Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) som en modell för postinfektiös uveit

Detta protokoll beskriver stegen för att inducera tillförlitlig och robust okulär inflammation med hjälp av värmedödade mykobakterier i musmodellen. Denna grundade mykobakteriella uveitmodell kan hjälpa till att studera mekanismerna för kronisk immunmedierad okulär inflammation som utvecklas efter en mykobakteriell infektion. Denna modell av kronisk uveit kräver inte användning av specifika musstammar eller immunisering med okulära antigener.

Denna modell underlättar användningen av transgena och gen-knockout-muslinjer i mekanistiska studier av patogenesen av okulär inflammation. Denna PMU-modell kommer att vara till hjälp i studier som testar nya terapier för okulär inflammation eller uveit hos människor. Behandlingar som nya ögondroppar eller systemiskt administrerade immunmodulerande medel kan testas för effekt med denna modell.

Denna modell kommer att underlätta studier av hur värmedödade mykobakteriella antigener förändrar mikromiljön hos ett immunprivilegierat organ som ögat. Dessa resultat kan också ge insikter om hur andra typer av ögoninfektioner påverkar ögat eller hur immunprivilegierade platser, som hjärnan, svarar på mikrobakteriella antigener. För att börja, lossa kroppen på Sonicator-omvandlarenheten och rengör sonden med en 70% alkoholpinne.

Slå sedan på Sonicator och justera ströminställningen till fyra genom att vrida på strömreglaget. Därefter, för att generera en fin suspension av mikrobakterien tuberculosis H37Ra i PBS, sänk ner sondens spets i det PBS-innehållande mikrobakteriella pulvret. Sonicate blandningen på is i 30 sekunder, pausa sedan i 30 sekunder och upprepa i totalt fem minuter för att helt sprida pulvret i en jämn suspension utan att värma vätskan.

Tillsätt sedan 2,5 ml Freunds ofullständiga adjuvans till blandningen och upprepa ultraljudsbehandlingsprocessen på is tills emulsionen bildar en tandkrämliknande konsistens. För subkutan injektion, ladda 200 till 300 mikroliter av den mikrobakteriella emulsionen i en milliliter spruta. Släpp ut luften från sprutan och fortsätt fylla sprutan med intermittent invertering och knacka tills den är fylld.

Placera sedan de subkutana injektionerna på antingen höftens dorsala yta eller på benens ventrala yta proximala till området för de inguinala lymfkörtlarna i en 6 till 10 veckor gammal bedövad C57 svart 6J-mus. Sätt försiktigt in nålen, var försiktig så att du inte tränger in i muskeln och injicerar 50 mikroliter av emulsionen i det subkutana utrymmet. Ta inte bort nålen omedelbart så att den tjocka emulsionen kan injiceras helt.

För att förbereda antigenlagret för den intravitreala injektionen, sonikera H37Ra i PBS-lösning som visats tidigare, alikvotera sedan lösningen i 100 mikroliter volymer och förvara vid 20 grader Celsius. På injektionsdagen, efter att ha bekräftat djupet av generell anestesi, bedöva hornhinnan med en droppe 0,5% tetrakain och utvidga pupillen med en droppe 2,5% fenylefrin. Efter att ha dabbat bort överflödig vätska, tillsätt en droppe 5% Betadin till ögats yta och omgivande hår för att minska risken för endoftalmit.

Efter två till tre minuter, ta bort Betadin och täck ögat med 0,3% hypromellosgel för att förhindra torrhet under anestesi och kataraktbildning. Ladda sedan en 10 mikroliter spruta med antigen- och fluoresceinblandningen, placera sedan musen i ett benäget läge på plattformen och använd höger och vänster öronstänger för att fixa mushuvudet. Placera och orientera musen under omfånget så att den överlägsna nasala aspekten av höger öga är synlig.

Sedan, med hjälp av en 30 gauge nål, förskjuta ögonfransarna, exponera sclera och visualisera limbus och det radiella blodkärlet. Använd sedan en steril 30 gauge nål, gör ett styrhål i sclera en till två millimeter bakom limbus. För sedan in den 34 gauge nålen som är fäst vid injektionshållaren i ögat, genom styrhålet, i en vinkel som undviker linsen, men placera nålspetsen i glaskroppen.

