Name: determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples
Uploaded: 2021-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples at JoVE.com

Este trabajo es apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional del Ojo (ZIAEY000450 y ZIAEY000546).

Todos los protocolos de ratón fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional del Ojo (NEI ASP # 650). Los ratones fueron alojados en condiciones de luz-oscuridad de 12 h y cuidados siguiendo las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio y la Política del Servicio de Salud Pública sobre Cuidado Humanitario y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Cartucho del sensor hidratante ...

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	<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+In+sickness+and+in+health.">Mitochondria: In sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye Brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Yu, D. Y., Cringle, S. 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S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li><li>Jarrett, S. G., Boulton, M. 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Agilent wave 2.6 user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf">https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf</a> (2021)</li><li>. Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>Fan, Y. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).</li><li>Corso-Diaz, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+identifies+DNA+methylation+signatures+of+aging+in+rod+photoreceptors+associated+with+alterations+in+energy+metabolism.">Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism.</a> Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).</li><li>Berkowitz, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+outer+retina+contributes+to+light-evoked+increase+in+hydration+in+vivo.">Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li></ol>

Aquí se proporcionan instrucciones detalladas para realizar ensayos basados en microplacas de la respiración mitocondrial y la actividad de la glucólisis utilizando discos perforadores de retina recién diseccionados ex vivo. El protocolo se ha optimizado para: 1) garantizar el uso de un medio de ensayo adecuado para el tejido retiniano ex vivo; 2) emplear el tamaño adecuado de los discos perforadores de retina para obtener lecturas de OCR y ECAR que se encuentren dentro del rango de detección ópt...

Las mitocondrias son orgánulos esenciales que regulan el metabolismo celular, la señalización, la homeostasis y la apoptosis mediante la coordinación de múltiples procesos fisiológicos cruciales1. Las mitocondrias sirven como la fuente de energía en la célula para generar trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) y proporcionar energía que soporta casi todos los eventos celulares. La mayoría del oxígeno celular se metaboliza en las mitocondrias, donde sirve como el aceptor final de electrones en la cadena de transporte de electrones (ETC) durante la respiración aeróbica. También se pueden producir bajas cantidades de ATP a partir de la glucólisis en el citosol, donde la glucosa se convierte en piruvato, que puede convertirse en lactato o transportarse a las mitocondrias y oxidarse a acetil-CoA, un sustrato en el ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo TCA).
La retina es uno de los tejidos metabólicamente más activos en mamíferos2, mostrando altos niveles de respiración mitocondrial y un consumo de oxígeno extremadamente alto3. Los fotorreceptores de bastón y cono contienen una alta densidad de mitocondrias4, y OXPHOS genera la mayor cantidad de ATP en la retina5. Además, la retina también depende en gran medida de la glucólisis aeróbica6,7 al convertir la glucosa en lactato5. Los defectos mitocondriales se asocian a diversas enfermedades neurodegenerativas8,9; y con sus altas demandas energéticas únicas, la retina es especialmente vulnerable a los defectos metabólicos, incluidos los que afectan a OXPHOS4 mitocondrial y la glucólisis10. La disfunción mitocondrial y los defectos de la glucólisis están implicados en enfermedades degenerativas de retinal11,12 y macular13, degeneración macular asociada a la edad10,14,15,16 y retinopatía diabética17,18. Por lo tanto, las mediciones precisas de la respiración mitocondrial y la glucólisis pueden proporcionar parámetros importantes para evaluar la integridad y la salud de la retina.
La respiración mitocondrial se puede medir a través de la determinación de la tasa de consumo de oxígeno (OCR). Dado que la conversión de glucosa en piruvato y posteriormente en lactato da como resultado la extrusión de protones y la acidificación del entorno extracelular, las mediciones de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) proporcionan una indicación del flujo de glucólisis. Como la retina está compuesta por múltiples tipos de células con relaciones íntimas y sinergia activa, incluido el intercambio de sustratos6, es imperativo analizar la función mitocondrial y el metabolismo en el contexto de todo el tejido retiniano con laminación y circuitos intactos. Durante las últimas décadas, los electrodos de O2 tipo Clark y otros microelectrodos de oxígeno se han utilizado para medir el consumo de oxígeno en la retina19,20,21. Estos electrodos de oxígeno tienen limitaciones importantes en la sensibilidad, el requisito de un gran volumen de muestra y la necesidad de agitación continua de la muestra en suspensión, lo que generalmente conduce a la interrupción del contexto celular y tisular. El protocolo descrito aquí se desarrolló utilizando una técnica de fluorescencia basada en microplacas para medir el metabolismo energético mitocondrial en tejido de retina de ratón ex vivo recién diseccionado. Permite mediciones en tiempo real de rendimiento medio de OCR y ECAR simultáneamente utilizando una pequeña muestra (punzón de 1 mm) de tejido retiniano ex vivo, evitando la necesidad de suspensión y agitación continua.
Aquí se demuestra el procedimiento experimental para el ensayo de estrés mitocondrial y el ensayo de tasa glucolítica en discos de punción retiniana recién diseccionados. Este protocolo permite la medición de las actividades metabólicas relacionadas con las mitocondrias en un contexto tisular ex vivo. A diferencia de los ensayos realizados con células cultivadas, las lecturas obtenidas aquí reflejan el metabolismo energético combinado a nivel tisular y están influenciadas por las interacciones entre los diferentes tipos de células dentro del tejido. El protocolo se modifica a partir de una versión publicada anteriormente22,23 para adaptarse a la nueva generación del analizador de flujo extracelular Agilent Seahorse de 24 pocillos (XFe24) con placa de captura de islotes. El medio de ensayo, las concentraciones de compuestos de inyección y el número/duración de los ciclos de ensayo también se han optimizado para el tejido retiniano. Se proporciona un protocolo detallado paso a paso para la preparación de discos perforados de retina. Se puede obtener más información sobre la configuración del programa y el análisis de datos en la guía del usuario del fabricante24,25,26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td>Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge needle</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bam15, 10 mM stock solution</td>
			<td>TimTec</td>
			<td>ST056388</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy puncher, 1 mm</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 asphyxiation chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Stright tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #7</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Curved, Serrated tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15004-08</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse calibration medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pyruvate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>pH 7.4, with 5 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103518-100</td>
			<td>Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate solution, 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine eyelash brush</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples

La respiración mitocondrial es una vía crítica de generación de energía en todas las células, especialmente en los fotorreceptores de la retina que poseen un metabolismo altamente activo. Además, los fotorreceptores también exhiben una alta glucólisis aeróbica como las células cancerosas. Las mediciones precisas de estas actividades metabólicas pueden proporcionar información valiosa sobre la homeostasis celular en condiciones fisiológicas y en estados de enfermedad. Se han desarrollado ensayos basados en microplacas de alto rendimiento para medir la respiración mitocondrial y diversas actividades metabólicas en células vivas. Sin embargo, una gran mayoría de estos están desarrollados para células cultivadas y no han sido optimizados para muestras de tejido intacto y para su aplicación ex vivo. Aquí se describe un protocolo detallado paso a paso, utilizando tecnología de fluorescencia basada en microplacas, para medir directamente la tasa de consumo de oxígeno (OCR) como indicador de la respiración mitocondrial, así como la tasa de acidificación extracelular (ECAR) como indicador de glucólisis, en tejido retiniano ex vivo intacto. Este método se ha utilizado para evaluar con éxito las actividades metabólicas en la retina del ratón adulto y demostrar su aplicación en la investigación de los mecanismos celulares del envejecimiento y la enfermedad.

Los datos reportados aquí son ensayos representativos de estrés mitocondrial que muestran trazas de OCR (Figura 1) y ensayos de tasa glucolítica que muestran trazas de OCR y trazas de ECAR (Figura 2), que se realizaron utilizando discos perforados de retina de 1 mm recién diseccionados de ratones transgénicos Nrl-L-EGFP de 4 meses de edad36 (fondo C57B / L6). Estos ratones expresan GFP específicamente en fotorreceptores de ...

