4.4K Views
•
14:12 min
•
December 11th, 2021
DOI :
December 11th, 2021
•0:05
Introduction
1:09
Sample Preparation
4:34
Calibration Measurements
5:58
Live Cell Measurements
6:52
Data Export
7:23
Calibration Measurements
9:20
Live Cell Experiments
11:20
Results
13:17
Conclusion
Transcript
Fluorescenskors spektroskopi är en statistisk metod som använder tidsresultatfluorescens för att fastställa den dynamiska signaturen hos G-proteinkopplade receptorer i levande celler. Här är vi särskilt intresserade av beta-2 adrenergiska receptorer. Sphingolipid receptorer ger främst information om translationell diffusion dynamik och med hjälp av fluorescens anisotropi också rotations diffusion.
Genom att införa en extra etikett kan vi också pro-bindande eller till och med konformationella förändringar om främja resonans energiöverföring mellan etiketterna som probed. Kvantitativ tidsupplöst fluorescens kräver noggrann justering av inställnings- och kalibreringsmätningarna. Under de följande minuterna kommer vi att tillhandahålla en experimentell guide för livscellsfluorescenskorrelationsspektroskopi, korskorrelationsspektroskopi och Forster resonansenergiöverföring av G-proteinkopplade receptorer, med hjälp av klonbara taggar och syntetisk flödeskraft.
Cellsammanträde och transfixering måste utföras under sterila förhållanden. Placera en ren täckstång på en sex väl odlad tallrik och tvätta den med steril fosfatbuffertsaltlösning tillsätt två ml cellodlingsmedium med fenolrött kompletterat med 10% fetalt bovinserum, 100 mikrogram, per amest penicillin och 100 mikrogram per ml streptomycin till varje brunn och håll det åt sidan. Ta CHO-cellerna som odlas i samma medium med fenolrött vid 37 grader celsius i fem procent CO2 och tvätta dem med fem ml PBS för att ta bort de döda cellerna.
Tillsätt två ml trypsin och inkubera i två minuter vid rumstemperatur. Späd ut datacellerna med åtta ml medium med fenolrött och blanda försiktigt genom pipettering. Räkna cellerna i en Neubauer-kammare och sitt cellerna med en densitet av 150 000 celler per brunn i den sex brunnskulturplatta som innehåller täcksedeln.
Låt cellerna växa i en inkubator i 24 timmar för att uppnå cirka 80% sammanflöde. Späd ut två mikrogram av önskat vektor-DNA. Till exempel CT SNAP eller NT SNAP, och sex mikroliter av transfektreagenset i två separata rör.
Var och en innehåller 500 mikroliter reducerat serummedium för varje brunn och inkuberar dem i fem minuter vid rumstemperatur. Blanda de två lösningarna för att få transfektblandningen och inkubera den i ytterligare 20 minuter vid rumstemperatur. Under tiden tvättar du de sittande CHO-cellerna en gång med steril PBS.
Ersätt PBS med en ml per brunn av fenolrött fritt medium, kompletterat med 10% fetalt bovint serum och inga antibiotika. Tillsätt hela byggblandningen av en ml droppe klokt till varje brunn och inkubera cellerna över natten vid 37 grader i fem procent CO2. För märkning, späd ut lämpligt SNAP-substrat i ett ml-medium kompletterat med 10% fetalt bovinserum för att få en slutlig koncentration av en mikromolar.
Tvätta de transfekterade cellerna en gång med PBS och tillsätt en ml per brunn av en mikromolar SNAP substratlösning. Inkubera cellerna i 20 minuter vid 37 grader i fem procent CO2. Tvätta cellerna tre gånger med fenolrött fritt medium, och tillsätt två ml per brunn fenolrött fritt medium.
Inkubera cellerna i 30 minuter vid 37 grader celsius i fem procent CO2. Överför täcksedeln för alla prover därefter till bildkammaren och tvätta med 500 Microliter imaging Buffer. Lägg till 500 mikroliteravbildningsbuffert innan du går över till FRED FCS-installationen.
FRED FCS-installationen är utrustad med ett konfokalt mikroskopivattenmål, två laserlinjer, ett tidstäcke enda utländskt räkningssystem, två hybrid BMTs och två aktier för fotoninsamling och datainsamlingsprogramvaran. Det är mycket viktigt att justera installationen varje gång före mätning i levande celler. För justering av fokus, pinhole och färgposition, placera två nanomolar grön kalibreringslösning på en glaslocksslip och slå på 485 nanometer och 560 nanometerslaser som drivs i pålar, interfolierad excitation eller PI-läge.