Använd en mikrosprutpumpregulator och injicera försiktigt en mikroliter av M.tuberculosis-extraktet i glaskroppen. Vid konsekvent återflöde, öka injektionsvolymen till 1,5 mikroliter för att säkerställa adekvat dosleverans. Bekräfta den intravitreala placeringen genom att visualisera en grönaktig reflex i ögat och ta bort nålen från ögat efter 10 sekunder.

Efter bedövning av musen, utvidga pupillen med en droppe 2,5% fenylefrin, för att undvika överskott av droppar som kommer in i näsan eller munnen. Efter två till tre minuter, badda bort överskottsvätskan och täck ögat med 0,3% hypromellosgel. Linda sedan musen i ett lager av kirurgisk gasbindning för att bibehålla kroppsvärmen, placera sedan musen på djurkassetten och placera huvudet med bettstången.

För att få optisk koherenstomografi eller OCT-bilder, slå på OCT-bildsystemet och öppna bildprogramvaran. För bakre kammaravbildning, ta OCT nära ögats yta, var noga med att inte få linsens yta i kontakt med ögat. När ögat är korrekt placerat stoppar du snabbsökningen, väljer volymskanningsprotokollet och aktiverar skanningen med alternativet Sikta.

För bakre segmentbilder justerar du tills synnerven är centrerad i den horisontella B-skanningsjusteringsbilden och näthinnan är i linje med den vertikala justeringsaxeln. För främre segmentbilder justerar du positionen så att hornhinnans topp centreras i både den vågräta B-skanningsjusteringsbilden och den lodräta B-skanningsjusteringsbilden. Klicka slutligen på Snapshot för att fånga volymskanningsbilden och klicka sedan på spara.

24 timmar efter intravitreal injektion ses inflammatoriska celler i vatten och glasögon. Hornhinneödem, en hypopyon och flera fritt flytande inflammatoriska celler ses i den främre kammaren och vitrit i den bakre kammaren. Graden av okulär inflammation kan poängsättas på dessa OCT-bilder.

Kombinerade poäng större än noll men mindre än 2.5 representerar mild inflammation. Poäng större än 2,5, men mindre än 4,5. representerar måttlig inflammation och poäng större än 4,5 identifierar allvarlig inflammation.

Inflammationspoäng kan också bestämmas med hjälp av fem egenskaper som är synliga i hematoxylin- och eosinfläcksektioner. Svårighetsgraden bestäms genom att räkna antalet inflammatoriska celler i vattenhaltiga och glasögon. Brightfield longitudinell fundusavbildning kan också identifiera retinal och perivaskulär inflammation.

Allvarligt inflammerade ögon visar flera vita infiltrat i näthinnan och vaskulär tortuositet på färgfundusavbildning, liksom tät vitrit och retinalt ödem på OCT på dag två. Milt inflammerade ögon visar färre och mer diskreta linjära lesioner i fundus och ett antal infiltrerande celler i glaskroppen. Att säkerställa konsistens under subkutana och intravitreala injektioner och vidta lämpliga åtgärder för att förhindra utveckling av infektiös endoftalmit är de viktigaste stegen som hjälper till att framgångsrikt replikera denna modell.

In vivo bioluminescensavbildning kan användas för att karakterisera inflammation medan post-mortem-analyser, som multiparameter, flödescytometrisk analys kan utföras för att identifiera och kvantifiera infiltrerande immuncelltyppopulationer. Cytokinanalys, mRNA-sekvensering och immunofluorescensavbildning kan användas för att bedöma gen- och proteinuttrycksmönster eller identifiera retinala immuncellpopulationer vid uveit. Detta protokoll visar hur man utför reproducerbara, aseptiska och minimalt traumatiska injektioner som hjälper framtida utredare att få tillgång till det intravitreala utrymmet hos möss.

OCT kommer också att spela en viktig roll för att upptäcka ögoninflammation som annars skulle kunna missas genom en visuell undersökning av ögonen på små försöksdjur.