Name: rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease
Uploaded: 2021-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة أبحاث ساو باولو (FAPESP ، منحة 2017/00003-0). نحن ممتنون للتنسيق من أجل تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES). نشكر الدكتور أنتوني آر ويست والدكتور هاينز شتاينر والدكتور كوي واي تسينغ على الدعم والتوجيه.

تم إجراء جميع التجارب وفقا للجنة الأخلاقيات بكلية الفلسفة والعلوم والآداب في ريبيراو بريتو (CEUA / FFCLRP 18.5.35.59.5).
1. 6-آفة OHDA
<ol><li>استخدم ذكور الفئران Sprague-Dawley التي تزن 200-250 جم في بداية التجارب (6 أسابيع). إيواء الحيوانات (2-3 لكل قفص) في ظل ظروف المختبر القياسية (12:12 ساعة دورة ...

يوضح هذا البروتوكول كيفية حث وتحليل AIMs في نموذج الفئران ل PD الناجم عن الحقن المجهري أحادي الجانب ل 6-OHDA في MFB. أدى الإعطاء اليومي المزمن لجرعات منخفضة من L-DOPA (5 ملغ/كغ، جنبا إلى جنب مع 12.5 ملغ/كغ من البنسيرازيد) إلى تطوير AIMs على مدى 3 أسابيع من العلاج. كشف التحليل الزمني عن زيادة كبيرة في AIMs ، ولو?...

