Name: rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease
Uploaded: 2021-10-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease at JoVE.com

Bu çalışma São Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP, hibe 2017/00003-0) tarafından desteklenmiştir. Yüksek Öğretim Personelinin İyileştirilmesi için Koordinasyon (CAPES) için minnettarız. Dr. Anthony R. West, Dr. Heinz Steiner ve Dr. Kuei Y. Tseng'e destek ve mentorluk için teşekkür ederiz.

Tüm deneyler Ribeirão Preto'nun Felsefe, Fen Bilimleri ve Mektupları Fakültesi Etik Kurulu'na (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. 6-OHDA lezyonu
<ol><li>Deneylerin başında (6 hafta) 200-250 g ağırlığındaki Sprague-Dawley erkek sıçanlarını kullanın. Hayvanları (kafes başına 2-3) standart laboratuvar koşullarında (12:12 saat aydınlık / karanlık döngüsü, saat 06:00'da ışıklar yanar, sıcaklık kontrollü tesisler (22...

Bu protokol, MFB'de 6-OHDA'nın tek taraflı mikroenjeksiyonu ile indüklenen PD'nin sıçan modelinde AIM'lerin nasıl indükleneceğini ve analiz edileceğini göstermektedir. Düşük dozlarda L-DOPA'nın (5 mg / kg, 12.5 mg / kg benserazid ile birlikte) kronik günlük uygulaması, 3 haftalık tedavi boyunca AIM'lerin gelişimini sağlamıştır. Temporal analiz, AIM'lerde önemli bir artış olduğunu ortaya koydu ve L-DOPA uygulamasından 30 ila 90 dakika sonra pik doz diskinezi gözlendi. AIM'ler eksenel, uzuv ve ...

