Name: determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples
Uploaded: 2021-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר התוך-ארצית של מכון העיניים הלאומי (ZIAEY000450 ו- ZIAEY000546).

כל פרוטוקולי העכבר אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכון העיניים הלאומי (NEI ASP# 650). עכברים שוכנו בתנאים כהים של 12 שעות ויטופלו על ידי ביצוע המלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, המכון למשאבי בעלי חיים במעבדה ומדיניות שירות הבריאות הציבורי לטיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה.
<...

<ol>
	<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+In+sickness+and+in+health.">Mitochondria: In sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye Brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Yu, D. Y., Cringle, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+distribution+and+consumption+within+the+retina+in+vascularised+and+avascular+retinas+and+in+animal+models+of+retinal+disease.">Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease.</a> Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).</li><li>Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+retinal+diseases.">Mitochondrial dysfunction in retinal diseases.</a> Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).</li><li>Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+energy+demands+control+vascular+supply+of+the+retina+in+development+and+disease:+The+role+of+neuronal+lipid+and+glucose+metabolism.">Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism.</a> Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).</li><li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+lactate,+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas.">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li><li>Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+to+see-Drivers+of+aerobic+glycolysis+in+the+mammalian+retina:+A+review.">Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).</li><li>Wright, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+and+mitochondrial+control+of+neurodegeneration.">Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration.</a> Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).</li><li>Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+to+neurodegeneration.">Molecular pathways to neurodegeneration.</a> Nature Medicine. 10, 2-9 (2004).</li><li>Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+retinal+metabolic+dysfunction+at+the+center+of+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).</li><li>Vlachantoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+severe+mitochondrial+oxidative+stress+and+a+protective+effect+of+low+oxygen+in+mouse+models+of+inherited+photoreceptor+degeneration.">Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).</li><li>Grenell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MPC1+reprograms+retinal+metabolism+to+impair+visual+function.">Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li><li>Jarrett, S. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+oxidative+stress+in+age-related+macular+degeneration.">Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).</li><li>Rozing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+A+two-level+model+hypothesis.">Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis.</a> Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).</li><li>Yokosako, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolysis+in+patients+with+age-related+macular+degeneration.">Glycolysis in patients with age-related macular degeneration.</a> Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).</li><li>Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+diabetic+retinopathy.">Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy.</a> Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).</li><li>Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+dysregulation+and+neurovascular+dysfunction+in+diabetic+retinopathy.">Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy.</a> Antioxidants. 9 (12), (2020).</li><li>Futterman, S., Kinoshita, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+retina.+I.+Respiration+of+cattle+retina.">Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).</li><li>Linsenmeier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+and+darkness+on+oxygen+distribution+and+consumption+in+the+cat+retina.">Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina.</a> Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).</li><li>Medrano, C. J., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+in+the+rat+outer+and+inner+retina:+light-+and+pharmacologically-induced+inhibition.">Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition.</a> Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).</li><li>Kooragayala, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen+consumption+in+retina+ex+vivo+demonstrates+limited+reserve+capacity+of+photoreceptor+mitochondria.">Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Adlakha, Y. K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+the+retina+ex+vivo:+applications+for+retinal+disease.">Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).</li><li>. Agilent Mitocondrial stress test user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Glycolytic rate assay user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent wave 2.6 user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf">https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf</a> (2021)</li><li>. Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>Fan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioassay+to+measure+energy+metabolism+in+mouse+colonic+crypts,+organoids,+and+sorted+stem+cells.">A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li><li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors.">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).</li><li>Corso-Diaz, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+identifies+DNA+methylation+signatures+of+aging+in+rod+photoreceptors+associated+with+alterations+in+energy+metabolism.">Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism.</a> Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).</li><li>Berkowitz, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+outer+retina+contributes+to+light-evoked+increase+in+hydration+in+vivo.">Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li></ol>

כאן מפורטות הוראות לביצוע בדיקות מבוססות מיקרו-פלט של נשימה מיטוכונדריאלית ופעילות גליקוליזה באמצעות דיסקים של ניקוב רשתית ex vivo, שניתחו זה עתה. הפרוטוקול עבר אופטימיזציה ל: 1) להבטיח שימוש במדיום בדיקת אסאי מתאים לרקמת רשתית ex vivo ; 2) להעסיק בגודל הנכון של דיסקים ניקוב רשתית כדי לק...