يمثل سلائف الدوبامين L-3،4-ثنائي هيدروكسي فينيل ألانين (L-DOPA) العلاج الأكثر فعالية للأعراض الحركية لمرض باركنسون (PD)1. قد يخفف علاج L-DOPA من الأعراض الحركية المرتبطة بمرض باركنسون ولكنه يفقد فعاليته بمرور الوقت. تظهر التقلبات الحركية مثل "تذبذب التآكل" أو "تدهور نهاية الجرعة" سريريا كمدة قصيرة لتأثير جرعات L-DOPA المفردة2. في حالات أخرى ، تتكون المظاهر السريرية من حركات التواء بطيئة ومواقف غير طبيعية (خلل التوتر)3 وتحدث عندما تكون مستويات الدوبامين منخفضة (خلل التوتر العضلي خارج الفترة)4. من ناحية أخرى ، يظهر خلل الحركة الناجم عن L-DOPA (LID) عندما تكون مستويات الدوبامين في البلازما والدماغ مرتفعة5.
تنتج LIDs آثارا جانبية منهكة تشمل المضاعفات الحركية مثل حركات الكوريفورم وخلل التوتر والباليستية6. بمجرد إنشائها ، تحدث LIDs بعد كل إدارة L-DOPA. تحدث المضاعفات الحركية في 40٪ -50٪ من مرضى PD الذين يخضعون لعلاج L-DOPA لمدة 5 سنوات ، ويزداد معدل الإصابة على مر السنين7. على الرغم من أن الآليات الفيزيولوجية المرضية المشاركة في تطوير LIDs في مرضى PD لم يتم توضيحها بالكامل بعد ، إلا أن مدى إزالة التعصيب الدوبامين ، وإدارة L-DOPA النابضة ، والتغيرات النهائية في البروتينات والجينات المخططة ، والتشوهات في أنظمة الإرسال غير الدوبامين هي عوامل تساهم في تطوير هذه الآثار الجانبية غير المرغوب فيها6،8،9،10.
السم العصبي 6-هيدروكسي دوبامين (6-OHDA) هو أداة مميزة جيدا لدراسة PD في القوارض11،12،13،14. نظرا لأن 6-OHDA لا يعبر الحاجز الدموي الدماغي ، فيجب حقنه مباشرة في المسار الأسود. 6-استنفاد الدوبامين الناجم عن OHDA يعتمد على التركيز والموقع15. يمكن أن يؤدي الإعطاء أحادي الجانب ل 6-OHDA في حزمة الدماغ الأمامي الإنسي (MFB) إلى تلف نيغروسترياتي شديد (>90٪) في القوارض16،17،18،19. يؤدي الإعطاء المزمن ل L-DOPA إلى القوارض الشديدة من جانب واحد 6-OHDA إلى ظهور حركات تشبه خلل الحركة تسمى الحركات اللاإرادية غير الطبيعية (AIMs). تشترك الحركات الشبيهة بخلل الحركة في القوارض في آليات جزيئية ووظيفية ودوائية مماثلة تتعلق ب LIDs في مرضى PD5. لذلك ، فإن الجرذان6-OHDA 20 والفئران21 هي نماذج قيمة قبل السريرية لدراسة LID. عند علاجها بشكل مزمن (7-21 يوما) بجرعات علاجية من L-DOPA (5-20 مجم / كجم) ، تظهر الجرذان والفئران المصابة ب 6-OHDA من جانب واحد تطورا تدريجيا ل AIMs التي تؤثر على عضلات الأطراف الأمامية والجذع والفم والوجه المقابلة للآفة17،18،19،20،22،23،24 . يتم تقديم هذه الحركات في دورة زمنية مشابهة لخلل الحركة الناجم عن جرعة الذروة الناجم عن L-DOPA في مرضى PD25 وتتميز بحركات فرط الحركة وخلل التوترالعضلي 5. عادة ما يتم تسجيل AIMs بناء على شدتها (على سبيل المثال ، عند وجود AIM محدد) والسعة (على سبيل المثال ، تتميز بسعة كل حركة)5،23،25.
6-نماذج القوارض المصابة ب OHDA من LIDs تقدم صلاحية الوجه (أي أن النموذج له العديد من الخصائص التي تشبه الحالة البشرية)5،11،26،27،28. ينظر إلى AIMs القوارض ، على غرار ما يحدث في مرضى PD ، على أنها حركات مفرطة الحركة (الأطراف الأمامية واللسانية) وخلل التوتر (المحوري)29 وتحاكي خلل الحركة بجرعة الذروة. على المستوى الجزيئي والوظيفي ، تشترك نماذج القوارض في العديد من الخصائص المرضية مع مرضى PD5 ، مثل تنظيم FosB / ΔFosB19،26،30،31،32،33 وناقل السيروتونين (SERT) 34،35 . فيما يتعلق بالصلاحية التنبؤية ، فإن الأدوية التي تقلل من LIDs في مرضى PD (على سبيل المثال ، مضادات مستقبلات N-methyl-D-aspartate (NMDA) أمانتادين) تقدم فعالية مضادة للجلد في نموذج القوارض22،36،37،38،39.
تم إنشاء مقياس تصنيف AIMs للقوارض بناء على أربعة أنواع فرعية من AIMs تشمل AIMs التي تؤثر على الرأس والرقبة والجذع (AIMs المحورية) ، وحركات الأطراف الأمامية المفرطة الحركة (AIMs الأطراف) ، والحركات الفموية اللسانية الشبيهة بخلل الحركة (AIMs الفموية اللسانية). على الرغم من أن الدوران المقابل (AIMs القاطرة) موجود أيضا في القوارض المصابة من جانب واحد 20،22،23،25،40 ، إلا أنه لم يتم تسجيله كحركة تشبه خلل الحركة لأنه قد لا يمثل مقياسا محددا ل LIDs 22،37،41.
هنا ، سنصف كيفية تحفيز وتحليل الحركات الشبيهة بخلل الحركة (AIMs المحورية والأطراف والفموية) في نموذج الفئران الشديدة (>90٪) من جانب واحد 6-OHDA من PD. قمنا بتنظيم بروتوكولنا بناء على الأدبيات السابقة وخبرتنا المختبرية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-hydroxydopamine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H6507</td>
			<td>Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzerazide hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7283</td>
			<td>Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)&#160; 2.8mm B</td>
			<td>HIKVISION</td>
			<td>DS-2CE16C0T-IRP</td>
			<td>Camera used to record all behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imipramine hidrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63723</td>
			<td>Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia for surgical intervention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>16149</td>
			<td>Dopamine precursor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.30 x 13 mm</td>
			<td>PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td>Needles used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Samtec</td>
			<td></td>
			<td>Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml Sterile</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td></td>
			<td>Syringes used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to record animal behavior during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease

يشير خلل الحركة الناجم عن L-DOPA (LID) إلى المضاعفات الحركية التي تنشأ عن إعطاء L-DOPA لفترات طويلة للمرضى الذين يعانون من مرض باركنسون (PD). النمط الأكثر شيوعا الذي لوحظ في العيادة هو خلل الحركة بجرعة الذروة والذي يتكون من مظاهر سريرية للحركات الرقصية وخلل التوتر والباليستية. يحاكي نموذج الفئران 6-هيدروكسي دوبامين (6-OHDA) ل PD العديد من خصائص LID. بعد تكرار إعطاء L-DOPA ، تظهر الفئران المصابة ب 6-OHDA حركات تشبه خلل الحركة (على سبيل المثال ، حركات لا إرادية غير طبيعية ، AIMs). يوضح هذا البروتوكول كيفية تحفيز وتحليل AIMs في الفئران المصابة ب 6-OHDA مع استنفاد الدوبامين بنسبة 90٪ -95٪ في المسار الأسود. يمكن أن يؤدي الإعطاء المتكرر (3 أسابيع) من L-DOPA (5 مجم / كجم ، جنبا إلى جنب مع 12.5 مجم / كجم من benserazide) إلى تحفيز تطوير AIMs. يكشف تحليل الدورة الزمنية عن زيادة كبيرة في AIMs في 30-90 دقيقة (خلل الحركة بجرعة الذروة). تعد نماذج القوارض من LIDs أداة مهمة قبل السريرية لتحديد التدخلات الفعالة المضادة لخلل الحركة.

