Dit protocol maximaliseert de kracht van microscopie aanzienlijk als een methode om mitochondriale dynamiek binnen individuele cellen gedurende lange acquisitieperioden te volgen. In tegenstelling tot time-lapse op een vaste groep cellen, of op één cel tegelijk, normaliseert normalisatie naar een basislijn voor elk gemeten criterium in elke cel voor de heterogeniteit tussen cellen. Met een microscoop uitgerust met geautomatiseerd platform en virale vector aangepast, kunnen we dit protocol gebruiken voor elk type cellen.
Begin met het platen van 20.000 tot 25.000 cellen per vierkante centimeter in multi-well gerechten en bewaar ze op 37 graden celsius onder een atmosfeer met 5% koolstofdioxide voor de rest van het experiment. Voeg na acht dagen in vitro 0,6 pico gram P24-antigeen toe per cel lentivirale vectorcodering voor mitochondriale biosensor MitoTimer verdund in fosfaat gebufferde zoutoplossing. Voer na 11 dagen in vitro twee wasbeurten uit met voorverwarmde steriele PBS en voeg vers astrocytenmedium toe zonder fenolrood.
Beoordeel het astrocytische mitochondriale systeem ten minste drie tot vijf dagen na de lentivirale infecties met LV-G1 MitoTimer. Selecteer vijf astrocyten per put met een mitochondriaal netwerk dat voldoende niveaus van LV-G1 MitoTimer tot expressie brengt met behulp van een vergroting van 40 keer. Zorg ervoor dat astrocyten zo plat en groot mogelijk worden geselecteerd en zich niet in clusters van cellen bevinden.
Leg vervolgens fluorescentiebeelden vast met behulp van sequentiële excitatie op 490 nanometer voor het groene kanaal en 550 nanometer voor het rode kanaal met groene en rode fluorescerende signalen en met behulp van een vergroting van 150 keer voor elke coördinaat. Selecteer het eerste frame voor rode en groene kanalen voor elke afbeeldingsreeks door op ND Processing te klikken en frame te selecteren. Voeg vervolgens de rode en de groene kanalen samen door conversies te selecteren en kanaal samen te voegen.
Als u de arcering van afbeeldingen wilt corrigeren, selecteert u voorbewerking en vervolgens automatische arceringscorrectie. Pas het rolling ball-algoritme toe door voorbewerking en rolling ball te selecteren. Om binaire maskers te genereren voor elk mitochondrion, selecteert u segmentatie en drempel.
Verwijder alle objecten die door de rand zijn afgekapt door binaire verwerking te selecteren en de rand aan te raken. Selecteer de meting en vervolgens het objectoppervlak, de EEQ-diameter, de lengte, de breedte, de ruwheid, de circulariteit of de rek om respectievelijk het oppervlak, de diameter, de lengte, de breedte, de ruwheid, de circulariteit of de rek te meten. Stel een groep samen met deze metingen en hernoem deze in MOFO-gegevens.
Selecteer vervolgens meting en selecteer vervolgens gemiddelde intensiteit om de gemiddelde groene en rode intensiteiten te meten. En ratio om de rood door groene verhouding te meten. Nu componist groep met deze metingen en hernoem het als ratiogegevens.
Exporteer ten slotte de tabel naar een CSV-bestand door verwijzing en tabel naar CSV te selecteren en sla vervolgens het analysescript GA 3 op door Opslaan als te selecteren.Begin door de trackingmodule in NIS te openen en weergave, analyse en tracking te selecteren. Klik op nieuwe ROI definiëren. Selecteer met de automatische detectietool 25 tot 50 mitochondriën op de eerste afbeelding van de beeldreeks en klik vervolgens op track auto gedetecteerde ROI's analyseren.
Verwijder indien nodig de onjuiste ROI-tracks en exporteer de tabel naar een CSV-bestand. Registreer handmatig de metingen voordat ze worden verwerkt. Normaliseer voor elke analyse en elk tijdsbestek handmatig de resulterende gegevens met het gemiddelde dat is verkregen in de referentie-acquisitie.
Voer vervolgens statistische analyse uit met behulp van een tweerichtingsmatch van een Nova. Primaire cultuur van astrocyten geïnfecteerd met LV-G1 MitoTimer vertoonde verminderde gebalanceerde en geoxideerde mitochondriale netwerken met verschillende niveaus van fragmentatie. Vóór de behandeling van waterstofperoxide vertoonden astrocyten die LV-G1 MitoTimer tot expressie brachten heterogene mitochondriale grootte in verschillende groene en rode fluorescentie-intensiteiten.
De mitochondriale morfologie van astrocytenculturen was gefragmenteerd na zes uur incubatie met waterstofperoxide. Het was nog duidelijker 12 uur na de behandeling zonder hun diameters met sinds sfericiteit vermindering. Wat betreft redoxtoestand en omzet, drie uur na een waterstofperoxidebehandeling, nam het aandeel groene mitochondriën toe in astrocyten.
Wat betreft de dynamiek en mobiliteit drie uur na de behandeling. Alle criteria werden tijdelijk verhoogd. Deze techniek is geschikt voor veel verschillende vragen.
In de context van neurodegeneratieve ziekten onderzoeken we bijvoorbeeld de estrocytische toxiciteit van verschillende moleculen die in de hersenen worden uitgescheiden.