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים המווסתים את חילוף החומרים התאי, איתות, הומאוסטזיס, אפופטוזיס על ידי תיאום תהליכים פיזיולוגיים חיוניים מרובים1. המיטוכונדריה משמשת תחנת הכוח בתא ליצירת אדנוסין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחן חמצוני (OXPHOS) ולספק אנרגיה התומכת כמעט בכל האירועים התאיים. רוב החמצן התאי מטבוליזם במיטוכונדריה, שם הוא משמש כקבל האלקטרונים הסופי בשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC) במהלך נשימה אירובית. כמויות נמוכות של ATP ניתן גם לייצר גליקוליזה בציטוסול, שבו גלוקוז מומר pyruvate, אשר ניתן להמיר עוד יותר לקטט או להיות מועבר לתוך מיטוכונדריה מחומצן אצטיל-CoA, מצע במחזור חומצה tricarboxylic (מחזור TCA).
הרשתית היא אחת הרקמות הפעילות ביותר מבחינה מטבולית ביונקים2, המציגה רמות גבוהות של נשימה מיטוכונדריאלית וצריכת חמצן גבוהה מאוד3. מוט ו photoreceptors חרוט מכילים צפיפות גבוהה של מיטוכונדריה4, ו OXPHOS מייצר את רוב ATP ברשית5. בנוסף, הרשתית מסתמכת גם בכבדות על גליקוליזה אירובית6,7 על ידי המרת גלוקוז לקטט5. פגמים מיטוכונדריאליים קשורים למחלות ניווניות שונות8,9; ועם דרישות האנרגיה הגבוהה הייחודיות שלה, הרשתית פגיעה במיוחד לפגמים מטבוליים, כולל אלה המשפיעים על OXPHOS4 מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס10. תפקוד לקוי מיטוכונדריאלי ופגמים בגליקוליזיס מעורבים במחלות ניווניות ברשתית11,12 ו- macular13, ניוון מקולרי הקשור לגיל10,14,15,16, ורטינופתיה סוכרתית17,18. לכן, מדידות מדויקות של נשימה מיטוכונדריאלית וטליקוליזה יכולות לספק פרמטרים חשובים להערכת שלמות ובריאות הרשתית.
ניתן למדוד נשימה מיטוכונדריאלית באמצעות קביעת שיעור צריכת החמצן (OCR). בהתחשב בכך ההמרה של גלוקוז pyruvate ולאחר מכן לקטט תוצאות שחול של פרוטונים לתוך חמצה של הסביבה החוץ תאית, מדידות של שיעור החמצה חוץ תאית (ECAR) לספק אינדיקציה של שטף גליקוליזה. כמו הרשתית מורכבת מסוגי תאים מרובים עם יחסים אינטימיים וסינרגיה פעילה, כולל חילופי מצעים6, זה הכרחי לנתח את התפקוד המיטוכונדריאלי ואת חילוף החומרים בהקשר של רקמת הרשתית כולה עם למינציה ומעגלים שלמים. במשך העשורים האחרונים, אלקטרודות O2 מסוג קלארק ומיקרו-ectectrodes חמצן אחרים שימשו למדידת צריכת חמצן ברשתית19,20,21. אלקטרודות חמצן אלה יש מגבלות עיקריות ברגישות, דרישה של נפח מדגם גדול, ואת הצורך ערבוב מתמשך של דגימת השעיה, אשר בדרך כלל מוביל להפרעה של הקשר הסלולר והרקמות. הפרוטוקול המתואר כאן פותח באמצעות טכניקה מבוססת מיקרו-פלאט, פלואורסצנטיות למדידת חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית ברקמת רשתית עכבר ex vivo ניתחה זה עתה. זה מאפשר מדידות בזמן אמת באמצע תפוקה של OCR ו- ECAR בו זמנית באמצעות מדגם קטן (פונץ '1 מ"מ) של רקמת רשתית ex vivo תוך הימנעות הצורך השעיה ערבוב מתמשך.
הוכח כאן הוא ההליך הניסיוני לבדיקת מתח מיטוכונדריאלי ובוחן קצב גליקוליטי על דיסקי ניקוב רשתית שזה עתה נותחו. פרוטוקול זה מאפשר מדידה של פעילויות מטבוליות הקשורות במיטוכונדריה בהקשר של רקמת ex vivo. בשונה מבוחות שבוצעו באמצעות תאים מתורבתים, הקריאות המתקבלות כאן משקפות את חילוף החומרים של האנרגיה המשולבת ברמת הרקמה ומושפעות מאינטראקציות בין סוגי התאים השונים בתוך הרקמה. הפרוטוקול משתנה מגרסה שפורסמה בעבר22,23 כדי להסתגל לדור החדש של מנתח השטף החוץ-תאי Agilent Seahorse 24-בארות (XFe24) עם צלחת לכידת אי. בינוני אסאי, ריכוזי תרכובת הזרקה, ומספר/משך של מחזורי בדיקת אופטימיזציה גם עבור רקמת הרשתית. פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב ניתן להכנת דיסקים ניקוב רשתית. מידע נוסף על הגדרת התוכנית וניתוח נתונים ניתן לקבל ממדריך המשתמש של היצרן24,25,26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td>Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge needle</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bam15, 10 mM stock solution</td>
			<td>TimTec</td>
			<td>ST056388</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy puncher, 1 mm</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 asphyxiation chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Stright tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #7</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Curved, Serrated tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15004-08</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse calibration medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pyruvate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>pH 7.4, with 5 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103518-100</td>
			<td>Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate solution, 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine eyelash brush</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples

נשימה מיטוכונדריאלית היא מסלול קריטי לייצור אנרגיה בכל התאים, במיוחד קולטני אור ברשתית בעלי חילוף חומרים פעיל מאוד. בנוסף, קולטני אור מציגים גם גליקוליזה אירובית גבוהה כמו תאים סרטניים. מדידות מדויקות של פעילויות מטבוליות אלה יכולות לספק תובנות חשובות על הומאוסטזיס תאי בתנאים פיזיולוגיים ובמדינות מחלה. בדיקות מבוססות מיקרו-לוחית בעלות תפוקה גבוהה פותחו כדי למדוד נשימה מיטוכונדריאלית ופעילויות מטבוליות שונות בתאים חיים. עם זאת, רובם המכריע של אלה מפותחים עבור תאים מתורבתים ולא עברו אופטימיזציה עבור דגימות רקמה שלמה עבור יישום ex vivo. מתואר כאן פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב, באמצעות טכנולוגיית פלואורסצנטיות מבוססת מיקרופלסטיט, כדי למדוד ישירות את קצב צריכת החמצן (OCR) כאינדיקטור לנשימה מיטוכונדריאלית, כמו גם שיעור החמצה חוץ תאית (ECAR) כאינדיקטור לגליקוליזיס, ברקמת רשתית ex vivo שלמה. שיטה זו שימשה כדי להעריך בהצלחה פעילויות מטבוליות רשתית עכבר למבוגרים ולהדגים את היישום שלה בחקירת מנגנונים תאיים של הזדקנות ומחלות.

הנתונים המדווחים כאן הם בדיקת לחץ מיטוכונדריאלית מייצגת המציגה עקבות זיהוי התווים האופטי (איור 1) ובוחן קצב גליקוליטי המציג עקבות זיהוי OCR ועקבות ECAR (איור 2), שבוצעו באמצעות דיסקים של ניקוב רשתית 1 מ"מ טריים מעכברי Nrl-L-EGFP מהונדסים בני 4 חודשים (רק...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples at JoVE.com

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

מתואר כאן פרוטוקול מפורט לביצוע בדיקת מתח מיטוכונדריאלית ובוחן קצב גליקוליטי בדגימות רקמת רשתית ex vivo באמצעות ביואנלייזר מסחרי.

קביעת נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזיס בדגימות רקמת רשתית Ex Vivo

