Name: optogenetic phase transition of tdp-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Bu çalışma SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numaraları JP19K06933 (KA) ve JP20H05345 (KA) tarafından desteklendi.

Tüm balık çalışmaları, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvan Refahı Ofisi'nde (NIH, A5561-01 güvence numarası) bulunan Ulusal Genetik Enstitüsü'nün (Japonya) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (onay kimlik numarası 24-2) uyarınca gerçekleştirildi. ABD).
1. mnr2b promotöründen optogenetik TDP-43 geninin ekspresyasyonu için BAC'lerin yapımı
<ol><li>BAC hazırlığı...

<ol>
	<li>Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+transitions+and+size+scaling+of+membrane-less+organelles.">Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles.</a> Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).</li><li>Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+in+biology.">Liquid-liquid phase separation in biology.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+rna+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).</li><li>Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+biophysics+and+neurology:+aberrant+phase+transitions+in+neurodegenerative+disease.">Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).</li><li>Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+ribostasis:+RNA-protein+granules+in+degenerative+disorders.">Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders.</a> Cell. 154 (4), 727-736 (2013).</li><li>Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+genes+in+the+genomic+era+and+their+implications+for+FTD.">ALS genes in the genomic era and their implications for FTD.</a> Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).</li><li>Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+therapeutic+potential+of+liquid-liquid+phase+separation+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).</li><li>Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+disorder+in+proteins+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).</li><li>Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+ALS:+the+FUS+about+TDP-43.">Rethinking ALS: the FUS about TDP-43.</a> Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).</li><li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-phaseted+problems+of+TDP-43+in+selective+neuronal+vulnerability+in+ALS.">Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optodroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optogenetic+induction+of+stress+granules+is+cytotoxic+and+reveals+the+evolution+of+ALS-FTD+pathology.">Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology.</a> Elife. 8, 39578 (2019).</li><li>Mann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Binding+Antagonizes+Neurotoxic+Phase+Transitions+of+TDP-43.">RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43.</a> Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).</li><li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+modulation+of+TDP-43+oligomerization+accelerates+ALS-related+pathologies+in+the+spinal+motor+neurons.">Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).</li><li>Otte, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+TDP-43+nucleation+induces+persistent+insoluble+species+and+progressive+motor+dysfunction+in+vivo.">Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo.</a> Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).</li><li>Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mnx+genes+in+endocrine+and+exocrine+pancreas+formation.">Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation.</a> Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).</li><li>Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Mnx+proteins+specify+one+motoneuron+subtype+and+suppress+acquisition+of+interneuron+characteristics.">Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics.</a> Neural Development. 7, 35 (2012).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).</li><li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish.">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li><li>Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+the+spinal+cord+motor+column+by+BAC+transgenesis+and+gene+trapping+in+zebrafish.">Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function.">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nature Communications. 5, 4925 (2014).</li><li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocadherin-mediated+cell+repulsion+controls+the+central+topography+and+efferent+projections+of+the+abducens+nucleus.">Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus.</a> Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).</li><li>Redchuk, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+regulation+of+endogenous+proteins.">Optogenetic regulation of endogenous proteins.</a> Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).</li></ol>

Zebra balıklarında opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z'nin mnr2b-BAC aracılı ifadesi, spinal motor nöronlarında TDP-43 faz geçişinin canlı görüntülenmesi için eşsiz bir fırsat sağlar. Zebra balığı larvalarının vücut dokularının optik şeffaflığı, opTDP-43h'nin basit ve noninvaziv optogenetik stimülasyonuna izin verir. Zaman içinde tek spinal motor nöronlar arasındaki karşılaştırmalar, opTDP-43h'nin ışığa bağımlı oligomerizasyonunun ALS patolojisini andıran sitoplazmik kümelenmes...