Fokusera på lösningen och justera pinhole och krage ring position så att den högsta räknehastigheten och minsta konfokala volymen erhålls för att få maximal molekylär ljusstyrka. Upprepa denna process för de röda kanalerna med 10 nanomolar röd kalibreringslösning och en blandning av båda. Placera 10 nanomolar DNA-lösning på glasskyddsslip och justera fokus på pinhole och krageringspositionen så att korsfärgerna mellan de gröna och röda detekteringskanalerna är högst.
Det är källan till den högsta amplituden. För mätningar i levande celler, hitta en lämplig cell genom att begränsa med markörlampan och observera genom okulären. Slå på båda lasrarna i PI-läge och fokusera på membranet genom att leta efter maximala antal per sekund.
Observera att lasereffekten kan behöva minskas för cellproverna. Helst mindre än fem mikrowatt på mål. Detta beror mycket på den använda blommiga och inställningen.
Observera de automatiska och tvärkollliga kurvorna för beta-2 AR som är bundna till EGP- och snap tag-sonder i online-förhandsgranskningen av datainsamlingsprogramvaran och samla in flera sorteringsmätningar med en förvärvstid mellan 60 och 180 sekunder. Exportera korrelationskursen och kontrasten från alla mätningar. Var försiktig här för att korrekt definiera prompt- och fördröjningstidsfönstren och använd lite mikrotidsval i datakorrelationsprogramvaran.
Totalt krävs tre olika korrelationer. Automatisk korrelation av det gröna kanalpromptens tidsfönster. Automatisk korrelation mellan de röda kanalerna och fördröjningstidsfönstret.
Och slutligen korskorrelationen för den gröna kanalsignalen, och det snabba tidsfönstret var den röda kanalsignalen i fördröjningstidsfönstret. Här är de automatiska korrelationsfunktionerna hos den gröna och röda FRED för lösningar och passar dem till en 3 DT diffusionsmodell med en extra trillingterm som krävs för att kalibrera formen och storleken på den konfokala detektionsvolymen för de två användningsfärgkanalerna, där B är kurvans baslinje och antalet molekyler och fokus, TD diffusionstiden och S, nollan över omega noll formfaktorn för det konfokala volymelementet. Trillingen blinkar och fotofysiken beskrivs som amplitud AR och avslappningstid TR. Använd den kända diffusionskoefficienten för den gröna och röda kalibreringen och få formfaktorer för att bestämma dimensionerna och volymen av det smittsamma konfokala volymelementet.
Beräkna spektrumet över som IFR, den gröna fluorescerande signalen som samlas in på kanalerna nollor, och två i rätt detekteringskanal, kanal ett och tre, som ett förhållande mellan bakgrundsuppsamlade signaler. Bestäm den direkta förväntan på acceptorflödet av data av donatorns excitationsvåglängder genom förhållandet mellan den insamlade bakgrunden kontrasten av de röda kalibreringsmätningarna och snabb tidsfönstret excitation med grön laser till bakgrunden korrekt konto direkt i fördröjningstidsfönstret excitation med röd laser. Beräkna den molekylära ljusstyrkan hos B både den gröna och röda flödeskraften baserat på den insamlade kontrasten i bakgrunden, och för att få ett antal molekyler och fokusera på 3 DT-diffusionspassningen.
Passar både ultrakorresor från den gröna och röda kanalen, liksom över korrelationen från den gröna prompten och den röda fördröjningen av DUBBELNIVÅ-DNA till 3 DT-diffusionsmodellen håller de erhållna formade faktorerna konstanta för de automatiska korrelationsfunktionerna. Formfaktorn för korskorrelationsfunktionerna är vanligtvis mellan dessa två värden. Bestäm amplituden vid noll korrelationstid baserat på teckensnittsvärdena för det uppenbara antalet molekyler och fokus.
Beräkna amplitudförhållandet för ett prov var en 100% samdiffusion av grön och röd golvkraft. Anpassa cellproverna till en lämplig modell. Hur de visas membranreceptorn diffusion inte nyfiken på ett bi-modal sätt var en kort, ingen lång diffusionstid.
Dessutom måste fotofysiken och blinkandet ut golvkraften beaktas. Här till TD1 och TD2, är de två som krävs för diffusionstider. Och en är en bråkdel av den första diffusionstiden I motsats till kalibreringsmätningen där de fria tärningarna och DNA-strängarna diffusion, alla riktningar, membranreceptorer visar endast 2D-diffusion längs cellmembranen beräknar koncentrationen av gröna eller röda etikettproteiner från respekt för antal molekyler och fokus.
