هذا البروتوكول يزيد إلى حد كبير من قوة المجهر كوسيلة لتتبع ديناميات الميتوكوندريا داخل الخلايا الفردية على مدى فترات اكتساب طويلة. على عكس الفاصل الزمني على مجموعة ثابتة من الخلايا، أو على خلية واحدة في وقت واحد، تطبيع إلى خط أساس لكل معيار قياس في كل خلية ضوابط لعدم التجانس بين الخلايا. مع المجهر مجهزة منصة آلية وناقل الفيروسية تكييفها، يمكننا استخدام هذا البروتوكول لكل نوع من الخلايا.
ابدأ بطلاء 20 إلى 250000 خلية لكل سنتيمتر مربع في أطباق متعددة الآبار وتخزينها عند 37 درجة مئوية تحت جو يحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لبقية التجربة. في ثمانية أيام في المختبر، إضافة 0.6 غرام بيكو من مستضد P24 لكل خلية من الترميز ناقلات العدسية لMitoTimer الاستشعار البيولوجي الميتوكوندريا المخفف في الفوسفات المالحة المخزنة. في 11 يوما في المختبر، وإجراء اثنين من يغسل مع برنامج تلفزيوني معقمة قبل الحارة وإضافة المتوسطة الفلكية الطازجة دون فينول الأحمر.
تقييم نظام الميتوكوندريا الفلكية ما لا يقل عن ثلاثة إلى خمسة أيام بعد العدوى العدسية مع LV-G1 MitoTimer. حدد خمس خلايا قابضة لكل بئر مع شبكة الميتوكوندريا التي تعبر عن مستويات كافية من LV-G1 MitoTimer باستخدام تكبير 40 مرة. الحرص على تحديد الخلايا الفلكية مسطحة وكبيرة قدر الإمكان وليس موجودا في مجموعات من الخلايا.
ثم التقاط الصور الفلورية باستخدام الإثارة المتتابعة في 490 نانومتر للقناة الخضراء و 550 نانومتر للقناة الحمراء مع إشارات الفلورسنت الخضراء والحمراء واستخدام التكبير من 150 مرة لكل تنسيق. حدد الإطار الأول للقنوات الحمراء والخضراء لكل تسلسل صور بالنقر على معالجة ND وحدد الإطار. ثم دمج القنوات الحمراء والخضراء عن طريق تحديد التحويلات ودمج القناة.
لتصحيح تظليل الصور، حدد المعالجة المسبقة، ثم تصحيح التظليل التلقائي. تطبيق خوارزمية الكرة المتداول عن طريق اختيار ما قبل المعالجة والمتداول الكرة. لإنشاء أقنعة ثنائية لكل ميتوشوندريون، حدد التقسيم والعتبة.
إزالة أية كائنات اقتطاعها بواسطة الحد عن طريق تحديد ثنائي معالجة ولمس الحدود. حدد القياس، ثم منطقة الكائن، قطر EEQ، الطول، العرض، الخشونة، التعميم، أو الاستطالة لقياس مساحة السطح، القطر، الطول، العرض، الخشونة، التعميم، أو الاستطالة على التوالي. إنشاء مجموعة مع هذه القياسات وإعادة تسميتها كبيانات MOFO.
ثم حدد القياس، ثم حدد متوسط الكثافة لقياس متوسط الكثافة الخضراء والحمراء. ونسبة لقياس الأحمر بنسبة خضراء. الآن مجموعة الملحن مع هذه القياسات وإعادة تسميتها كبيانات نسبة.
وأخيرا تصدير الجدول إلى ملف CSV عن طريق تحديد مرجع وجدول إلى CSV، ومن ثم حفظ البرنامج النصي الجمعية العامة 3 للتحليل عن طريق تحديد حفظ As.Begin عن طريق فتح وحدة تتبع في NIS واختيار العرض والتحليل والتتبع. انقر على تعريف عائد الاستثمار الجديد. باستخدام أداة الكشف التلقائي، حدد 25 إلى 50 الميتوكوندريا على الصورة الأولى من تسلسل الصورة، ومن ثم انقر على المسار التلقائي الكشف عن ROIs تحليل.
إذا لزم الأمر، حذف المسارات ROI غير صحيحة وتصدير الجدول إلى ملف CSV. سجل تحويل القياسات يدويا قبل المعالجة. لكل تحليل والإطار الزمني تطبيع البيانات الناتجة يدويا حسب المتوسط الذي تم الحصول عليه في اكتساب المرجع.
ثم إجراء تحليل إحصائي باستخدام طريقة اثنين مطابقة نوفا. أظهرت الثقافة الأولية للخلايا الفلكية المصابة ب LV-G1 MitoTimer انخفاض شبكات الميتوكوندريا المتوازنة والمتأكسدة مع مستويات مختلفة من التجزئة. قبل معالجة بيروكسيد الهيدروجين، أظهرت الخلايا الفلكية التي تعبر عن LV-G1 MitoTimer حجم الميتوكوندريا غير المتجانس في مختلف شدة الفلورية الخضراء والحمراء.
تم تفتيت مورفولوجيا الميتوكوندريا لثقافات الخلايا الفلكية بعد ست ساعات من الحضانة مع بيروكسيد الهيدروجين. كان أكثر وضوحا بعد 12 ساعة من العلاج دون أقطارها مع منذ الحد من الغلاف الكروي. فيما يتعلق بحالة الأكسدة ودورانها ، بعد ثلاث ساعات من علاج بيروكسيد الهيدروجين ، زادت نسبة الميتوكوندريا الخضراء في الخلايا الفلكية.
فيما يتعلق بالديناميات والتنقل بعد ثلاث ساعات من العلاج. وقد زيدت جميع المعايير بشكل عابر. هذه التقنية مناسبة للعديد من الأسئلة المختلفة.
على سبيل المثال، في سياق الأمراض العصبية التنكسية، نحن نحقق في السمية الاستروائية لجزيئات مختلفة تفرز في الدماغ.