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Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Aquí se describe un protocolo detallado para realizar el ensayo de estrés mitocondrial y el ensayo de velocidad glucolítica en muestras de tejido retiniano ex vivo utilizando un bioanalizador comercial.

Determinación de la respiración mitocondrial y la glucólisis en muestras de tejido retiniano ex vivo

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Este protocolo proporciona un análisis en tiempo real de dos vías bioenergéticas principales: respiración mitocondrial y glucólisis en tejidos retinianos de ratón ex vivo recién diseccionados. El análisis tradicional de caballitos de mar se centró en células monocapas cultivadas, mientras que este protocolo permite a los investigadores estudiar la actividad mitocondrial en tejidos recién diseccionados, específicamente la retina. Esta técnica se utiliza para estudiar las actividades de las mitocondrias y las banderas de glucólisis en retinas de modelos de ratón con degeneración retiniana hereditaria.Es una herramienta útil para la investigación de la retina y también tiene potencial para ser aplicado a otro tipo de tejido para desarrollar posibles terapias. La parte más difícil de este protocolo es obtener discos perforados de calidad de la retina de ratón recién diseccionada, por lo que se recomienda que la persona que realizará esta técnica tenga buenas habilidades de disección de la retina. El día antes del experimento, abra el cassette del cartucho del sensor y agregue un mililitro de medio de calibración a cada pozo de la placa de utilidad.Incubar durante la noche en una incubadora libre de dióxido de carbono a 37 grados centígrados para activar los fluoróforos. El día del experimento, prepare el medio de ensayo en medicamentos compuestos diluidos de stock. Calentar el medio de ensayo en el baño de agua de 37 grados centígrados.Configure el programa de ensayo en la máquina como se describe en el manuscrito de texto. Abra la tapa del cassette que contiene las inserciones de malla. Pipetee ocho microlitros de la mezcla de recubrimiento a cada inserto de malla, luego use una punta de pipeta para extender suavemente la gota y distribuir la mezcla de recubrimiento por igual en todo el inserto de malla.Cierre el cassette y deje que los insertos de malla se incuben a temperatura ambiente durante al menos 25 minutos para su absorción. Después de la incubación, lave los insertos de malla pipeteando cuatro mililitros del medio de ensayo directamente sobre los insertos. Agite suavemente el cassette para asegurarse de que todos los insertos de malla se laven con el medio de ensayo.Para preparar el golpe de retina, enucle los ojos de un ratón adulto sacrificado y colóquelos en PBS helado en una placa de Petri, luego coloque la placa de Petri bajo un microscopio de disección. Usando microscisores, corte el nervio óptico, luego retire cuidadosamente los músculos extrarrectos unidos fuera del globo ocular. Con una aguja de calibre 30, perfore un orificio en el borde de la córnea.Luego use microescisoras de disección fina para hacer un corte circular a lo largo del borde de la córnea. Usando pinzas de disección afiladas, retire la córnea, el cristalino y el humor vítreo de la copa del ojo. Haga varios cortes pequeños en la capa escleral en el borde de la copa del ojo usando microescisores de disección fina.Use dos fórceps de disección afilados para sujetar el tejido escleral a cada lado y tire de la capa escleral con mucho cuidado para extraerla de la retina neural. Repita esto alrededor de la copa del ojo hasta que se extirpe toda la esclerótica y se obtenga una copa de retina intacta. Haga cortes radiales en la copa de la retina para aplanarla y generar varias secciones distintas utilizando microescisores de disección.A continuación, con un punzón de biopsia de un milímetro de diámetro, corte un disco de retina de cada sección de la copa retiniana aplanada. Golpee a una distancia igual de la cabeza del nervio óptico. Transfiera los insertos de malla pre-recubiertos en la placa de Petri de disección usando fórceps.Con la ayuda de dos cepillos de pestañas súper finos, coloque el disco perforador de retina en el centro del inserto de malla con la capa de células ganglionares hacia abajo tocando la malla y la capa fotorreceptora hacia