Dopamin öncüsü L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), Parkinson hastalığının (PD) motor semptomları için en etkili tedaviyi temsil eder1. L-DOPA tedavisi PD ile ilişkili motor semptomları iyileştirebilir, ancak zamanla etkinliğini kaybeder. "Aşınma dalgalanması" veya "doz sonu bozulması" gibi motor dalgalanmalar, klinik olarak tek L-DOPA dozlarının etkisinin süresinin kısaltılması olarak kendini gösterir2. Diğer durumlarda, klinik bulgular yavaş büküm hareketleri ve anormal duruşlardan (distoni)3 oluşur ve dopamin seviyeleri düşük olduğunda ortaya çıkar (dönem dışı distoni)4. Öte yandan, L-DOPA kaynaklı diskineziler (LID'ler), plazmadaki ve beyindeki dopamin seviyeleri yüksek olduğunda ortaya çıkar5.
LID'ler, koreiform, distonik ve balistik6 hareketleri gibi motor komplikasyonları içeren zayıflatıcı yan etkiler üretir. Bir kez kurulduktan sonra, LID'ler her L-DOPA uygulamasından sonra ortaya çıkar. 5 yıl boyunca L-DOPA tedavisi gören PD hastalarının %40-50'sinde motor komplikasyonlar ortaya çıkar ve insidansı7 yıl içinde artar. PD hastalarında LID'lerin gelişiminde rol oynayan patofizyolojik mekanizmalar henüz tam olarak aydınlatılamamış olsa da, dopaminerjik denervasyonun derecesi, pulsatil L-DOPA uygulaması, striatal proteinlerde ve genlerde aşağı akış değişiklikleri ve dopamin dışı verici sistemlerdeki anormallikler bu istenmeyen yan etkilerin gelişimine katkıda bulunan faktörlerdir 6,8,9,10.
Nörotoksin 6-hidroksidopamin (6-OHDA),11,12,13,14 kemirgenlerinde PD'yi incelemek için iyi karakterize edilmiş bir araçtır. 6-OHDA kan-beyin bariyerini geçmediğinden, doğrudan nigrostriatal yola enjekte edilmelidir. 6-OHDA'ya bağlı dopaminerjik tükenme konsantrasyon ve bölgeye bağımlıdır15. Medial ön beyin demetinde (MFB) 6-OHDA'nın tek taraflı uygulanması, kemirgenlerde ciddi (>% 90) nigrostriatal hasara neden olabilir16,17,18,19. L-DOPA'nın tek taraflı olarak şiddetli 6-OHDA lezyonlu kemirgenlere kronik olarak uygulanması, anormal istemsiz hareketler (AIM'ler) adı verilen diskinetik benzeri hareketlerin ortaya çıkmasına neden olur. Kemirgenlerdeki diskinetik benzeri hareketler, PD hastalarında LID'lerle ilgili benzer moleküler, fonksiyonel ve farmakolojik mekanizmaları paylaşır5. Bu nedenle, 6-OHDA lezyonlu sıçanlar20 ve fareler21, LID'leri incelemek için değerli klinik öncesi modellerdir. L-DOPA'nın terapötik dozları (5-20 mg / kg) ile kronik olarak (7-21 gün) tedavi edildiğinde, tek taraflı olarak 6-OHDA lezyonlu sıçanlar ve fareler, lezyonun tersiyatında ön ayak, gövde ve orofasiyal kasları etkileyen AIM'lerin kademeli olarak geliştiğini göstermektedir 17,18,19,20,22,23,24 . Bu hareketler PD hastalarında L-DOPA ile indüklenen pik doz diskinezilere benzer bir zaman diliminde sunulur25 ve hiperkinetik hareketler ve distoni5 ile karakterizedir. AIM'ler genellikle şiddetlerine (örneğin, belirli bir AIM mevcut olduğunda) ve genliklerine (örneğin, her hareketin genliği ile karakterize edilir) göre puanlanır5,23,25.
6-OHDA lezyonlu LID kemirgen modelleri yüz geçerliliği sunar (yani, modelin insan durumuna benzeyen çeşitli özellikleri vardır)5,11,26,27,28. Kemirgen AIM'ler, PD hastalarında görülenlere benzer şekilde, hiperkinetik (ön ayak ve orolingual) ve distonik (aksiyel) hareketler29 olarak görülür ve pik doz diskineziyi taklit eder. Moleküler ve fonksiyonel düzeyde, kemirgen modelleri, PD hastaları 5 ile FosB / ΔFosB 19,26,30,31,32,33 ve serotonin taşıyıcısının (SERT) 34,35 upregülasyonu gibi birçok patolojik özelliği paylaşır. . Prediktif geçerlilik ile ilgili olarak, PD hastalarında LID'leri azaltan ilaçlar (örneğin, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptör antagonisti amantadin), kemirgen modelinde antidiskinezik etkinlik gösterir 22,36,37,38,39.
Kemirgen AIM derecelendirme ölçeği, baş, boyun ve gövdeyi etkileyen AIM'leri (eksenel AIM'ler), hiperkinetik ön ayak hareketlerini (uzuv AIM'leri) ve diskinetik benzeri orolingual hareketleri (orolingual AIM'ler) içeren dört AIM alt tipine dayanarak oluşturulmuştur. Kontralateral rotasyon (lokomotif AIM'ler) tek taraflı lezyonlu kemirgenlerde 20,22,23,25,40 da mevcut olmasına rağmen, LIDs 22,37,41'in spesifik bir ölçüsünü temsil etmeyebileceğinden diskinetik benzeri bir hareket olarak puanlanmamıştır.
Burada, PD'nin şiddetli (>%90) tek taraflı 6-OHDA lezyonlu sıçan modelinde diskinetik benzeri hareketlerin (eksenel, uzuv ve orolingual AIM'ler) nasıl indükleneceğini ve analiz edileceğini açıklayacağız. Protokolümüzü önceki literatüre ve laboratuvar uzmanlığımıza dayanarak düzenledik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-hydroxydopamine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H6507</td>
			<td>Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzerazide hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7283</td>
			<td>Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)&#160; 2.8mm B</td>
			<td>HIKVISION</td>
			<td>DS-2CE16C0T-IRP</td>
			<td>Camera used to record all behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imipramine hidrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J63723</td>
			<td>Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia for surgical intervention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>16149</td>
			<td>Dopamine precursor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.30 x 13 mm</td>
			<td>PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td>Needles used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Samtec</td>
			<td></td>
			<td>Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml Sterile</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td></td>
			<td>Syringes used to inject drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent cylinders</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to record animal behavior during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride</td>
			<td>Ceva Animal Health</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rating l-dopa-induced dyskinesias in the unilaterally 6-ohda-lesioned rat model of parkinson's disease

