Name: rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease
Uploaded: 2021-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP, beca 2017/00003-0). Agradecemos la Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES). Agradecemos al Dr. Anthony R. West, al Dr. Heinz Steiner y al Dr. Kuei Y. Tseng por su apoyo y tutoría.

Todos los experimentos fueron realizados de acuerdo con el Comité de Ética de la Facultad de Filosofía, Ciencias y Letras de Ribeirão Preto (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5).
1. Lesión 6-OHDA
<ol><li>Utilice ratas macho Sprague-Dawley que pesen 200-250 g al comienzo de los experimentos (6 semanas). Alojar a los animales (2-3 por jaula) en condiciones estándar de laboratorio (12:12 h ciclo de luz/oscuridad, luces encendidas a las 06:00 h, instalaciones con temperatura controla...

Este protocolo demuestra cómo inducir y analizar AIMs en el modelo de rata de PD inducida por microinyección unilateral de 6-OHDA en el MFB. La administración crónica diaria de dosis bajas de L-DOPA (5 mg/kg, combinada con 12,5 mg/kg de benserazida) produjo el desarrollo de AIMs durante las 3 semanas de tratamiento. El análisis temporal reveló un aumento significativo de AIMs, y la discinesia de dosis máxima se observa entre 30 y 90 min después de la administración de L-DOPA. Los AIM son movimientos repetitivos ...

El precursor de la dopamina L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) representa el tratamiento más eficaz para los síntomas motores de la enfermedad de Parkinson (EP)1. La terapia con L-DOPA puede mejorar los síntomas motores asociados con la EP, pero pierde efectividad con el tiempo. Las fluctuaciones motoras como la "fluctuación de desgaste" o el "deterioro al final de la dosis" se manifiestan clínicamente como una duración más corta del efecto de dosis únicas de L-DOPA2. En otros casos, las manifestaciones clínicas consisten en movimientos de torsión lentos y posturas anormales (distonía)3 y ocurren cuando los niveles de dopamina son bajos (distonía fuera del período)4. Por otro lado, las discinesias inducidas por L-DOPA (LID) aparecen cuando los niveles de dopamina en el plasma y el cerebro son altos5.
Los LID producen efectos secundarios debilitantes que incluyen complicaciones motoras como movimientos coreiformes, distónicos y balísticos6. Una vez establecido, LIDs ocurren después de cada administración de L-DOPA. Las complicaciones motoras ocurren en el 40%-50% de los pacientes con EP sometidos a terapia con L-DOPA durante 5 años, y la incidencia aumenta a lo largo de los años7. Aunque los mecanismos fisiopatológicos implicados en el desarrollo de LID en pacientes con EP aún no están completamente dilucidados, el grado de denervación dopaminérgica, la administración pulsátil de L-DOPA, los cambios posteriores en las proteínas y genes estriatales y las anomalías en los sistemas transmisores no dopaminérgicos son factores que contribuyen al desarrollo de estos efectos secundarios no deseados 6,8,9,10.
La neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) es una herramienta bien caracterizada para estudiar la EP en roedores11,12,13,14. Dado que el 6-OHDA no cruza la barrera hematoencefálica, debe inyectarse directamente en la vía nigroestriatal. La depleción dopaminérgica inducida por 6-OHDA depende de la concentración y del sitio15. La administración unilateral de 6-OHDA en el haz prosencéfalo medial (MFB) puede producir daño nigroestriatal severo (>90%) en roedores16,17,18,19. La administración crónica de L-DOPA a roedores graves con lesión unilateral de 6-OHDA causa la aparición de movimientos discinéticos llamados movimientos involuntarios anormales (AIM). Los movimientos similares a los discinéticos en roedores comparten mecanismos moleculares, funcionales y farmacológicos similares relacionados con las LID en pacientes con EP5. Por lo tanto, las ratas con lesión 6-OHDA20 y los ratones21 son modelos preclínicos valiosos para estudiar las LID. Cuando se tratan crónicamente (7-21 días) con dosis terapéuticas de L-DOPA (5-20 mg/kg), las ratas y ratones lesionados unilateralmente con 6-OHDA muestran un desarrollo gradual de AIMs que afectan las extremidades anteriores, el tronco y los músculos orofaciales contralaterales a la lesión 17,18,19,20,22,23,24 . Esos movimientos se presentan en un curso de tiempo similar a las discinesias de dosis pico inducidas por L-DOPA en pacientes con EP25 y se caracterizan por movimientos hipercinéticos y distonía5. Los AIM generalmente se puntúan en función de su gravedad (por ejemplo, cuando un AIM específico está presente) y amplitud (por ejemplo, caracterizada por la amplitud de cada movimiento)5,23,25.
Los modelos de LID de roedores lesionados con 6-OHDA presentan validez facial (es decir, el modelo tiene varias características que se parecen a la condición humana)5,11,26,27,28. Los AIM de roedores, similares a lo que ocurre en pacientes con EP, se consideran movimientos hipercinéticos (extremidad anterior y orolinguales) y distónicos (axiales)29 e imitan la discinesia de dosis máximas. A nivel molecular y funcional, los modelos de roedores comparten muchas características patológicas con los pacientes con EP5, como la regulación positiva de FosB/ΔFosB 19,26,30,31,32,33 y transportador de serotonina (SERT)34,35 . En cuanto a la validez predictiva, los fármacos que reducen las LID en pacientes con EP (p. ej., el antagonista del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) amantadina) presentan eficacia antidiscinética en el modelo de roedores 22,36,37,38,39.
La escala de calificación de AIMs para roedores se creó en base a cuatro subtipos de AIMs que incluyen AIMs que afectan la cabeza, el cuello y el tronco (AIMs axiales), movimientos hipercinéticos de las extremidades anteriores (AIMs de extremidades) y movimientos orolinguales tipo discinéticos (AIMs orolinguales). Aunque la rotación contralateral (AIM locomotora) también está presente en roedores lesionados unilateralmente 20,22,23,25,40, no ha sido calificada como un movimiento de tipo discinético ya que puede no representar una medida específica de LIDs 22,37,41.
Aquí, describiremos cómo inducir y analizar movimientos similares a los discinéticos (AIM axiales, de extremidades y orolinguales) en el modelo de EP de rata severa (>90%) con lesión unilateral de 6-OHDA. Organizamos nuestro protocolo basándonos en la literatura previa y nuestra experiencia en laboratorio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-hydroxydopamine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H6507</td>
			<td>Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzerazide hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7283</td>
			<td>Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)&#160; 2.8mm B</td>
			<td>HIKVISION</td>
			<td>DS-2CE16C0T-IRP</td>
			<td>Camera used to record all behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imipramine hidrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63723</td>
			<td>Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia for surgical intervention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>16149</td>
			<td>Dopamine precursor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.30 x 13 mm</td>
			<td>PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td>Needles used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Samtec</td>
			<td></td>
			<td>Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml Sterile</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td></td>
			<td>Syringes used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to record animal behavior during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease

Las discinesias inducidas por L-DOPA (LID) se refieren a complicaciones motoras que surgen de la administración prolongada de L-DOPA a pacientes con enfermedad de Parkinson (EP). El patrón más común observado en la clínica es la discinesia de dosis máxima, que consiste en manifestaciones clínicas de movimientos coreiformes, distónicos y balísticos. El modelo de rata 6-hidroxidopamina (6-OHDA) de PD imita varias características de los LID. Después de la administración repetida de L-DOPA, las ratas con lesión de 6-OHDA exhiben movimientos discinéticos (por ejemplo, movimientos involuntarios anormales, AIMs). Este protocolo demuestra cómo inducir y analizar AIMs en ratas con lesión 6-OHDA con 90% -95% de depleción dopaminérgica en la vía nigroestriatal. La administración repetida (3 semanas) de L-DOPA (5 mg/kg, combinado con 12,5 mg/kg de benserazida) puede inducir el desarrollo de AIMs. El análisis del curso del tiempo revela un aumento significativo de los MIA a los 30-90 min (discinesia de dosis máxima). Los modelos de LID en roedores son una herramienta preclínica importante para identificar intervenciones antidiscinéticas efectivas.

Aunque los patrones AIMs observados en ratas son más simples y limitados en comparación con los observados en humanos y primates no humanos, este modelo reproduce movimientos hipercinéticos y distónicos inducidos por la administración crónica de L-DOPA. Aquí presentamos los datos recogidos de un grupo (n = 10) de ratas lesionadas unilateralmente con 6-OHDA tratadas crónicamente con L-DOPA (5 mg/kg combinado con 12,5 mg/kg de benserazida) durante 3 semanas (de lunes a viernes). Tenga en cuenta que los datos presen...

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Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease

Los modelos de roedores de discinesias inducidas por L-DOPA son herramientas invaluables para identificar intervenciones terapéuticas para atenuar el desarrollo o aliviar las manifestaciones que surgen debido a la administración repetida de L-DOPA. Este protocolo demuestra cómo inducir y analizar movimientos discinéticos en el modelo de rata con lesión unilateral de 6-OHDA de la enfermedad de Parkinson.

Calificación de discinesias inducidas por L-DOPA en el modelo de rata lesionada unilateralmente con 6-OHDA de la enfermedad de Parkinson

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). ...

