Name: rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease
Uploaded: 2021-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease at JoVE.com

この研究は、サンパウロ研究財団(FAPESP、助成金2017/00003-0)の支援を受けました。我々は、高等教育人材の改善のための調整(CAPES)に感謝する。アンソニー・R・ウェスト博士、ハインツ・シュタイナー博士、クエイ・Y・ツェン博士の支援と指導に感謝します。

すべての実験は、哲学、科学、およびリベイランプレター学部の倫理委員会(CEUA / FFCLRP 18.5.35.59.5)に従って実施されました。
1. 6-OHDA病変
<ol><li>実験の開始時(6週間)に体重200〜250gのSprague-Dawley雄ラットを使用する。標準的な実験室条件(12:12時間の明暗サイクル、06:00に点灯、温度管理された施設(22〜24°C)で動物(ケージあたり2〜3匹)を飼育し、食物と水を 自?...

このプロトコルは、MFBにおける6-OHDAの片側マイクロインジェクションによって誘導されるPDのラットモデルにおいてAIMを誘導および分析する方法を示す。低用量のL-DOPA(5 mg / kg、12.5 mg / kgのベンセラジドとの組み合わせ)の慢性的な毎日の投与は、治療の3週間にわたってAIMの開発をもたらしました。時間解析ではAIMの有意な増加が認められ,L-DOPA投与後30分から90分の間にピーク用量ジスキネジア...

ドーパミン前駆体L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン(L-DOPA)は、パーキンソン病(PD)1の運動症状に対する最も効果的な治療法です。L-DOPA療法は、PDに関連する運動症状を改善する可能性がありますが、時間とともに効果を失います。「摩耗変動」や「投与終了時の悪化」などの運動変動は、L-DOPA単回投与の効果の持続時間の短縮として臨床的に現れます2。他のケースでは、臨床症状はゆっくりとしたねじれ運動と異常な姿勢(ジストニア)3 で構成され、ドーパミンレベルが低いときに発生します(オフ期間ジストニア)4。一方、L-DOPA誘発性ジスキネジア(LID)は、血漿と脳のドーパミンレベルが高いときに現れます5。
LIDは、振り付け、ジストニック、弾道6の動きなどの運動合併症を含む衰弱性の副作用を引き起こします。一度確立されると、LIDはすべてのL-DOPA投与後に発生します。運動合併症は、L-DOPA療法を5年間受けているPD患者の40%〜50%で発生し、発生率は数年にわたって増加します7。PD患者におけるLIDの発生に関与する病態生理学的メカニズムはまだ完全には解明されていませんが、ドーパミン作動性除神経の程度、拍動性L-DOPA投与、線条体タンパク質および遺伝子の下流変化、および非ドーパミン伝達物質系の異常は、これらの望ましくない副作用の発症に寄与する要因です6,8,9,10。
神経毒6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)は、げっ歯類11,12,13,14のPDを研究するための十分に特徴付けられたツールです。6-OHDAは血液脳関門を通過しないため、黒質線条体経路に直接注射する必要があります。6-OHDA誘発ドーパミン作動性枯渇は、濃度および部位依存性である15。内側前脳束(MFB)への6-OHDAの片側投与は、げっ歯類に重篤な(>90%)黒質線条体損傷を引き起こす可能性があります16,17,18,19。重度の一方的な6-OHDA病変げっ歯類へのL-DOPAの慢性投与は、異常な不随意運動(AIM)と呼ばれる運動障害様運動の出現を引き起こします。げっ歯類の運動障害様運動は、PD患者のLIDに関連する同様の分子的、機能的、薬理学的メカニズムを共有しています5。したがって、6-OHDA病変ラット20およびマウス21は、LIDを研究するための貴重な前臨床モデルである。治療用量のL-DOPA(5-20 mg / kg)で慢性的に(7〜21日)治療した場合、片側性6-OHDA病変ラットおよびマウスは、病変の反対側の前肢、体幹、および口腔顔面筋に影響を与えるAIMの漸進的な発達を示します17,18,19,20,22,23,24.これらの動きは、PD患者25におけるL-DOPA誘発ピーク用量ジスキネジアと同様の時間経過で提示され、運動亢進運動およびジストニア5によって特徴付けられる。AIMは通常、その重大度(例えば、特定のAIMが存在する場合)および振幅(例えば、各運動の振幅によって特徴付けられる)に基づいてスコアリングされる5、23、25。
6-OHDA病変を有するげっ歯類モデルは、顔の妥当性を示す(すなわち、モデルは人間の状態に似たいくつかの特徴を有する)5、11、26、27、28。げっ歯類のAIMは、PD患者で発生するものと同様に、多動性(前肢および口腔)およびジストニック(軸方向)運動29と見なされ、ピーク用量ジスキネジアを模倣します。分子および機能レベルでは、げっ歯類モデルは、FosB / ΔFosB 19,26,30,31,32,33およびセロトニントランスポーター(SERT)34,35のアップレギュレーションなど、PD患者5と多くの病理学的特徴を共有しています。.予測的妥当性に関して、PD患者のLIDを減少させる薬物(例えば、N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)受容体アンタゴニストアマンタジン)は、げっ歯類モデル22,36,37,38,39において抗運動障害の有効性を示す。
げっ歯類のAIMの評価尺度は、頭、首、体幹に影響を与えるAIM(軸方向AIM)、多動性前肢運動(四肢AIM)、および運動障害様口腔運動(口腔言語AIM)を含む4つのAIMサブタイプに基づいて作成されました。対側回転(機関車AIMs)は、一方的に病変を有するげっ歯類20、22、23、25、40にも存在するが、LID22、37、41の特定の尺度を表していない可能性があるため、運動障害様運動としてスコア化されていない。
ここでは、PDの重症(>90%)一方的な6-OHDA病変ラットモデルにおける運動障害様運動(軸方向、四肢、口腔側AIM)を誘発および解析する方法について説明します。私たちは、以前の文献と研究室の専門知識に基づいてプロトコルを整理しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-hydroxydopamine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H6507</td>
			<td>Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzerazide hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7283</td>
			<td>Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)&#160; 2.8mm B</td>
			<td>HIKVISION</td>
			<td>DS-2CE16C0T-IRP</td>
			<td>Camera used to record all behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imipramine hidrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63723</td>
			<td>Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia for surgical intervention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>16149</td>
			<td>Dopamine precursor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.30 x 13 mm</td>
			<td>PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td>Needles used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Samtec</td>
			<td></td>
			<td>Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml Sterile</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td></td>
			<td>Syringes used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to record animal behavior during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease

