פרוטוקול זה ממקסם מאוד את כוח המיקרוסקופיה כשיטה למעקב אחר דינמיקה מיטוכונדריאלית בתוך תאים בודדים לאורך תקופות רכישה ארוכות. שלא כמו זמן-לשגות בקבוצה קבועה של תאים, או בתא אחד בכל פעם, נורמליזציה לקו בסיס עבור כל קריטריון נמדד בכל תא שולט עבור ההטרוגניות בין תאים. עם מיקרוסקופ המצויד בפלטפורמה אוטומטית ובווקטור ויראלי מותאם, אנו יכולים להשתמש בפרוטוקול זה עבור כל סוג של תאים.
התחל בחישוב 20, 000 עד 25, 000 תאים לסנטימטרים רבועים בכלים מרובי בארות ולאחסן אותם ב 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה המכילה 5% פחמן דו חמצני למשך שארית הניסוי. בשמונה ימים במבחנה, להוסיף 0.6 גרם פיקו של אנטיגן P24 לתא של קידוד וקטור lentiviral עבור biosensor מיטו-נדריאלי MitoTimer מדולל מלוחים חוצץ פוספט. ב 11 ימים במבחנה, לבצע שתי שטיפות עם PBS סטרילי התחמם מראש ולהוסיף אסטרוציטים טריים בינוני ללא פנול אדום.
להעריך את המערכת המיטוכונדריאלית אסטרוציטית לפחות שלושה עד חמישה ימים לאחר זיהומים lentiviral עם LV-G1 MitoTimer. בחר חמישה אסטרוציטים לבאר עם רשת מיטוכונדריאלית המבטאת רמות מספיקות של LV-G1 MitoTimer באמצעות הגדלה של 40 פעמים. דואג לבחור אסטרוציטים שטוחים וגדולים ככל האפשר ולא ממוקמים באשכולות של תאים.
לאחר מכן ללכוד תמונות פלואורסצנטיות באמצעות עירור רציף ב 490 ננומטר עבור הערוץ הירוק ו 550 ננומטר עבור הערוץ האדום עם אותות פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים ושימוש בהגדלה של 150 פעמים עבור כל קואורדינטות. בחר את המסגרת הראשונה עבור ערוצים אדומים וירוקים עבור כל רצף תמונה על-ידי לחיצה על עיבוד ND ובחירת מסגרת. לאחר מכן מזג את הערוצים האדומים והירוקים על-ידי בחירת המרות ומיזוג ערוץ.
לתיקון הצללת תמונה, בחר קדם-עיבוד ולאחר מכן תיקון הצללה אוטומטי. החל את אלגוריתם הכדור המתגלגל על ידי בחירת טרום עיבוד וכדור מתגלגל. כדי ליצור מסיכות בינאריות עבור כל מיטוכונדריון, בחר פילוח וסף.
הסר אובייקטים שנחתכו על-ידי הגבול על-ידי בחירת עיבוד בינארי וגבול נוגע ללב. בחר מדידה ולאחר מכן אזור אובייקט, קוטר EEQ, אורך, רוחב, חספוס, מעגליות או התארכות כדי למדוד שטח פנים, קוטר, אורך, רוחב, חספוס, מעגליות או התארכות בהתאמה. חבר קבוצה עם מדידות אלה ושנה את שמה לנתוני MOFO.
לאחר מכן בחר מדידה ולאחר מכן בחר עוצמה ממוצעת כדי למדוד את העוצמה הירוקה והאדומה הממוצעת. ויחס כדי למדוד את היחס האדום לפי ירוק. כעת קבוצת מלחינים עם מדידות אלה ושנה את שמה כנתוני יחס.
לבסוף לייצא את הטבלה לקובץ CSV על ידי בחירת הפניה וטבלה ל- CSV ולאחר מכן לשמור את קובץ ה- SCRIPT GA 3 של ניתוח על ידי בחירה שמירה As.Begin על ידי פתיחת מודול המעקב ב- NIS ובחירת תצוגה, ניתוח ומעקב. לחץ על הגדר ROI חדש. בעזרת כלי הזיהוי האוטומטי, בחר 25 עד 50 מיטוכונדריה בתמונה הראשונה של רצף התמונות ולאחר מכן לחץ על ניתוח ROIs שזוהה באופן אוטומטי.
במידת הצורך, מחק את רצועות ה- ROI השגויות וייצוא הטבלה לקובץ CSV. רשום באופן ידני את המידות לפני העיבוד. עבור כל ניתוח ומסגרת זמן לנרמל באופן ידני את הנתונים המתקבלים בממוצע המתקבל ברכישת הייחוס.
לאחר מכן בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות דו כיווני תואם נובה. התרבות העיקרית של אסטרוציטים נגועים LV-G1 MitoTimer הציג רשתות מיטוכונדריאליות מאוזנות מחומצנות עם רמות שונות של פיצול. לפני טיפול מי חמצן, אסטרוציטים המבטשים LV-G1 MitoTimer הראו גודל מיטוכונדריאלי הטרוגניים בעוצמות פלואורסצנטיות ירוקות ואדומות שונות.
המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של תרביות אסטרוציטים התפצלה לאחר שש שעות של דגירה עם מי חמצן. זה היה אפילו יותר ברור 12 שעות לאחר הטיפול ללא הקטרים שלהם עם מאז הפחתת כדוריות. לגבי מצב redox ומחזור, שלוש שעות לאחר טיפול מי חמצן, שיעור המיטוכונדריה הירוקה גדל אסטרוציטים.
לגבי הדינמיקה והניידות שלוש שעות לאחר הטיפול. כל הקריטריונים הוגדלו באופן ארעי. טכניקה זו מתאימה לשאלות רבות ושונות.
לדוגמה, בהקשר של מחלה ניווניות, אנו חוקרים את הרעילות האסטרוציטית של מולקולות שונות המופרשות במוח.