L-DOPA ile indüklenen diskineziler (LID'ler), Parkinson hastalığı (PD) olan hastalara uzun süreli L-DOPA uygulamasından kaynaklanan motor komplikasyonları ifade eder. Klinikte en sık gözlenen patern, koreiform, distonik ve balistik hareketlerin klinik belirtilerinden oluşan pik doz diskinezidir. PD'nin 6-hidroksidopamin (6-OHDA) sıçan modeli, LID'lerin çeşitli özelliklerini taklit eder. Tekrarlanan L-DOPA uygulamasından sonra, 6-OHDA lezyonlu sıçanlar diskinetik benzeri hareketler sergiler (örneğin, anormal istemsiz hareketler, AIM'ler). Bu protokol, nigrostriatal yolakta% 90-95 dopaminerjik tükenme ile 6-OHDA lezyonlu sıçanlarda AIM'lerin nasıl indükleneceğini ve analiz edileceğini göstermektedir. Tekrarlanan L-DOPA uygulaması (3 hafta) (5 mg / kg, 12.5 mg / kg benserazid ile birlikte) AIM'lerin gelişimini indükleyebilir. Zaman seyri analizi, AIM'lerde 30-90 dakikada (pik doz diskinezi) önemli bir artış olduğunu ortaya koymaktadır. LID'lerin kemirgen modelleri, etkili antidiskinetik müdahaleleri tanımlamak için önemli bir klinik öncesi araçtır.

Sıçanlarda gözlenen AIM kalıpları, insanlarda ve insan olmayan primatlarda gözlemlenenlere kıyasla daha basit ve sınırlı olmasına rağmen, bu model kronik L-DOPA uygulaması tarafından indüklenen hem hiperkinetik hem de distonik benzeri hareketleri yeniden üretir. Burada, 3 hafta boyunca (Pazartesi-Cuma) kronik olarak L-DOPA (12.5 mg / kg benserazid ile birlikte 5 mg / kg) ile tedavi edilen tek taraflı 6-OHDA lezyonlu sıçanlardan oluşan bir gruptan (n = 10) toplanan veriler sunulmaktadır. Şekil <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease at JoVE.com

Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease

L-DOPA ile indüklenen diskinezilerin kemirgen modelleri, L-DOPA'nın tekrarlanan uygulaması nedeniyle ortaya çıkan belirtileri hafifletmek veya gelişimi hafifletmek için terapötik müdahaleleri tanımlamak için paha biçilmez araçlardır. Bu protokol, Parkinson hastalığının tek taraflı 6-OHDA lezyonlu sıçan modelinde diskinetik benzeri hareketlerin nasıl indükleneceğini ve analiz edileceğini göstermektedir.

Parkinson Hastalığının Tek Taraflı 6-OHDA-Lezyonlu Sıçan Modelinde L-DOPA-İndüklenen Diskinezilerin Değerlendirilmesi

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). ...