L-DOPA誘発性ジスキネジア(LID)は、パーキンソン病(PD)患者へのL-DOPAの長期投与から生じる運動合併症を指します。クリニックで観察される最も一般的なパターンは、脈絡、ジストニック、および弾道運動の臨床症状からなるピーク用量ジスキネジアです。PDの6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)ラットモデルは、LIDのいくつかの特性を模倣しています。L-DOPA投与を繰り返した後、6-OHDA病変ラットは運動障害様運動(例えば、異常な不随意運動、AIM)を示す。このプロトコルは、黒質線条体経路で90%〜95%のドーパミン作動性枯渇を伴う6-OHDA病変ラットでAIMを誘導および分析する方法を示しています。L-DOPA(5 mg / kg、12.5 mg / kgのベンセラジドと組み合わせた)の反復投与(3週間)は、AIMの発症を誘発する可能性があります。経時的変化分析は、30〜90分でAIMの有意な増加を明らかにします(ピーク用量ジスキネジア)。LIDのげっ歯類モデルは、効果的な抗運動障害介入を特定するための重要な前臨床ツールです。

ラットで観察されたAIMsパターンは、ヒトおよび非ヒト霊長類で観察されたものと比較して単純で限定的ですが、このモデルは、慢性的なL-DOPA投与によって誘発される運動亢進運動とジストニック様運動の両方を再現します。ここでは、L-DOPA(5 mg / kgと12.5 mg / kgのベンセラジドを組み合わせた)で慢性的に治療された片側性6-OHDA病変ラットのグループ(n = 10)から3週間(月曜日から金曜日)収集され?...

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Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease

L-DOPA誘発性ジスキネジアのげっ歯類モデルは、L-DOPAの反復投与によって現れる発症を弱めたり、症状を緩和したりするための治療的介入を特定するための非常に貴重なツールです。このプロトコルは、パーキンソン病の片側性6-OHDA病変ラットモデルにおいて運動障害様運動を誘発および分析する方法を示しています。

パーキンソン病の片側性6-OHDA病変ラットモデルにおけるL-DOPA誘発ジスキネジアの評価

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). ...

パーキンソン病の6-ヒドロキシドーパミンラットモデルにおけるL-DOPA誘発性ジスキネジアの評価は、効果的な抗運動障害介入を特定するための重要な前臨床ツールです。このモデルは比較的単純で、低コストであり、診療所で起こることと類似しています。この手順は、研究室の博士課程の学生であるダニーロ・レアンドロ・リベイロによってデモンストレーションされます。体重200〜250グラムのSprague-Dawley雄ラットで実験を開始します。ケージごとに2〜3匹の動物を標準的な実験室条件下で飼育し、食物と水を自由に利用できます。手術の前に、ノルエピネフリントランスポーター阻害剤であるイミプラミンをラット腹腔内に投与します。つま先のつまみに対する反応の欠如によって麻酔を確認した後、ラットを加熱パッドの上の定位固定装置内の腹臥位に配置する。ラットを配置したら、メスを使用して、マイクロインジェクションが行われる領域に1センチの長さの切開を行います。次に、綿棒で頭蓋骨の領域をきれいにし、ブレグマとラムダが露出していることを確認します。内側前脳束(MFB)の脳定位固定座標を、前方4.3ミリメートル、右側1.6ミリメートルの横方向、およびデュロメーターから腹側8.3ミリメートルのブレグマから取得します。座標が決まったら、50マイクロリットルのハミルトンガラス製シリンジで、6-ヒドロキシドーパミンまたは6-OHDAを右MFBに毎分0.4マイクロリットルの速度で一方的に投与します。手術の終わりに、頭皮切開部を縫合し、1キログラム当たり10ミリリットルの用量で、温かい滅菌済みの0.9%生理食塩水で動物を皮下再水和する。動物を定位固定装置フレームから取り出し、意識が回復するまで監視しながら、暖かい回復ケージに入れます。病変後4週間で、病変の反対側の前肢の無動を評価することにより、ステッピングテストを使用してドーパミン作動性病変の有効性を測定します。対側前肢で3つ以下の調整ステップを示すラットは、推定される重度の6-OHDA病変ラットとして研究に含める必要があります。.6-OHDA病変の4週間後、月曜日に慢性治療を開始し、水曜日に異常な不随意運動を記録します。これを行うには、ラットを直径20センチ、高さ40センチの透明な円柱の中に置き、少なくとも15分間順応させます。床が寝具で覆われ、鏡がシリンダーの後ろに配置されていることを確認して、あらゆる角度から動物を観察します。高解像度ビデオカメラを配置して、軸方向、手足、および口腔の異常な不随意運動を表示できるようにします。シリンダーの後ろのミラーは、360度の角度で異常な不随意運動を追跡することができます。カメラは、動物から15度の角度で平面の少し下に配置して、口腔の異常な不随意運動を観察することができます。位置が決まったら、カメラを直接ベンチに固定します。動物が15分間順応したら、動物をシリンダーから取り出し、1キログラムあたり5ミリグラムの新しく調製されたL-ドーパミンまたはL-ドーパを1キログラムあたり12.5ミリグラムのベンセラジドと組み合わせて皮下投与する。動物をシリンダーに戻し、タイマーを開始して異常な不随意運動を追跡します。ビデオカメラを使用して、注射後180分間、30分間隔で異常な不随意運動を記録し、オフラインスコアリングを実行します。6つの観察期間の後、スコアは1〜2分のエポックにわたって与えられ、軸方向、四肢、または口腔言語に分類される必要があります。通常の動作を含めないようにしてください。L-DOPAとベンセラジドによる治療は、月曜日から金曜日まで、1日1回、3週間継続する必要があります。代表的な経時変化分析では、慢性L-DOPA投与の3週間にわたって軸、四肢、および口腔の異常な不随意運動に適用されたスコアが示されています。L-DOPA誘発のピーク用量ジスキネジアは30〜90分の間に発生し、注射後120分後に徐々に減少することが注目されました。.さらに、軸方向、四肢、および口腔の異常な不随意運動の合計が、慢性L-DOPA投与の3週間にわたって個人、スコアリング日、および毎週提示されました。異常な不随意運動プロトコルは通常、抗運動異常の翻訳能を持つ新しい治療ツールの調査のためのものです。

Research

JoVE Journal

Biology

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

オレIsacson：パーキンソン病に対する新しい治療法の開発

生物学

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Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

潜在的なパーキンソン病の遺伝子を検証するための線虫のドーパミンニューロンの変性のアッセイのアプリケーション

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