Denne protokol maksimerer i høj grad styrken af mikroskopi som en metode til at spore mitokondrie dynamik i de enkelte celler over lange erhvervelse perioder. I modsætning til time-lapse på en fast gruppe af celler eller på en celle ad gangen normalisering til en baseline for hvert målt kriterium i hver celle styrer for heterogeniteten mellem celler. Med et mikroskop udstyret med automatiseret platform og viral vektor tilpasset, kan vi bruge denne protokol til enhver type celler.
Begynd med plating 20,000 til 25,000 celler pr kvadratcentimeter i multi-brønd retter og gemme dem på 37 grader celsius under en atmosfære, der indeholder 5% kuldioxid for resten af eksperimentet. På otte dage in vitro, tilføje 0,6 pico gram P24 antigen per celle af lentiviral vektor kodning for mitokondrie biosensor MitoTimer fortyndet i fosfat buffered saltvand. På 11 dage in vitro, udføre to vasker med forvarmet steril PBS og tilføje frisk astrocyt medium uden phenol rød.
Vurder det astrocytiske mitokondriesystem mindst tre til fem dage efter lentiviralinfektioner med LV-G1 MitoTimer. Vælg fem astrocytter pr. brønd med et mitokondrienetværk, der udtrykker tilstrækkelige niveauer af LV-G1 MitoTimer ved hjælp af en forstørrelse på 40 gange. Pas på at vælge astrocytter fladt og stort som muligt og ikke placeret i klynger af celler.
Derefter fange fluorescens billeder ved hjælp af sekventiel excitation på 490 nanometer for den grønne kanal og 550 nanometer for den røde kanal med grønne og røde fluorescerende signaler og ved hjælp af en forstørrelse på 150 gange for hver koordinat. Vælg den første ramme for røde og grønne kanaler for hver billedsekvens ved at klikke på ND-behandling og vælge ramme. Flet derefter de røde og grønne kanaler ved at vælge konverteringer og flette kanal.
Hvis du vil rette billedskyggen, skal du vælge forbehandling og derefter automatisk skyggekorrektion. Anvende rullende bold algoritme ved at vælge forbehandling og rullende bold. Hvis du vil generere binære masker for hver mitokondrie, skal du vælge segmentering og tærskel.
Fjern objekter, der afkortes af kanten, ved at vælge binær behandling og berøring af kant. Vælg måling, og vælg derefter objektområde, EEQ-diameter, længde, bredde, ruhed, cirkularitet eller forlængelse for at måle henholdsvis overfladeareal, diameter, længde, bredde, ruhed, cirkularitet eller forlængelse. Opret en gruppe med disse målinger, og omdøb den til MOFO-data.
Vælg derefter måling, og vælg derefter middelintensitet for at måle middelgrønne og røde intensiteter. Og forholdet til at måle det røde efter grønt forhold. Nu komponist gruppe med disse målinger og omdøbe det som forholdet data.
Eksporter endelig tabellen til en CSV-fil ved at vælge reference og tabel til CSV, og gem derefter GA 3-analysescriptet ved at vælge Gem som.Begynd ved at åbne sporingsmodulet i NIS og vælge visning, analyse og sporing. Klik på definere nye ROI. Med det automatiske detektionsværktøj skal du vælge 25 til 50 mitokondrier på det første billede af billedsekvensen og derefter klikke på spor automatisk registrerede INVESTERINGSAFKAST-analyser.
Hvis det er nødvendigt, skal du slette de forkerte investeringsafkastspor og eksportere tabellen til en CSV-fil. Log transformer målingerne manuelt, før de behandles. For hver analyse og tidsramme normaliseres de resulterende data manuelt med det middel, der opnås ved referenceerhvervelsen.
Udfør derefter statistisk analyse ved hjælp af en tovejs matchede en Nova. Primær kultur af astrocytter inficeret med LV-G1 MitoTimer udstillet reduceret afbalanceret og oxideret mitokondrie netværk med forskellige niveauer af fragmentering. Før hydrogenperoxidbehandling viste astrocytter, der udtrykte LV-G1 MitoTimer, heterogen mitokondriestørrelse i forskellige grønne og røde fluorescensintensiteter.
Den mitokondrie morfologi af astrocyt kulturer blev fragmenteret efter seks timers inkubation med hydrogenperoxid. Det var endnu mere tydeligt 12 timer efter behandlingen uden deres diametre med siden sfærisk reduktion. Med hensyn til redox tilstand og omsætning, tre timer efter en hydrogenperoxid behandling, andelen af grønne mitokondrier steg i astrocytter.
Med hensyn til dynamikken og mobiliteten tre timer efter behandlingen. Alle kriterier blev forbigående forhøjet. Denne teknik er velegnet til mange forskellige spørgsmål.
For eksempel, i forbindelse med neurodegenerativ sygdom, undersøger vi estrocytisk toksicitet af forskellige molekyler, der udskilles i hjernen.