Och volymen av det konfokala volymelementet, med hjälp av partisk massa. Passa de två alto-korrelationerna för det dubbelmärkta exemplet med samma modell som för konstruktionen på en nivå och korskorrelationsfunktionen med hjälp av en dubbelmodal diffusionsmodell, Obs för en global beskrivning av systemet. Alla tre grödorna måste vara i form gemensamt.
Diffusionstermen är identisk för alla tre grödorna. Och den enda skillnaden är ett rykte tid faller, korskorrelationsfunktionen. Beräkna koncentrationen av gröna eller röda arbetsproteiner från respektive antal molekyler och fokus och volymen av det konfokala volymelementet.
Uppskatta fraktionen eller koncentrationen av interagerande gröna och röda etikettproteiner från cellproverna med hjälp av de korrigeringsfaktorer som erhållits från DNA-proverna, cellprovets amplitudförhållanden och respektive erhållna koncentrationer. Passa de två alter korrelationerna för FRED-provet som ett enda märkt prov och den främre korskorskorrelationen till en bimodal diffusionsmodell som innehåller en antikorrelationsterm, där AF återspeglar amplituden hos den totala antikorrelationen och AR och TR respektive amplitud och avslappningstid. Vid antikorrelaterade fluorescensförändringar på grund av FRED kan en eller flera antikorrelationstermer krävas, vilket resulterade i en dipp av Fred-korskorrelationsfunktionen vid låga korrelationstider som sammanföll med en ökning av de två automatiska korrelationsfunktionerna.
Kalibreringsmätningarna av de gröna och röda blommiga lösningarna på rakfaktorerna 6,5 och de gröna kanalerna och 6,8 i de röda kanalerna. Således har den konfokala volymen storleken 1,4 och 1,9 femto senare på denna mätdag, molekylens ljusstyrka ligger på 12,5 kilohertz per molekyl och 2,6 kilohertz per molekyl. Vi har 15% av crosstalk från den gröna blommiga för in i de röda kanalerna efter donator excitation och 38% direkt utom excitation av den röda blomformen av den gröna, från vår DNA-mätning, vi bestämmer korrigeringsfaktorerna för den konfokala överlappningsvolymen till 0,6 och 0,7 också, cellerna transfected med en enda etikett konstruktion visar bimodal tvådimensionell diffusion på cellmembranet där ungefär hälften av molekylerna diffuserar långsamt på tidsskalan på 50 till 100 millisekunder och den andra hälften relativt snabbt runt två millisekunder i båda konstruktionerna.
Dessutom är trilling blinkande närvarande. Men i den röda nivån snap konstruera en annan avslappningstid förvärvas på 180 mikrosekunder, som kan härröra från Unbound snap rakt. Från själva dubbeletiketten, transected med anti snap-konstruktionen där de två etiketterna på två olika sidor av cellmembranet, har två mindre mätningar samlats in bullret och det röda kappat på korrelation.
Och PI-korskors korrelationen är ganska hög här. Här är 70% av molekylerna, om du långsamt under hundra millisekunder tidsskala, och bara 30% snabb runt en millisekund, fraktionen av dubbla befriande molekyler låg och ligger mellan 15 och 25%Data för CT-snapen ser bättre ut och det är mindre bullrigt. Den förväntade främre djupaste antikorrelationen kan dock inte ses och är troligtvis massa av den höga mängden crosstalk, direkt acceptera excitation och trilling blinkning av både blomkraft, och när dataanalyssystem som utnyttjar den insamlade fluorescensintensiteten kan DKS hjälpa till att rädda detta som visas för den simulerade datauppsättningen.
Fördelen med Fred FCS-tekniken är att vi tillsammans med mobilitet kan undersöka konferensdynamiken hos GPCRs. Att utföra FRED FCs i labb är dock utmanande och kräver bra transfectedceller, effektiv märkning och en perfekt kalibrerad installation. Bara en FRED-parpro force är också mycket avgörande.
Kritiska experimentella steg inkluderar optimering av transfektoptimering, minimering av bakgrund och automatisk fluorescens. Dessutom kommer Atoms analyspipeline att hjälpa till att förstå den olika dynamiken hos preceptorer i levande celler. Vi hoppas att detta protokoll kommer att vara användbart utföra FRED FCS-metoden i experiment med levande celler.
Vi presenterar ett experimentellt protokoll och dataanalysarbetsflöde för att utföra levande cell dual-color fluorescence cross correlation spektroskopi (FCCS) kombinerat med Förster Resonance Energy transfer (FRET) för att studera membranreceptordynamik i levande celler med hjälp av moderna fluorescensmärkningstekniker.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved