstoffelektroden haben große Einschränkungen in der Empfindlichkeit, die Anforderung eines großen Probenvolumens und die Notwendigkeit eines kontinuierlichen Rührens der suspendierenden Probe, was normalerweise zur Störung des Zell- und Gewebekontexts führt. Das hier beschriebene Protokoll wurde unter Verwendung einer Mikroplatten-basierten Fluoreszenztechnik entwickelt, um den mitochondrialen Energiestoffwechsel in frisch seziertem Ex-vivo-Netzhautgewebe der Maus zu messen. Es ermöglicht Echtzeitmessungen von OCR und ECAR im mittleren Durchsatz gleichzeitig mit einer kleinen Probe (1 mm Stempel) von Ex-vivo-Netzhautgewebe, wobei die Notwendigkeit einer Suspension und eines kontinuierlichen Rührens vermieden wird.
Demonstriert wird hier das experimentelle Verfahren für den mitochondrialen Stresstest und den glykolytischen Geschwindigkeitstest auf frisch sezierten netztinalen Stanzscheiben. Dieses Protokoll ermöglicht die Messung von mitochondrienbedingten Stoffwechselaktivitäten in einem ex vivo Gewebekontext. Im Gegensatz zu den Assays, die mit kultivierten Zellen durchgeführt werden, spiegeln die hier erhaltenen Messwerte den kombinierten Energiestoffwechsel auf Gewebeebene wider und werden durch Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zelltypen innerhalb des Gewebes beeinflusst. Das Protokoll wurde gegenüber einer zuvor veröffentlichten Version22,23 modifiziert, um es an die neue Generation des Agilent Seahorse Extracellular Flux 24-Wells (XFe24) Analysators mit Islet Capture Platte anzupassen. Das Assay-Medium, die Konzentrationen der Injektionsverbindungen und die Anzahl/Dauer der Assay-Zyklen wurden ebenfalls für das Netzhautgewebe optimiert. Für die Herstellung von netztinalen Lochscheiben wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll gegeben. Weitere Informationen zum Programmaufbau und zur Datenanalyse finden Sie im Benutzerhandbuch des Herstellers24,25,26.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td>Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge needle</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bam15, 10 mM stock solution</td>
			<td>TimTec</td>
			<td>ST056388</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy puncher, 1 mm</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 asphyxiation chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Stright tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #7</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Curved, Serrated tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15004-08</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse calibration medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pyruvate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>pH 7.4, with 5 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103518-100</td>
			<td>Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate solution, 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine eyelash brush</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples

Die mitochondriale Atmung ist ein kritischer energieerzeugender Weg in allen Zellen, insbesondere in retinalen Photorezeptoren, die einen hochaktiven Stoffwechsel besitzen. Darüber hinaus weisen Photorezeptoren auch eine hohe aerobe Glykolyse wie Krebszellen auf. Präzise Messungen dieser Stoffwechselaktivitäten können wertvolle Einblicke in die zelluläre Homöostase unter physiologischen Bedingungen und in Krankheitszuständen liefern. Hochdurchsatz-Mikroplatten-basierte Assays wurden entwickelt, um die mitochondriale Atmung und verschiedene Stoffwechselaktivitäten in lebenden Zellen zu messen. Ein Großteil davon wird jedoch für kultivierte Zellen entwickelt und ist nicht für intakte Gewebeproben und für die Anwendung ex vivo optimiert. Hier wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll unter Verwendung der Mikroplatten-basierten Fluoreszenztechnologie beschrieben, um die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) als Indikator für die mitochondriale Atmung sowie die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) als Indikator für die Glykolyse in intaktem Ex-vivo-Netzhautgewebe direkt zu messen. Diese Methode wurde verwendet, um die Stoffwechselaktivitäten in der Netzhaut der erwachsenen Maus erfolgreich zu bewerten und ihre Anwendung bei der Untersuchung zellulärer Mechanismen des Alterns und der Krankheit zu demonstrieren.

Bei den hier berichteten Daten handelt es sich um repräsentative mitochondriale Stresstests, die OCR-Spuren (Abbildung 1) und Glykolytika-Rate-Assays mit OCR-Spuren und ECAR-Spuren (Abbildung 2) zeigen, die mit frisch separierten 1 mm Netzhautstanzscheiben von 4 Monate alten transgenen Nrl-L-EGFP-Mäusen36 (C57B/L6-Hintergrund) durchgeführt wurden. Diese Mäuse exprimieren GFP spezifisch in Stäbchen-Photorezeptoren, ohne die n...

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Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Hier beschrieben ist ein detailliertes Protokoll zur Durchführung eines mitochondrialen Stresstests und eines Glykolytika-Rate-Assays in ex vivo Netzhautgewebeproben unter Verwendung eines kommerziellen Bioanalytikers.

Bestimmung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse in Ex-vivo-Netzhautgewebeproben

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Echtzeitanalyse von zwei wichtigen bioenergetischen Signalwegen: mitochondriale Atmung und Glykolyse in frisch sezierten Ex-vivo-Netzhautgeweben von Mäusen. Die traditionelle Seepferdchenanalyse konzentrierte sich auf kultivierte monoschichtige Zellen, während dieses Protokoll es den Forschern ermöglicht, die mitochondriale Aktivität in frisch sezierten Geweben, insbesondere der Netzhaut, zu untersuchen. Diese Technik wird verwendet, um die Aktivitäten der Mitochondrien und Glykolyseflaggen in Netzhäuten von vererbten Netzhautdegenerations-Mausmodellen zu untersuchen.Es ist ein nützliches Werkzeug für die Netzhautforschung und hat auch das Potenzial, auf andere Gewebearten angewendet zu werden, um mögliche Therapien zu entwickeln. Der schwierigste Teil dieses Protokolls besteht darin, hochwertige Stanzscheiben von frisch sezierter Mausnetzhaut zu erhalten, daher wird empfohlen, dass die Person, die diese Technik durchführt, über gute Netzhautdissektionsfähigkeiten verfügt. Öffnen Sie am Tag vor dem Experiment die Sensorkassettenkassette und geben Sie einen Milliliter Kalibriermedium in jede Vertiefung der Versorgungsplatte.Über Nacht in einem kohlendioxidfreien Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die Fluorophore zu aktivieren. Bereiten Sie am Tag des Experiments das Assay-Medium in verdünnten zusammengesetzten Arzneimitteln vom Lager vor. Erwärmen Sie das Assay-Medium im 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.Richten Sie das Assay-Programm auf der Maschine ein, wie im Textmanuskript beschrieben. Öffnen Sie den Deckel der Kassette mit den Netzeinsätzen. Pipettieren Sie acht Mikroliter der Beschichtungsmischung auf jeden Netzeinsatz und verwenden Sie dann eine Pipettenspitze, um das Tröpfchen vorsichtig zu verteilen, um die Beschichtungsmischung gleichmäßig über den Netzeinsatz zu verteilen.Schließen Sie die Kassette und lassen Sie die Netzeinsätze mindestens 25 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, um sie zu absorbieren. Waschen Sie nach der Inkubation die Netzeinsätze, indem Sie vier Milliliter des Assay-Mediums direkt auf die Einsätze pipettieren. Schütteln Sie die Kassette vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle Netzeinsätze mit dem Assay-Medium gewaschen werden.Um den Netzhautstempel vorzubereiten, enukleieren Sie die Augen einer erwachsenen eingeschläferten Maus und legen Sie sie in eiskaltes PBS in eine Petrischale, dann legen Sie die Petrischale unter ein Seziermikroskop. Schneiden Sie mit Mikroscheren den Sehnerv ab und entfernen Sie dann vorsichtig die extrarektusfarbenen Muskeln, die außerhalb des Augapfels angebracht sind. Stanzen Sie mit einer 30-Gauge-Nadel ein Loch am Rand der Hornhaut.Verwenden Sie dann feine Dissektionsmikrosoren, um einen kreisförmigen Schnitt entlang des Hornhautrandes zu machen. Entfernen Sie mit einer scharfen Dissektionszange die Hornhaut, die Linse und den Glaskörper aus der Augenmuschel. Machen Sie mehrere kleine Schnitte auf der Skleralschicht am Rand der Augenmuschel mit feinen Dissektionsmikrosen.Verwenden Sie zwei scharfe Dissektionszangen, um das Sklerusgewebe auf jeder Seite festzuhalten, und ziehen Sie sehr vorsichtig an der Skleralschicht, um sie von der neuralen Netzhaut zu entfernen. Wiederholen Sie dies um die Augenmuschel, bis alle Sklera entfernt ist und eine intakte Netzhautschale erhalten wird. Machen Sie radiale Schnitte an der Netzhautschale, um sie abzuflachen, und erzeugen Sie mehrere verschiedene Abschnitte mit Dissektionsmikroschern.Als nächstes schneiden Sie mit einem Biopsie-Puncher mit einem Durchmesser von einem Millimeter eine Netzhautscheibe aus jedem Abschnitt des abgeflachten Netzhautbechers. Schlagen Sie in gleichem Abstand vom Sehnervenkopf. Die vorbeschichteten Netzeinsätze mit einer Pinzette in die Dissektions-Petrischale überführen.Legen Sie mit Hilfe von zwei superfeinen Wimpernbürsten die netzhautale Stanzscheibe in die Mitte des Netzeinsatzes, wobei die Ganglienzellschicht auf der Seite nach unten das Netz berührt und die Photorezeptorschicht nach oben zeigt. Um die Sensorkassette zu laden, nehmen Sie die Kassette mit hydratisierter Sensorkassette aus dem 37 Grad Celsius großen Inkubator. Nachdem Sie die Hydro-Booster-Abdeckung entfernt haben, legen Sie die Sensorpatrone wieder auf die Versorgungsplatte.Laden Sie das gewünschte Volumen an Injektionsmasselösungen in die entsprechenden Anschlüsse, indem Sie die Pipettenspitze in einem Winkel von 45 Grad halten und die Pipettenspitze auf halbem Weg in einen Injektionsanschluss mit der Fase der Spitze gegen die gegenüberliegende Wand des Injektionsanschlusses einführen. Laden Sie die Mischung vorsichtig in jeden Port. Legen Sie die Sensorkassette zur Kalibrierung in das Gerät ein, indem Sie auf die Schaltfläche Start ausführen klicken, um das Gerätefach zu öffnen.Legen Sie die Sensorkassette in das Gerät ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Ich bin bereit, um die Kalibrierung zu starten. Laden Sie das gewünschte Volumen des Assay-Mediums in jede Vertiefung der Inselauffangplatte. Greifen Sie mit einer Pinzette den Rand des Netzeinsatzes mit den netztinalen Stanzscheiben und nehmen Sie ihn aus der Petrischale heraus.Klopfen Sie leicht auf die Unterseite des Netzeinsatzes auf ein absorbierendes Wischtuch, um zusätzliche Flüssigkeit zu entfernen, und geben Sie sie in den Brunnen der Inselauffangplatte. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Netzeinsätze mit Netzhautstempeln in die Inselauffangplatte gelegt sind, die die Hintergrundkorrekturtöpfe und die leeren Vertiefungen mit leeren Netzeinsätzen füllt. Drücken Sie mit zwei Graefe-Pinzetten vorsichtig und vorsichtig auf den Rand jedes Netzeinsatzes und stellen Sie sicher, dass diese sicher an der Unterseite der Inselauffangplatte eingesetzt werden.Legen Sie die beladene Inselauffangplatte fünf Minuten lang in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um sich aufzuwärmen, und werfen Sie dann die Versorgungsplatte nach Abschluss der Kalibrierung aus. Ersetzen Sie es durch die Inselauffangplatte, die Netzhautstempel enthält, und setzen Sie den Assay-Lauf fort, indem Sie auf die Schaltfläche Wägezellenplatte klicken. Nachdem der Lauf abgeschlossen ist, werfen Sie die Sensorkassette und die Inselerfassungsplatte mit Netzhautstempeln aus, indem Sie auf die Auswurftaste klicken, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Fertig, damit die Daten automatisch als ASYR-Datei gespeichert werden und der Bildschirm automatisch zur Ergebnisanzeige wechselt.Der mitochondriale Stress-Assay, der einen OCR-Spuren- und Glykolytraten-Assay zeigt, der sowohl OCR- als auch ECAR-Spuren zeigt, wurde mit frisch sezierten retinalen Stanzscheiben von einem Millimeter durchgeführt. Im mitochondrialen Stresstest wurde Bam15 injiziert, um den Protonengradienten von der mitochondrialen ATP-Produktion zu entkoppeln, was zu einem Anstieg der OCR auf ein maximales Niveau führte. Rotenon und Antimycin A wurden injiziert, um die Atmung der Mitochondrien am ersten bzw. dritten Komplex zu hemmen, was zu einem Abfall der OCR auf das minimale Niveau führte.Die Differenz zwischen dem maximalen OCR-Spiegel und der letzten Messung des basalen OCR-Spiegels spiegelt die mitochondriale Reservekapazität wider. Im glykolytischen Ratentest schaltet die Injektion von Rotenon und Antimycin A die mitochondriale Atmung ab und treibt die Glykolyse nach oben. Die Glykolyse wird durch Injektion von 2-Desoxy-d-Glucose ergriffen, die mit Glucose um die Hexokinase-Bindung konkurriert, wodurch das ECAR auf das minimale Niveau sinkt.Die Differenz zwischen dem maximalen Glyko-ECAR-Gehalt im letzten Maß des Glyko-ECAR-Basalspiegels spiegelt die Glykolysereservekapazität wider. Um zuverlässige Daten zu erhalten, ist es wichtig, eine gute Qualität der netztinalen Stanzscheiben zu erhalten und die Gesamteinsektionszeit innerhalb von 1,5 Stunden zu begrenzen. Nach dem Experiment kann man die DNA des Proteingehalts einer Netzhautscheibe in einem Brunnen quantifizieren und daraus die Seepferdchendaten normalisieren.Also wurde dieses Protokoll verwendet, um Entwicklung, Alterung und Krankheit in der Netzhaut zu untersuchen. Die Gewebepräferenz oder -abhängigkeit von verschiedenen Brennstoffsubstraten wie Glukose oder Fettsäuren wurde ebenfalls analysiert.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Quantitative autoradiografische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...