Ribonikleoprotein (RNP) granülleri, homojen bir sıvının iki ayrı sıvı fazına dönüştüğü bir fenomen olan sıvı-sıvı faz ayırma (LLPS) yoluyla membransız bölümleri birleştirerek çekirdek ve sitoplazmadaki sayısız hücresel aktiviteyi kontrol eder1,2. Normalde RNP granül bileşenleri olarak işlev görür rna bağlayıcı proteinlerin düzensiz LLPS'si anormal faz geçişini teşvik eder ve protein toplanmasına yol ederim. Bu süreç nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıklara bulaşmıştır3,4,5. RNA bağlayıcı proteinlerin sapkın LLPS'si ile hastalık patogenezinin nedensel ilişkisinin kesin olarak değerlendirilmesi, LLPS'nin etkili bir terapötik hedef olarak kullanılıp kullanılmayacağını ve nasıl kullanılabileceğini belirlemek için çok önemlidir. RNA bağlayıcı proteinlerin LLPS'lerinin in vitro ve tek hücreli modellerde çalışması nispeten kolaydır, ancak özellikle omurgalılarda çok hücreli organizmalarda zordur. Bu tür LLPS'leri doku ortamındaki bireysel hücrelerde analiz etmek için kritik bir gereklilik, hastalık açısından savunmasız bir hücre türünde LLPS'nin görüntülenmesi ve manipülasyonu için bir probun kesin olarak ifade etmesidir.
Amyotrofik lateral skleroz (ALS), beyin ve omuriliğin motor nöronlarının dejenerasyon nedeniyle seçici ve aşamalı olarak kaybolduğu sonuçta ölümcül bir nörolojik bozukluktur. Bugüne kadar, 25'ten fazla gendeki mutasyonlar, toplam ALS vakalarının% 5-10'unu oluşturan ALS'nin kalıtsal (veya ailesel) formu ile ilişkilendirilmiştir ve bu ALS nedenli genlerden bazıları hnRNPA1, TDP-43 ve FUS6,7 gibi RNP'lerden oluşan RNA bağlayıcı proteinleri kodlamaktadır. Ayrıca, toplam ALS vakalarının% 90-95'ini oluşturan ALS'nin sporadik formu, dejenere motor nöronlarda biriken TDP-43'ün sitoplazmik toplanması ile karakterizedir. Bu ALS ilişkili RNA bağlayıcı proteinlerin önemli bir özelliği, sıralı üç boyutlu yapılardan yoksun ve LLPS7,8'i yönlendiren birçok farklı proteinle zayıf protein-protein etkileşimlerine aracılık eden özünde düzensiz bölgeleri (IDR'ler) veya düşük karmaşıklık alan adlarıdır. ALS'ye neden olan mutasyonların genellikle IDR'lerde meydana gelmesi, ALS ile ilişkili bu proteinlerin anormal LLPS ve faz geçişinin ALS patogenezinin altında yatan olabileceği fikrine yol açmıştır9,10.
Son zamanlarda, protein-protein etkileşimlerinin ışıkla modülasyonunu sağlayan Cryptochrome 2 tabanlı bir optogenetik teknik olan optoDroplet yöntemi, proteinlerin IDRs11 ile faz geçişini teşvik etmek için geliştirilmiştir. Bu teknik başarıyla TDP-43'e genişletildikçe, TDP-43'ün patolojik faz geçişinin altında kalan mekanizmaları ve buna bağlı sitotoksikliğini ortaya çıkarmaya başlamıştır12,13,14,15. Bu protokolde, ALS'ye karşı savunmasız hücre tiplerine optogenetik bir TDP-43, yani motor nöron spesifikasyonu için bir homeodomain proteinini kodlayan mnr2b/mnx2b gen kodlaması için BAC kullanan zebra balıklarındaki spinal motor nöronları sunmak için genetik bir yöntem özetliyoruz16,17. Zebra balığı larvalarının yüksek yarı saydamlığı, omurilik motoru nöronlarında faz geçişini tetikleyen optogenetik TDP-43'ün basit, noninvaziv ışık stimülasyonuna izin verir. Ayrıca, optogenetik TDP-43'ün ışık stimülasyonuna verdiği tepkileri karakterize etmek için serbestçe kullanılabilen Fiji/ImageJ yazılımını kullanarak zebra balığı spinal motor nöronlarının canlı görüntülenmesi ve görüntü analizi için temel bir iş akışı sunuyoruz. Bu yöntemler, ALS'ye açık hücresel ortamda TDP-43 faz geçişinin araştırılmasına izin verir ve patolojik sonuçlarını hücresel ve davranışsal düzeyde keşfetmeye yardımcı olmalıdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axioimager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>MEE</td>
			<td>CN-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED panel</td>
			<td>Nanoleaf Limited</td>
			<td>Nanoleaf AURORA smarter kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>AD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond BAC100</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>50181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPlanFL N 20&#215;/1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Plan-Neofluar 5x/0.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>HIOKI</td>
			<td>3664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical sensor</td>
			<td>HIOKI</td>
			<td>9742-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution 0.5%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer probe BLUE-Wave</td>
			<td>StellerNet Inc.</td>
			<td>VIS-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2725R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish BAC clone CH211-172N16</td>
			<td>BACPAC Genomics</td>
			<td>CH211-172N16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic phase transition of tdp-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae

Anormal protein toplama ve seçici nöronal kırılganlık nörodejeneratif hastalıkların iki önemli özelliğidir. Bu deneysel yaklaşım şimdiye kadar sınırlı olmasına rağmen, bu özellikler arasındaki nedensel ilişkiler, hastalıkla ilişkili bir proteinin savunmasız bir hücre tipinde faz geçişini kontrol ederek sorgulanabilir. Burada, amyotrofik lateral sklerozda (ALS) dejenere motor nöronlarda meydana gelen TDP-43'ün sitoplazmik toplamasının modellenmesi için zebra balığı larvalarının spinal motor nöronlarında RNA/DNA bağlayıcı protein TDP-43'ün faz geçişini teşvik eden bir protokol açıklıyoruz. Zebra balıklarının spinal motor nöronlarına seçici olarak optogenetik bir TDP-43 varyantı sunmak için bakteriyel yapay kromozom (BAC) tabanlı bir genetik yöntem tarif ediyoruz. Zebra balığı larvalarının yüksek yarı saydamlığı, spinal motor nöronlarındaki optogenetik TDP-43'ün, sınırsız balıklara karşı ışık yayan bir diyot (LED) kullanarak basit bir dış aydınlatma ile faz geçişine izin verir. Ayrıca, optogenetik TDP-43'ün ışık aydınlatmasına verdiği tepkileri karakterize etmek için zebra balığı spinal motor nöronlarının canlı görüntüleme ve görüntü analizinin temel bir iş akışını serbestçe kullanılabilen Fiji /ImageJ yazılımı ile sunuyoruz. Bu protokol, ALS'ye karşı savunmasız bir hücresel ortamda TDP-43 faz geçişinin ve agrega oluşumunun karakterize edilmesine olanak tanır ve bu da hücresel ve davranışsal sonuçlarının araştırılmasını kolaylaştırmalıdır.

Zebra balığı larvalarının mnr2b+ spinal motor nöronlarında optogenetik ve optogenetik olmayan TDP-43 proteinlerinin canlı görüntülenmesi Zebra balıklarındaki spinal motor nöronlarında TDP-43 faz geçişini teşvik etmek için, sırasıyla N ve C-termini'nde mRFP1 ve CRY2olig22 ile etiketlenmiş bir insan TDP-43h inşa edildi ve opTDP-43h14 olarak belirlendi (Şekil 1A).</s...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

TAR DNA bağlayıcı protein 43'ün (TDP-43) zebra balıklarını model olarak kullanarak spinal motor nöronlarda ışıkla faz geçişini teşvik eden bir protokol açıklıyoruz.