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

פרוטוקול זה מספק ניתוח בזמן אמת של שני מסלולים ביו-אנרגטיים עיקריים: נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזה ברקמות רשתית עכבר ex vivo ניתחו זה עתה. ניתוח סוסוני הים המסורתי התמקד בתאים חד-שכבתיים מתורבתים, בעוד פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור פעילות מיטוכונדריאלית ברקמות שזה עתה נותחו, במיוחד ברשתית. טכניקה זו משמשת לחקר הפעילויות של המיטוכונדריה ודגלי הגליקוליזיס ברשתיות של דגמי עכבר ניוון רשתית תורשתית.זהו כלי שימושי לחקר הרשתית ויש לו גם פוטנציאל להיות מיושם על סוג אחר של רקמה לפתח טיפולים פוטנציאליים. החלק הקשה ביותר בפרוטוקול זה הוא להשיג דיסקי ניקוב איכותיים רשתית עכבר ניתחו זה עתה, ולכן מומלץ כי לאדם שיבצע טכניקה זו יש כישורים טובים לנתח רשתית. יום לפני הניסוי, פתח את קלטת מחסנית החיישן והוסף מיליליטר אחד של מדיום כיול לכל באר של צלחת השירות.דגירה לילה באינקובטור ללא פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפעיל את הפלורופורים. ביום הניסוי, להכין בינוני אסאי בתרופות מורכבות לדלל מהמלאי. לחמם את בינוני אסאי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.הגדר את תוכנית ההסמכה על המכונה כמתואר בכתב היד של הטקסט. פתח את המכסה של הקלטת המכילה תוספות רשת. Pipette שמונה מיקרוליטרים של תערובת הציפוי לכל תוספת רשת, ולאחר מכן להשתמש קצה פיפטה כדי להפיץ בעדינות את הטיפה סביב כדי להפיץ את תערובת הציפוי באופן שווה לאורך כל תוספת הרשת.סוגרים את הקלטת ומאפשרים לתוספות הרשת לדגור בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות לפחות לספיגה. לאחר הדגירה, לשטוף את תוספות רשת על ידי pipetting ארבעה מיליליטר של בינוני assay ישירות על תוספות. יש לנער בעדינות את הקלטת כדי להבטיח שכל התוספות של הרשת נשטפות עם מדיום ה-assay.כדי להכין את אגרוף הרשתית, להסית את העיניים מעכבר מורדם מבוגר ולהניח אותם לתוך PBS קר כקרח בצלחת פטרי, ולאחר מכן למקם את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ ניתוח. באמצעות מיקרו-סיקורס, חותכים את עצב הראייה, ואז מסירים בזהירות את שרירי ההזרמה המחוברים מחוץ לגלגל העין. באמצעות מחט 30 מד, ניקוב חור בקצה הקרנית.לאחר מכן השתמש microscissors ביתור עדין כדי להפוך חתך מעגלי לאורך קצה הקרנית. בעזרת מלקחיים חדים, הסירו את הקרנית, העדשה ואת ההומור הזגג מכוס העין. לעשות כמה חתכים קטנים על השכבה scleral בקצה של העין באמצעות microscissors ניתוח עדין.השתמש בשני מלקחיים חדים כדי להחזיק את הרקמה הסקלרלית בכל צד ולמשוך את השכבה הסקלרלית בזהירות רבה כדי להסיר אותו מהרשתית העצבית. חזור על זה סביב העין עד שכל sclera מוסר רשתית שלמה מתקבלת. לעשות חתכים רדיאליים על הרשתית כדי לשטח אותו וליצור כמה חלקים נפרדים באמצעות microscissors ניתוח.לאחר מכן, באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר מילימטר אחד, לחתוך דיסק רשתית אחד מכל קטע של הרשתית שטוחה. אגרוף במרחק שווה מראש עצב הראייה. מעבירים את התוספות של רשת מצופה מראש לצלחת הפטרי המנוצלת באמצעות מלקחיים.בעזרת שתי מברשות ריסים עדינות במיוחד, הניחו את דיסק ניקוב הרשתית במרכז הכנס הרשת כשצד שכבת תא הגנגליון כלפי מטה נוגע ברשת ובשכבת הפוטורה-קולטור הפונה כלפי מעלה. כדי לטעון את מחסנית החיישן, הוציא את קלטת מחסנית החיישן הלחות מתוך החממה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת כיסוי המאיץ הידרו, למקם את מחסנית החיישן בחזרה על צלחת השירות.