La calificación de discinesias inducidas por L-DOPA en el modelo de rata 6-hidroxidopamina de la enfermedad de Parkinson es una herramienta preclínica importante para identificar intervenciones antidiscinéticas efectivas. Este modelo es relativamente simple, presenta bajo costo y tiene similitudes con lo que sucede en la clínica. El procedimiento será demostrado por Danilo Leandro Ribeiro, estudiante de doctorado en el laboratorio.Comience el experimento con ratas macho Sprague-Dawley, que pesan de 200 a 250 gramos. Aloje de dos a tres animales por jaula en las condiciones estándar de laboratorio con alimentos y agua disponibles ad libitum. Antes de la cirugía, administrar el inhibidor del transportador de norepinefrina, imipramina, a la rata por vía intraperitoneal.Después de confirmar la anestesia por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, coloque a la rata en posición prona en el aparato estereotáxico en la parte superior de la almohadilla térmica. Una vez que la rata esté posicionada, use un bisturí para hacer una incisión de un centímetro de largo en la región donde se producirá la microinyección. Luego, limpie la región del cráneo con hisopos de algodón y asegúrese de que el bregma y la lambda estén expuestos.Tome el haz prosencéfalo medial, o MFB, coordenadas estereotáxicas de bregma a 4.3 milímetros anterior, 1.6 milímetros laterales al lado derecho y 8.3 milímetros ventral desde el durómetro. Cuando se decidan las coordenadas, administre la 6-hidroxidopamina, o 6-OHDA, unilateralmente a una velocidad de 0,4 microlitros por minuto en el MFB derecho, con una jeringa de vidrio Hamilton de 50 microlitros. Al final de la cirugía, suture la incisión del cuero cabelludo y rehidrate al animal con solución salina tibia, estéril al 0,9% por vía subcutánea, a la dosis de 10 mililitros por kilogramo.Retire al animal del marco estereotáxico y colóquelo en una jaula de recuperación caliente, mientras monitorea hasta que se recupere la conciencia. A las cuatro semanas después de la lesión, medir la efectividad de la lesión dopaminérgica mediante una prueba de pasos, evaluando la acinesia de la extremidad anterior contralateral a la lesión. Las ratas que presenten tres o menos pasos de ajuste con la extremidad anterior contralateral deben incluirse en el estudio como ratas putativas, con lesión severa de 6-OHDA.Cuatro semanas después de las lesiones de 6-OHDA, comience el tratamiento crónico el lunes y registre movimientos involuntarios anormales el miércoles. Para hacerlo, coloque a la rata dentro de un cilindro transparente con 20 centímetros de diámetro y 40 centímetros de altura, y deje que se aclimate durante al menos 15 minutos. Asegúrese de que el piso esté cubierto con el material de la cama y que los espejos estén colocados detrás del cilindro para observar al animal desde todos los ángulos posibles.Coloque una cámara de video de alta resolución para permitir la visualización de movimientos involuntarios anormales axiales, de extremidades y orolinguales. Los espejos detrás del cilindro permitirán rastrear movimientos involuntarios anormales en un ángulo de 360 grados. La cámara se puede colocar ligeramente por debajo del avión en un ángulo de 15 grados de los animales para observar movimientos involuntarios anormales orolinguales.Cuando se decida la posición, fije la cámara directamente al banco. Una vez que el animal esté aclimatado durante 15 minutos, retire al animal del cilindro y administre cinco miligramos por kilogramo de L-dopamina recién preparada o L-DOPA combinada con 12,5 miligramos por kilogramo de benserazida, por vía subcutánea. Vuelva a colocar al animal en el cilindro y encienda un temporizador para rastrear los movimientos involuntarios anormales.Use una cámara de video para registrar los movimientos involuntarios anormales durante 180 minutos después de la inyección, a intervalos de 30 minutos, para llevar a cabo la puntuación fuera de línea. Después de los seis períodos de observación, los puntajes deben darse en épocas de uno a dos minutos y clasificarse como axiales, de extremidades u orolinguales. Asegúrese de no incluir comportamientos normales.El tratamiento con L-DOPA y benserazida debe continuarse durante tres semanas, una vez al día, de lunes a viernes. En el análisis del curso del tiempo representativo, se muestran las puntuaciones aplicadas a los movimientos involuntarios anormales axiales, de las extremidades y orolinguales durante tres semanas de administración crónica de L-DOPA. Se observó que las discinesias de dosis máximas inducidas por L-DOPA ocurren entre 30 y 90 minutos, con una disminución gradual después de 120 minutos después de la inyección.Además, la suma de los movimientos involuntarios anormales axiales, de las extremidades y orolinguales se presentó en individuos, anotando días y semanalmente durante tres semanas de administración crónica de L-DOPA. El protocolo de movimientos involuntarios anormales suele ser para la investigación de nuevas herramientas terapéuticas con potencial traslacional antidiscinético.

Research

JoVE Journal

Biology

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Biología

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