Parkinson hastalığının 6-hidroksidopamin sıçan modelinde L-DOPA ile indüklenen diskinezilerin derecelendirilmesi, etkili antidiskinetik müdahaleleri tanımlamak için önemli bir klinik öncesi araçtır. Bu model nispeten basittir, düşük maliyet sunar ve klinikte olanlarla benzerlikler gösterir. Prosedür, laboratuvarda doktora öğrencisi olan Danilo Leandro Ribeiro tarafından gösterilecek.Deneye 200 ila 250 gram ağırlığındaki Sprague-Dawley erkek sıçanlarıyla başlayın. Standart laboratuvar koşullarında kafes başına iki ila üç hayvanı, yiyecek ve su mevcut ad libitum ile barındırın. Ameliyattan önce, norepinefrin taşıyıcı inhibitörü imipramin'i intraperitoneal olarak sıçana uygulayın.Anesteziyi ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermeyerek doğruladıktan sonra, sıçanı ısıtma yastığının üstündeki stereotaksik aparattaki eğilimli bir pozisyonda konumlandırın. Sıçan konumlandırıldıktan sonra, mikroenjeksiyonun gerçekleşeceği bölgede bir santimetre uzunluğunda bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Ardından, kafatası bölgesini pamuklu çubuklarla temizleyin ve bregma ve lambda'nın açığa çıktığından emin olun.Medial ön beyin demetini veya MFB'yi, stereotaksik koordinatları bregma'dan 4.3 milimetre önde, 1.6 milimetre yanal olarak sağ tarafa ve durometreden 8.3 milimetre ventralde alın. Koordinatlara karar verildiğinde, 6-hidroksidopamin veya 6-OHDA'yı, 50 mikrolitrelik bir Hamilton cam şırıngası ile sağ MFB'de dakikada 0.4 mikrolitre oranında tek taraflı olarak uygulayın. Ameliyatın sonunda, kafa derisi insizyonunu dikin ve hayvanı kilogram başına 10 mililitre dozunda, deri altından sıcak, steril,% 0.9 tuzlu su çözeltisi ile yeniden sulandırın.Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve bilinç yeniden kazanılana kadar izlerken sıcak bir kurtarma kafesine yerleştirin. Lezyondan sonraki dört haftada, lezyonun terlateral ön ayağının akinezisini değerlendirerek, bir basamak testi kullanarak dopaminerjik lezyonun etkinliğini ölçün. Kontralateral ön ayakla üç veya daha az ayarlama adımı sunan sıçanlar, varsayımsal, ciddi 6-OHDA lezyonlu sıçanlar olarak çalışmaya dahil edilmelidir.6-OHDA lezyonlarından dört hafta sonra, Pazartesi günü kronik tedaviye başlayın ve Çarşamba günü anormal istemsiz hareketler kaydedin. Bunu yapmak için, sıçanı 20 santimetre çapında ve 40 santimetre yüksekliğinde şeffaf bir silindirin içine yerleştirin ve en az 15 dakika boyunca iklimlendirmesine izin verin. Zeminin yatak malzemesiyle kaplandığından ve hayvanı mümkün olan tüm açılardan gözlemlemek için aynaların silindirin arkasına yerleştirildiğinden emin olun.Eksenel, uzuv ve orolingual anormal istemsiz hareketlerin görüntülenmesini sağlamak için yüksek çözünürlüklü bir video kamera konumlandırın. Silindirin arkasındaki aynalar, anormal istemsiz hareketlerin 360 derecelik bir açıyla izlenmesini sağlar. Kamera, orolingual anormal istemsiz hareketleri gözlemlemek için uçaktan 15 derecelik bir açıyla uçağın biraz altına yerleştirilebilir.Konuma karar verildiğinde, kamerayı doğrudan tezgaha sabitleyin. Hayvan 15 dakika boyunca iklimlendirildikten sonra, hayvanı silindirden çıkarın ve kilogram başına beş miligram taze hazırlanmış L-dopamin veya L-DOPA'yı, deri altından kilogram başına 12.5 miligram ile birlikte uygulayın. Hayvanı tekrar silindire koyun ve anormal istemsiz hareketleri izlemek için bir zamanlayıcı başlatın.Çevrimdışı puanlama yapmak için enjeksiyondan sonra 180 dakika boyunca anormal istemsiz hareketleri 30 dakikalık aralıklarla kaydetmek için bir video kamera kullanın. Altı gözlem periyodundan sonra, puanlar bir ila iki dakikalık dönemler boyunca verilmeli ve eksenel, uzuv veya orolingual olarak sınıflandırılmalıdır. Normal davranışları dahil etmediğinizden emin olun.L-DOPA ve benserazid ile tedavi, pazartesiden cumaya günde bir kez, üç hafta boyunca devam ettirilmelidir. Temsili zaman kursu analizinde, üç haftalık kronik L-DOPA uygulaması boyunca eksenel, uzuv ve orolingual anormal istemsiz hareketlere uygulanan puanlar gösterilmiştir. L-DOPA ile indüklenen, pik doz diskinezilerin 30 ila 90 dakika arasında meydana geldiği ve enjeksiyondan 120 dakika sonra kademeli bir azalma olduğu belirtildi.Ek olarak, aksiyel, uzuv ve orolingual anormal istemsiz hareketlerin toplamı, bireylerde, skorlama günlerinde ve haftada üç hafta boyunca kronik L-DOPA uygulaması sunuldu. Anormal istemsiz hareketler protokolü genellikle antidiskinetik translasyonel potansiyele sahip yeni terapötik araçların araştırılması içindir.

Research

JoVE Journal

Biology

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson: Parkinson Hastalığı İçin Yeni Tedaviler

Biyoloji

The Structure of Skilled Forelimb Reaching in the Rat: A Movement Rating Scale

Sıçan ulaşmak Nitelikli ön ayakları Yapısı: Hareket Ölçeği

Skilled reaching for food is an evolutionary ancient act and is displayed by many animal species, including those in the sister clades of rodents and ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Sıçan Kalp Engineered Doku implantasyonu

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson Hastalığı için murin Model: 6-OH Dopamin Lezyon Davranış Testi

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Sıçan mezenter eksteriorizasyon: Anjiogenez ilgilendim Hücresel Dinamikler araştırılması için Bir Model

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...