Zebra Balığı Larvalarının Spinal Motor Nöronlarında TDP-43'ün Optogenetik Faz Geçişi

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Bu protokol, TDP-43'ün patolojik faz geçişlerini teşvik etmemizi ve motor nöronların ALS'de neden dejenere olduğunu anlamakla ilgili olan spinal motor nöronlarda hücresel sonuçları ele almamızı sağlar. Zebra balığı larvalarının yüksek şeffaflığı nedeniyle, omurilikteki motor nöronlar doğrudan görülebilir. Böylece tek spinal motor nöronlarda faz geçişleri geçiren TDP-43'ün dinamik davranışını görselleştirebilirsiniz.Bu yöntem ALS'nin yeni bir hayvan modelini sunar. Bu ALS modelinde ışık kaynaklı TDP-43 faz geçişini ve toplamayı önleyebilecek herhangi bir yöntemin ALS tedavisi için potansiyel bir aday olabileceğine inanıyoruz. Özünde düzensiz bölgelere sahip diğer ALS ile ilgili proteinler, anormal faz geçişleriyle ilişkili nörotoksiyi araştırmak için ifade edilebilir.Bu yaklaşımda başarının anahtarı, spinal motor nöronlardaki optogenetik TDP-43'ün toksik olmayan düzeyde ifade etmesidir. BAC transgenez zaman alıcı bir adımdır, ancak uygun bir transgenik balık oluşturduğunuzda, aşağıdaki adımlar nispeten daha kolay ve basittir. Başlamak için, bir tablette veya telefonda yüklü olan ilişkili uygulamayı kullanarak ışık yayan diyot veya LED panelini açın.Ardından, spektrometre probunu 6 kuyulu bir kabın boş bir kuyusuna yerleştirin. Ardından uygulamayı kullanarak LED ışığını 456 nm'de zirve yaparak dalga boylarına ayarlayın. Optik güç ölçerin optik sensörlerini boş kuyuya yerleştirin ve LED ışığının gücünü ayarlayın.Daha sonra LED panel ayarına sahip yemeği 28 C'de bir inkübatöre yerleştirin.Optogenetik TDP-43'ü ifade eden zebra balık larvalarının görüntülenmesi için, çift transgenik balığı kaynatın ve 250 g/mL Tricane içeren E3 tamponunda uyuşturun. Daha sonra, 42 C'de 250 g/mL etil 3-aminobenzoat metansülfonat içeren% 1 düşük erime sıcaklığı agarose önceden ısıtın.Daha sonra cam taban kabına bir damla agarose koyun. Cam tabaktaki kubbe şeklindeki agarose damlasının çapı 8 ila 10 mm olmalıdır.Daha sonra, bir Pasteur pipeti kullanarak, uyuşturuldu balığı cam bazlı tabakta agarose ekleyin. Balıkla birlikte agarose'a eklenen E3 tampon miktarını en aza indirin. Ardından, birkaç kez pipetleme ile karıştırın.Agarose katılaşması sırasında, omuriliğin uygun bir yatay konumda olması için bir şırınga iğnesi kullanarak balığı yan tarafında tut. Agarose katılaştıktan sonra, kubbe şeklindeki agarose monteli balığın üzerine birkaç damla E3 tamponu ekleyin. 20 kat suya daldırma objektif lensi ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak, omuriliğin seri konfokal z bölümlerini elde edin.Zaman noktalarındaki omurga segmentlerini tanımlamak ve karşılaştırmak için bir referans olarak, balıkların ventral tarafındaki kloakayı ilgi çekici bölgelere ekleyin. Görüntüleme tamamlanır tamamlanmaz, agarose'u dikkatlice kırmak ve balıkları agarose'dan çıkarmak için bir şırınga iğnesi kullanın. Balığın agarose'a gömdülme süresini mümkün olduğunca kısa tutun, ancak agarose 30 dakikadan daha az bir süre boyunca gömülmesi balığın canlılığını etkilemez.6 kuyulu bir yemeğin bir kuyusuna 7,5 mL E3 tampon ekleyin ve görüntülenmiş çift transgenik balığı bu kuyuya yerleştirin. Ardından, çanağı LED panele yerleştirin, çanağı ve LED panelini bir ara parça ile 5 mm ayrı tutun ve mavi LED ışığını açın. Bazı çift transgenik balıkları, unilluminated kontrol balıkları için alüminyum folyo ile kaplı ayrı bir 6 kuyulu tabakta saklayın.