على الرغم من أن أنماط AIMs التي لوحظت في الفئران أبسط ومحدودة مقارنة بتلك التي لوحظت في البشر والرئيسيات غير البشرية ، فإن هذا النموذج يعيد إنتاج كل من الحركات المفرطة الحركة والحركات الشبيهة بخلل التوتر الناتجة عن إدارة L-DOPA المزمنة. نقدم هنا البيانات التي تم جمعها من مجموعة (ن = 10) من الفئرا?...

Watch this Scientific Journal Video about Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease at JoVE.com

Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease

تعد نماذج القوارض من خلل الحركة الناجم عن L-DOPA أدوات لا تقدر بثمن لتحديد التدخلات العلاجية لتخفيف التطور أو التخفيف من المظاهر التي تظهر بسبب الإدارة المتكررة ل L-DOPA. يوضح هذا البروتوكول كيفية تحفيز وتحليل الحركات الشبيهة بخلل الحركة في نموذج الفئران المصاب من جانب واحد 6-OHDA لمرض باركنسون.

تصنيف خلل الحركة الناجم عن L-DOPA في نموذج الفئران المصاب من جانب واحد 6-OHDA لمرض باركنسون

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). ...

يعد تصنيف خلل الحركة الناجم عن L-DOPA في نموذج الفئران 6-hydroxydopamine لمرض باركنسون أداة مهمة قبل السريرية لتحديد التدخلات الفعالة المضادة لخلل الحركة. هذا النموذج بسيط نسبيا ، ويقدم تكلفة منخفضة ، وله أوجه تشابه مع ما يحدث في العيادة. سيتم عرض الإجراء من قبل دانيلو لياندرو ريبيرو ، طالب دكتوراه في المختبر.ابدأ التجربة مع ذكور الفئران Sprague-Dawley ، التي يتراوح وزنها بين 200 و 250 جراما. إيواء اثنين إلى ثلاثة لكل قفص في ظل ظروف المختبر القياسية مع الغذاء والماء المتاحين حسب الطلب. قبل الجراحة ، قم بتطبيق مثبط ناقل النورإبينفرين ، إيميبرامين ، على الفئران داخل الصفاق.بعد التأكد من التخدير بسبب عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم ، ضع الجرذ في وضع عرضة في الجهاز المجسم أعلى وسادة التدفئة. بمجرد وضع الجرذ ، استخدم مشرطا لعمل شق بطول سنتيمتر واحد في المنطقة التي سيحدث فيها الحقن المجهري. بعد ذلك ، قم بتنظيف منطقة الجمجمة بمسحات القطن وتأكد من تعرض bregma و lambda.خذ حزمة الدماغ الأمامي الإنسي ، أو MFB ، الإحداثيات المجسمة من bregma عند 4.3 ملم أمامي ، و 1.6 ملم جانبي إلى الجانب الأيمن ، و 8.3 ملم بطني من مقياس التحمل. عندما يتم تحديد الإحداثيات ، قم بإدارة 6-هيدروكسي دوبامين ، أو 6-OHDA ، من جانب واحد بمعدل 0.4 ميكرولتر في الدقيقة في MFB الأيمن ، مع حقنة زجاجية هاملتون سعة 50 ميكرولتر. في نهاية الجراحة ، قم بخياطة شق فروة الرأس وإعادة ترطيب الحيوان بمحلول ملحي دافئ ومعقم بنسبة 0.9٪ تحت الجلد ، بجرعة 10 ملليلتر لكل كيلوغرام.أخرج الحيوان من الإطار المجسم وضعه في قفص استرداد دافئ ، مع المراقبة حتى يتم استعادة الوعي. في أربعة أسابيع بعد الآفة ، قم بقياس فعالية آفة الدوبامين باستخدام اختبار تدريجي ، من خلال تقييم حركية الطرف الأمامي المقابل للآفة. يجب تضمين الفئران التي تقدم ثلاث خطوات أو أقل للتكيف مع الطرف الأمامي المقابل في الدراسة كفئران مفترضة وشديدة الآفة 6-OHDA.بعد أربعة أسابيع من آفات 6-OHDA ، ابدأ العلاج المزمن يوم الاثنين وسجل حركات لا إرادية غير طبيعية يوم الأربعاء. للقيام بذلك ، ضع الجرذ داخل أسطوانة شفافة بقطر 20 سم وارتفاع 40 سم ، واتركه يتأقلم لمدة 15 دقيقة على الأقل. تأكد من تغطية الأرضية بمواد الفراش ووضع المرايا خلف الأسطوانة لمراقبة الحيوان من جميع الزوايا الممكنة.ضع كاميرا فيديو عالية الدقة للسماح بمشاهدة الحركات اللاإرادية غير الطبيعية المحورية والأطراف والفموية. ستسمح المرايا الموجودة خلف الأسطوانة بتتبع الحركات اللاإرادية غير الطبيعية بزاوية 360 درجة. يمكن وضع الكاميرا أسفل الطائرة بقليل بزاوية 15 درجة من الحيوانات لمراقبة الحركات اللاإرادية غير الطبيعية الفموية.عندما يتم تحديد الموضع ، ثبت الكاميرا مباشرة على مقاعد البدلاء. بمجرد تأقلم الحيوان لمدة 15 دقيقة ، أخرج الحيوان من الأسطوانة وقم بإدارة خمسة ملليغرام لكل كيلوغرام من L-dopamine أو L-DOPA الطازج مع 12.5 ملليغرام لكل كيلوغرام من benserazide ، تحت الجلد. ضع الحيوان مرة أخرى في الأسطوانة وابدأ مؤقتا لتتبع الحركات اللاإرادية غير الطبيعية.استخدم كاميرا فيديو لتسجيل الحركات اللاإرادية غير الطبيعية لمدة 180 دقيقة بعد الحقن ، كل 30 دقيقة ، لإجراء التسجيل دون اتصال بالإنترنت. بعد فترات المراقبة الست ، يجب إعطاء الدرجات على مدى دقيقة إلى دقيقتين وتصنيفها على أنها محورية أو أطراف أو لغوية. تأكد من عدم تضمين السلوكيات الطبيعية.يجب أن يستمر العلاج باستخدام L-DOPA و benserazide لمدة ثلاثة أسابيع ، مرة واحدة يوميا ، من الاثنين إلى الجمعة. في تحليل الدورة الزمنية التمثيلية ، يتم عرض الدرجات المطبقة على الحركات اللاإرادية غير الطبيعية المحورية والأطراف واللسانية على مدى ثلاثة أسابيع من إدارة L-DOPA المزمنة. لوحظ أن خلل الحركة الناجم عن L-DOPA ، يحدث خلل الحركة بجرعة الذروة بين 30 إلى 90 دقيقة ، مع انخفاض تدريجي بعد 120 دقيقة بعد الحقن.بالإضافة إلى ذلك ، تم تقديم مجموع الحركات اللاإرادية غير الطبيعية المحورية والأطراف واللسانية على الأفراد ، وتسجيل الأيام وأسبوعيا على مدى ثلاثة أسابيع من إعطاء L-DOPA المزمن. عادة ما يكون بروتوكول الحركات اللاإرادية غير الطبيعية مخصصا للتحقيق في أدوات علاجية جديدة ذات إمكانات متعدية مضادة للحركة.

Research

JoVE Journal

Biology

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Isacson أوله : تطوير علاجات جديدة لمرض باركنسون

The Structure of Skilled Forelimb Reaching in the Rat: A Movement Rating Scale

الهيكل من الوصول Forelimb المهرة في الجرذ : إن مقياس تقييم الحركة

Skilled reaching for food is an evolutionary ancient act and is displayed by many animal species, including those in the sister clades of rodents and ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

تطبيق الفحص جيم ايليجانس الدوبامين العصبية للتحلل من التحقق من صحة جينات مرض باركنسون المحتملة

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

زرع الأنسجة المهندسة في قلب فأر

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

فأري النموذجي لمرض باركنسون : من آفة الدوبامين 6 - OH إلى اختبار السلوكية

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

جرذ الاهتمام لأمور ظاهرية مساريق: نموذج للتحقيق في حيوية الخلوي شارك في الأوعية الدموية

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...