arriba. Para cargar el cartucho del sensor, saque el cassette de la placa del cartucho del sensor hidratado de la incubadora de 37 grados Centígrados. Después de quitar la cubierta del hidrorefuerzo, vuelva a colocar el cartucho del sensor en la placa de servicio.Cargue el volumen deseado de soluciones compuestas de inyección en los puertos apropiados sosteniendo la punta de la pipeta en un ángulo de 45 grados, insertando la punta de la pipeta a mitad de camino en un puerto de inyección con el bisel de la punta contra la pared opuesta del puerto de inyección. Cargue suavemente el compuesto en cada puerto. Cargue el cartucho del sensor en la máquina para su calibración haciendo clic en el botón Iniciar ejecución para abrir la bandeja de la máquina.Coloque el cartucho del sensor en la máquina y haga clic en el botón Estoy listo para iniciar la calibración. Cargue el volumen deseado del medio de ensayo en cada pozo de la placa de captura del islote. Usando fórceps, agarre el borde del inserto de malla que contiene discos perforantes de retina y sáquelo de la placa de Petri.Golpee ligeramente la parte inferior del inserto de malla en un pañuelo absorbente para eliminar el líquido adicional y colóquelo en el pozo de la placa de captura del islote. Repita este paso hasta que todos los insertos de malla con punzones de retina se coloquen en la placa de captura del islote llenando los pozos de corrección de fondo y los pozos en blanco con insertos de malla vacíos. Usando dos pinzas Graefe, presione el borde de cada inserto de malla con cuidado y suavidad, asegurándose de que estén insertadas de manera segura en la parte inferior de la placa de captura del islote.Coloque la placa de captura del islote cargada en una incubadora de 37 grados Celsius durante cinco minutos para calentarse, luego expulse la placa de utilidad después de que se complete la calibración. Reemplácelo con la placa de captura del islote que contiene punzones de retina y reanude la ejecución del ensayo haciendo clic en el botón de la placa de la celda de carga. Una vez completada la ejecución, expulse el cartucho del sensor y la placa de captura del islote que contiene punzones de retina haciendo clic en el botón de expulsión, luego haga clic en el botón Listo para que los datos se guarden automáticamente como un archivo ASYR y la pantalla cambie automáticamente para mostrar el resultado.El ensayo de estrés mitocondrial que muestra un rastro de OCR y un ensayo de tasa glucolítica que muestra tanto el rastro de OCR como el de ECAR se realizaron utilizando discos perforados de retina de un milímetro recién diseccionados. En el ensayo de estrés mitocondrial, bam15 se inyectó para desacoplar el gradiente de protones de la producción de ATP mitocondrial, lo que resultó en el aumento de OCR al nivel máximo. Se inyectaron rotenona y antimicina A para inhibir la respiración mitocondrial en el complejo uno y el complejo tres respectivamente, lo que resultó en una caída en el OCR al nivel mínimo.La diferencia entre el nivel máximo de OCR y la última medición del nivel basal de OCR refleja la capacidad de reserva mitocondrial. En el ensayo de tasa glucolítica, la inyección de rotenona y antimicina A apaga la respiración mitocondrial e impulsa la glucólisis al alza. La glucólisis se aprovecha inyectando 2-desoxi-d-glucosa, que compite con la glucosa para la unión a la hexoquinasa, lo que hace que el ECAR caiga al nivel mínimo.La diferencia entre el nivel máximo de glico ECAR en la última medida del nivel basal de glico ECAR refleja la capacidad de reserva de glucólisis. Para producir datos confiables, es fundamental obtener una buena calidad de los discos perforados de retina y limitar el tiempo total de disección dentro de 1.5 horas. Después del experimento, se puede cuantificar el ADN del contenido de proteínas de un disco de retina en un pozo y usarlo para normalizar los datos del caballito de mar.Por lo tanto, este protocolo se utilizó para estudiar el desarrollo, el envejecimiento y la enfermedad en la retina. También se analizó la preferencia o dependencia tisular de diferentes sustratos de combustibles como la glucosa o los ácidos grasos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

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Investigación

Neurociencias

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