טען את הנפח הרצוי של פתרונות הזרקה מורכבים ליציאות מתאימות על ידי החזקת קצה הפיפטה בזווית של 45 מעלות, החדרת קצה הפיפטה באמצע הדרך ליציאת הזרקה עם שיפוע הקצה כנגד הקיר הנגדי של יציאת ההזרקה. טענו בעדינות את התרכובת לכל יציאה. טען את מחסנית החיישן למחשב לכיול על-ידי לחיצה על לחצן התחל הפעלה כדי לפתוח את מגש המחשב.מקם את מחסנית החיישן במכונה ולחץ על לחצן אני מוכן להתחיל בכיול. טען את הנפח הרצוי של מדיום ה- assay לכל באר של צלחת לכידת האי. בעזרת מלקחיים, תפוס את שפת הכנס הרשת המכיל דיסקים של פונץ' רשתית והוציא אותה מצלחת הפטרי.הקש קלות על החלק התחתון של רשת להוסיף על רקמת לנגב סופג כדי להסיר נוזל נוסף ולשים אותו לתוך הבאר של צלחת לכידת האי. חזור על שלב זה עד שכל התוספות של רשת עם אגרופים ברשתית ממוקמות בצלחת לכידת האי הממלאת את בארות תיקון הרקע ובארות ריקות עם תוספות רשת ריקות. באמצעות שני מלקחיים של גראף, לחץ על שפת כל רשת מוכנסת בזהירות ובעדינות, וודא שהן מוכנסות בבטחה בתחתית צלחת לכידת האי.מניחים את צלחת לכידת האי הטעון לתוך חממת צלזיוס 37 מעלות במשך חמש דקות כדי להתחמם, ולאחר מכן להוציא את צלחת השירות לאחר הכיול הושלם. החלף אותו בצלחת לכידת האי המכילה אגרופים ברשתית וחדש את ההפעלה של ה- assay על ידי לחיצה על לחצן צלחת תא העומס. לאחר השלמת ההפעלה, הופלט את מחסנית החיישן ואת צלחת לכידת האי המכילה אגרופים ברשתית על-ידי לחיצה על לחצן הופלט ולאחר מכן לחץ על לחצן סיום כך שהנתונים יישמרו באופן אוטומטי כקובץ ASYR והמסך ישתנו באופן אוטומטי כדי לקבל את תצוגת התוצאות.בדיקות הלחץ המיטוכונדריאליות המציגות עקבות זיהוי התווים האופטי (OCR) ובוחן קצב הגליקוליטי המציג גם מעקב OCR וגם מעקב ECAR בוצעו באמצעות דיסקים של ניקוב רשתית מילימטר אחד. ב בדיקת הלחץ המיטוכונדריאלי, Bam15 הוזרק כדי לשחרר שיפוע פרוטונים מייצור ATP מיטוכונדריאלי, וכתוצאה מכך את העלייה של OCR לרמה מקסימלית. רוטנון ואנטי-מיצין A הוזרקו כדי לעכב את הנשימה המיטוכונדריה במתחם אחד ומורכב שלוש בהתאמה, וכתוצאה מכך ירידה ב- OCR לרמה המינימלית.ההבדל בין הרמה המקסימלית של זיהוי OCR לבין המדידה האחרונה של רמת זיהוי האופטי האופטי (OCR) המבססת משקף את יכולת העתודה המיטוכונדריאלית. בהתבוננות בקצב הגליקוליטי, הזרקת רוטנון ואנטי-מיצין A משביתה את הנשימה המיטוכונדריאלית ומעלה. גליקוליזה נתפסת על ידי הזרקת 2-deoxy-d-גלוקוז, אשר מתחרה גלוקוז עבור עקדת hexokinase, גורם ECAR לרדת לרמה המינימלית.ההבדל בין הרמה המקסימלית של Glyco ECAR במידה האחרונה של רמת הבזל של Glyco ECAR משקף את קיבולת עתודת הגליקוליזיס. כדי להפיק נתונים אמינים, חשוב להשיג איכות טובה של דיסקי ניקוב רשתית ולהגביל את זמן הניתוח הכולל תוך שעה וחצי. לאחר הניסוי, ניתן לכמת את הדנ"א של תכולת החלבון של דיסק רשתית בבאר ולהשתמש בו כדי לנרמל את נתוני סוסון הים.אז פרוטוקול זה נוצל כדי ללמוד פיתוח, הזדקנות, ומחלות ברשתית. העדפת רקמות או הסתמכות על מצעים שונים דלק כגון גלוקוז או חומצות שומן נותח גם.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

קביעת מיטוכונדריאלי המינים ממברנה פוטנציאליים הריאקטיבי חמצן בנוירונים חולדה חיה קליפתיים

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

הכנת פרוסות דג זברה למבוגרים עבור לשעבר Vivo הדמיה ניסויים ברשתית טריים

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

השיטה הכמותית האוטומטית לקביעת שיעורי הסינתזה של חלבון מוחי בVivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...