İstenilen aydınlatma süresinden sonra, daha önce gösterildiği gibi aydınlatılmış balığın omuriliğini görüntüledi. OpTDP-43h'nin tek spinal motor nöronlarda sitoplazmik yer değiştirmesi, 48 yaşında elde edilen z serisi görüntüler ayrılarak görselleştirildi. ve her EGFP-TDP-43z ve opTDP-43h kanalına döllenmeden 72 saat sonra.EGFP-TDP-43z'nin maksimum yoğunluk projeksiyon görüntülerinden, her ikisinde de tanımlanabilen tek bir izole spinal nöron. ve döllenme sonrası 72 saat seçildi. Motor nöronların somalarını kapsayan ilgi alanları, EGFP sinyalinin kenarı 48'de izlenerek belirlendi.ve döllenmeden 72 saat sonra. Somanın ana ekseni boyunca normalleştirilmiş floresan yoğunluğu çizildi. Döllenmeden 48 saat sonra, her iki sinyalin de desenleri büyük ölçüde birbiriyle örtüştü.Buna karşılık, 72 saatte, EGFP-TDP-43z sinyalinin düşük olduğu bölgede opTDP-43h sinyalinin zirvesi bulundu ve bu da opTDP-43h'nin sitoplazmik yer değiştirmesini gösterdi. Mavi ışık stimülasyonundan önce ve sonra opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z sinyallerini ölçmek için, aynı z serisi görüntülerin her kanalı için bazı dilim projeksiyon görüntüleri 48'de üretildi. ve döllenmeden 72 saat sonra.Araştırılan dört mnr2b+hücreden 1 hücresi, özellikle doymuş bir EGFP-TDP-43z sinyali gösterdi. OPTDP-43h ile EGFP-TDP-43z arasındaki göreli miktarlar, RFP değerinin GFP değerine bölünmesiyle hesaplanmıştır. 2 ila 4 arası hücreler, mavi ışık aydınlatmadan sonra azalan opTDP-43h seviyelerini görüntüledi.Balıkların sağlıklı kalmalarını sağlamak için agarose'a gömülme süresini en aza indirmek önemlidir. LED aydınlatmanın yoğunluğunu ve süresini ayarlayarak, TDP-43 faz geçişini geçici olarak düzenlenmiş bir şekilde kontrol ediyoruz, bu da motor nörondaki patolojik TDP-43 faz geçişinin ilerlemesinin parçalanmasına yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Chef-tdTomato kullanarak Zebrafish Somatosensoriyel Nöron Optogenetic Etkinleştirme

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Yarı sağlam Lazer Aydınlatma ile Sinir Faaliyet optogenetic Pertürbasyon<em&gt; Drosophila</emMotion&gt; Larva

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Farelerde frenik Motor nöronların retrograd nöroanatomik izleme

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Yanıt koku nöronlar Optogenetic uyarılması olarak Drosophila larva davranışını izlemek

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Prenatal Islmn'den Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyon ve Kültürü :GFP Transgenik Fareler

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

TDP-43 Proteinopatisinin Drosophila Modellerinde Glikoz Alımının Ölçülmesi

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

İn Vivo Yetenekli Motor Davranışın Kablosuz Optogenetik Kontrolü

Fine motor skills are essential in everyday life and can be compromised in several nervous system disorders. The acquisition and performance of these ...