Name: rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease
Uploaded: 2021-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease at JoVE.com

Este trabalho contou com o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, bolsa 2017/00003-0). Agradecemos a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Agradecemos ao Dr. Anthony R. West, ao Dr. Heinz Steiner e ao Dr. Kuei Y. Tseng pelo apoio e orientação.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Comitê de Ética da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5).
1. Lesão de 6-OHDA
<ol><li>Use ratos machos Sprague-Dawley pesando 200-250 g no início dos experimentos (6 semanas). Abrigar os animais (2-3 por gaiola) em condições normais de laboratório (ciclo claro/escuro das 12:12 h, luzes acesas às 06:00 h, instalações com temperatura controlada (22-24 °C), com co...

Este protocolo demonstra como induzir e analisar AIMs no modelo de DP induzida por microinjeção unilateral de 6-OHDA na MFB. A administração diária crônica de baixas doses de L-DOPA (5 mg/kg, combinada com 12,5 mg/kg de benserazida) produziu o desenvolvimento de MIAs ao longo das 3 semanas de tratamento. A análise temporal revelou um aumento significativo dos AIMs, e a discinesia de dose máxima é observada entre 30 e 90 minutos após a administração de L-DOPA. Os MIAs são movimentos repetitivos e sem propósi...

O precursor da dopamina L-3,4-di-hidroxifenilalanina (L-DOPA) representa o tratamento mais eficaz para os sintomas motores da doença de Parkinson (DP)1. A terapia com L-DOPA pode melhorar os sintomas motores associados à DP, mas perde a eficácia com o tempo. Flutuações motoras como "flutuação de desgaste" ou "deterioração do fim da dose" manifestam-se clinicamente como uma duração encurtada do efeito de doses únicas de L-DOPA2. Em outros casos, as manifestações clínicas consistem em movimentos lentos de torção e posturas anormais (distonia)3 e ocorrem quando os níveis de dopamina são baixos (distonia fora do período)4. Por outro lado, as discinesias induzidas por L-DOPA (LIDs) aparecem quando os níveis de dopamina no plasma e no cérebro são altos5.
Os LIDs produzem efeitos colaterais debilitantes que incluem complicações motoras, como movimentos coriformes, distônicos e balísticos6. Uma vez estabelecidos, os LIDs ocorrem após cada administração de L-DOPA. Complicações motoras ocorrem em 40%-50% dos pacientes com DP submetidos à terapia com L-DOPA por 5 anos, e a incidência aumenta ao longo dos anos7. Embora os mecanismos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento de LIDs em pacientes com DP ainda não estejam totalmente elucidados, a extensão da denervação dopaminérgica, a administração pulsátil de L-DOPA, as alterações a jusante nas proteínas e genes estriatais e as anormalidades nos sistemas transmissores não dopaminérgicos são fatores que contribuem para o desenvolvimento desses efeitos colaterais indesejados 6,8,9,10.
A neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) é uma ferramenta bem caracterizada para estudar a DP em roedores11,12,13,14. Uma vez que a 6-OHDA não atravessa a barreira hematoencefálica, deve ser injetada diretamente na via nigrostriatal. A depleção dopaminérgica induzida por 6-OHDA é dependente da concentração e do local15. A administração unilateral de 6-OHDA no feixe do prosencéfalo medial (MFB) pode produzir dano nigrostriatal grave (>90%) em roedores16,17,18,19. A administração crônica de L-DOPA a roedores graves lesionados unilateralmente com 6-OHDA causa o aparecimento de movimentos discinéticos denominados movimentos involuntários anormais (AIMs). Movimentos discinéticos em roedores compartilham mecanismos moleculares, funcionais e farmacológicos semelhantes relacionados aos LIDs em pacientes com DP5. Portanto, ratos lesionados com 6-OHDA20 e camundongos21 são modelos pré-clínicos valiosos para estudar LIDs. Quando tratados cronicamente (7-21 dias) com doses terapêuticas de L-DOPA (5-20 mg/kg), ratos e camundongos lesionados com 6-OHDA apresentam um desenvolvimento gradual de MIAs que acometem os músculos do membro anterior, tronco e orofacial contralaterais à lesão 17,18,19,20,22,23,24 . Esses movimentos são apresentados em um curso temporal semelhante às discinesias de dose máxima induzidas por L-dopa em pacientes com DP25 e são caracterizados por movimentos hipercinéticos e distonia5. Os MIAs geralmente são pontuados com base em sua gravidade (por exemplo, quando uma IAM específica está presente) e amplitude (por exemplo, caracterizada pela amplitude de cada movimento)5,23,25.
Os modelos de LIDs de roedores lesados por 6-OHDA apresentam validade de face (ou seja, o modelo possui diversas características que se parecem com a condição humana)5,11,26,27,28. Os MIAs de roedores, semelhantes ao que ocorre em pacientes com DP, são vistos como movimentos hipercinéticos (membros anteriores e orolinguais) e distônicos (axiais)29 e imitam discinesia de dose máxima. No nível molecular e funcional, os modelos de roedores compartilham muitas características patológicas com pacientes com DP5, como a regulação positiva de FosB/ΔFosB 19,26,30,31,32,33 e do transportador de serotonina (SERT)34,35 . Em relação à validade preditiva, os fármacos que reduzem os LIDs em pacientes com DP (por exemplo, o antagonista do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) amantadina) apresentam eficácia antidiscinética no modelo roedor 22,36,37,38,39.
A escala de classificação de AIMs de roedores foi criada com base em quatro subtipos de AIMs que incluem AIMs que afetam a cabeça, pescoço e tronco (AIMs axiais), movimentos hipercinéticos dos membros anteriores (AIMs de membros) e movimentos orolinguais discinéticos (AIMs orolinguais). Embora a rotação contralateral (AIM locomotores) também esteja presente em roedores lesionados unilateralmente 20,22,23,25,40, ela não foi pontuada como um movimento discinético, uma vez que pode não representar uma medida específica dos LIDs 22,37,41.
Aqui, descreveremos como induzir e analisar movimentos discinéticos (AIMs axial, de membros e orolinguais) no modelo de DP de ratos com lesão unilateral de 6-OHDA grave (>90%). Organizamos nosso protocolo com base na literatura anterior e em nossa expertise laboratorial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-hydroxydopamine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H6507</td>
			<td>Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzerazide hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7283</td>
			<td>Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)&#160; 2.8mm B</td>
			<td>HIKVISION</td>
			<td>DS-2CE16C0T-IRP</td>
			<td>Camera used to record all behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imipramine hidrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63723</td>
			<td>Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia for surgical intervention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>16149</td>
			<td>Dopamine precursor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.30 x 13 mm</td>
			<td>PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td>Needles used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Samtec</td>
			<td></td>
			<td>Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml Sterile</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td></td>
			<td>Syringes used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to record animal behavior during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease

As discinesias induzidas por L-dopa (LIDs) referem-se a complicações motoras que surgem da administração prolongada de L-DOPA em pacientes com doença de Parkinson (DP). O padrão mais comum observado na clínica é a discinesia de dose máxima, que consiste em manifestações clínicas de movimentos coreiformes, distônicos e balísticos. O modelo de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) de PD em ratos imita várias características dos LIDs. Após administração repetida de L-DOPA, ratos com lesão de 6-OHDA exibem movimentos discinéticos semelhantes (por exemplo, movimentos involuntários anormais, AIMs). Este protocolo demonstra como induzir e analisar AIMs em ratos com lesão de 6-OHDA com depleção dopaminérgica de 90%-95% na via nigrostriatal. A administração repetida (3 semanas) de L-DOPA (5 mg/kg, combinada com 12,5 mg/kg de benserazida) pode induzir o desenvolvimento de AIMs. A análise do curso do tempo revela um aumento significativo nos AIMs em 30-90 min (discinesia de dose máxima). Modelos de roedores de LIDs são uma importante ferramenta pré-clínica para identificar intervenções antidiscinéticas eficazes.

Embora os padrões de MIAs observados em ratos sejam mais simples e limitados em comparação com os observados em humanos e primatas não humanos, este modelo reproduz movimentos hipercinéticos e distônicos induzidos pela administração crônica de L-DOPA. Aqui apresentamos dados coletados de um grupo (n = 10) de ratos lesionados unilateralmente com 6-OHDA tratados cronicamente com L-DOPA (5 mg/kg combinados com 12,5 mg/kg de benserazida) por 3 semanas (segunda a sexta-feira). Observe que os dados apresentados na Fig...

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Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease

Modelos de roedores de discinesias induzidas por L-dopa são ferramentas inestimáveis para identificar intervenções terapêuticas para atenuar o desenvolvimento ou aliviar as manifestações que surgem devido à administração repetida de L-DOPA. Este protocolo demonstra como induzir e analisar movimentos discinéticos no modelo unilateral de ratos lesionados com 6-OHDA da doença de Parkinson.

Avaliação de discinesias induzidas por L-dopa no modelo unilateralmente de ratos lesionados com 6-OHDA da doença de Parkinson

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). ...

A classificação das discinesias induzidas por L-dopa no modelo de rato 6-hidroxidopamina da doença de Parkinson é uma importante ferramenta pré-clínica para identificar intervenções antidiscinéticas eficazes. Esse modelo é relativamente simples, apresenta baixo custo e tem semelhanças com o que acontece na clínica. O procedimento será demonstrado por Danilo Leandro Ribeiro, doutorando em laboratório.Comece o experimento com ratos machos Sprague-Dawley, pesando de 200 a 250 gramas. Abrigar de dois a três animais por gaiola nas condições padrão de laboratório com comida e água disponíveis ad libitum. Antes da cirurgia, administre o inibidor do transportador de norepinefrina, a imipramina, ao rato por via intraperitoneal.Depois de confirmar a anestesia pela falta de resposta à pinça do dedo do pé, posicione o rato em posição prona no aparelho estereotáxico em cima da almofada de aquecimento. Uma vez que o rato esteja posicionado, use um bisturi para fazer uma incisão de um centímetro de comprimento na região onde a microinjeção ocorrerá. Em seguida, limpe a região do crânio com cotonetes e certifique-se de que o bregma e o lambda estejam expostos.Pegue o feixe estereotáxico medial, ou MFB, coordenadas estereotáxicas do bregma a 4,3 milímetros antes, 1,6 milímetros laterais ao lado direito e 8,3 milímetros ventrais do durômetro. Quando as coordenadas forem decididas, administrar a 6-hidroxidopamina, ou 6-OHDA, unilateralmente a uma taxa de 0,4 microlitros por minuto no MFB direito, com uma seringa de vidro Hamilton de 50 microlitros. Ao final da cirurgia, suture a incisão do couro cabeludo e reidrate o animal com solução salina quente, estéril, a 0,9% por via subcutânea, na dose de 10 mililitros por quilograma.Remova o animal da estrutura estereotáxica e coloque-o em uma gaiola de recuperação quente, enquanto monitora até que a consciência seja recuperada. Quatro semanas após a lesão, medir a eficácia da lesão dopaminérgica usando um teste de stepping, avaliando a acinesia do membro anterior contralateral à lesão. Ratos que apresentem três ou menos passos de ajuste com o membro anterior contralateral devem ser incluídos no estudo como ratos putativos e gravemente lesados por 6-OHDA.Quatro semanas após as lesões da 6-OHDA, inicie o tratamento crônico na segunda-feira e registre movimentos involuntários anormais na quarta-feira. Para isso, coloque o rato dentro de um cilindro transparente com 20 centímetros de diâmetro e 40 centímetros de altura, e deixe que ele se aclimate, por pelo menos 15 minutos. Certifique-se de que o chão esteja coberto com o material de cama e que os espelhos estejam posicionados atrás do cilindro para observar o animal de todos os ângulos possíveis.Posicione uma câmera de vídeo de alta resolução para permitir a visualização de movimentos involuntários anormais axiais, membros e orolinguais. Os espelhos atrás do cilindro permitirão rastrear movimentos involuntários anormais em um ângulo de 360 graus. A câmera pode ser posicionada ligeiramente abaixo do plano em um ângulo de 15 graus dos animais para observar movimentos involuntários anormais orolinguais.Quando a posição for decidida, fixe a câmera diretamente no banco. Uma vez que o animal esteja aclimatado por 15 minutos, retire o animal do cilindro e administre cinco miligramas por quilograma de L-dopamina ou L-DOPA recém-preparada combinada com 12,5 miligramas por quilograma de benserazida, por via subcutânea. Coloque o animal de volta no cilindro e inicie um temporizador para rastrear movimentos involuntários anormais.Use uma câmera de vídeo para gravar os movimentos involuntários anormais por 180 minutos após a injeção, em intervalos de 30 minutos, para realizar a pontuação off-line. Após os seis períodos de observação, os escores devem ser dados em épocas de um a dois minutos e classificados em axial, membro ou orolingual. Certifique-se de não incluir comportamentos normais.O tratamento com L-DOPA e benserazida deve ser continuado por três semanas, uma vez ao dia, de segunda a sexta-feira. Na análise representativa do curso de tempo, os escores aplicados aos movimentos involuntários anormais axiais, membros e orolinguais ao longo de três semanas de administração crônica de L-DOPA são mostrados. Observou-se que as discinesias de dose máxima induzidas por L-DOPA ocorrem entre 30 a 90 minutos, com uma diminuição gradual após 120 minutos após a injeção.Além disso, a soma dos movimentos involuntários anormais axiais, membros e orolinguais foi apresentada nos indivíduos, pontuando dias e semanalmente durante três semanas de administração crônica de L-DOPA. O protocolo de movimentos involuntários anormais é geralmente para a investigação de novas ferramentas terapêuticas com potencial translacional antidiscinético.

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologia

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