Name: live-imaging of mitochondrial system in cultured astrocytes
Uploaded: 2021-11-16T13:00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes at JoVE.com

इस अध्ययन को केआर और लुसाने विश्वविद्यालय अस्पताल (CHUV) को सम्मानित एक सिनेप्सिस फाउंडेशन फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। लेखकों को उनकी मदद के लिए Nikon धंयवाद, विशेष रूप से जे Gannevat ।

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लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

यहां, एक सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट में माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली की गतिशीलता और कारोबार का पालन करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तावित है। कोशिकाओं के एक निश्चित समूह या एक समय में एक व्यक्तिगत कोशिका पर एक समय-चूक दृष्टिकोण के विपरीत (अक्सर साहित्य में उपयोग किया जाता है)24,25,शोधकर्ता एक ही व्यक्तिगत कोशिकाओं पर कई दिनों के दौरान माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम के विकास का पालन कर सकते हैं। एकल अच्छी तरह से लाइव इमेजिंग के विपरीत जहां प्रकाश जोखिम के उच्च स्तर की आवश्यकता होती है, और कई व्यक्तिगत कोशिकाओं का चयन कम संभव है, प्रस्तावित विधि इस माइक्रोस्कोप की एक अच्छी तरह से विभिन्न क्षेत्रों में कई विभिन्न कोशिकाओं को छवि बनाने और उन्हें फिर से छवि करने के लिए विभिन्न समय बिंदुओं पर उन समान कोशिकाओं पर वापस आने की क्षमता का लाभ उठाती है। ब्याज की प्रत्येक कोशिका पर प्रत्येक मापा मापदंड के लिए किए गए एक आधार रेखा के लिए सामान्यीकरण के लिए धन्यवाद, यह माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम की जटिलता को ध्यान में रखता है और अपनी आधारभूत छवि के सापेक्ष प्रत्येक कोशिका पर उपचार के प्रभाव की जांच करता है। माइक्रोस्कोप की क्षमता स्वायत्त रूप से एक समय में 16 कुओं तक इमेजिंग के इस प्रकार को पूरा करने के लिए (इमेजिंग 5 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह) माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली की विषमता के लिए अनुमति देता है जो विभिन्न दिनों में विभिन्न स्थितियों इमेजिंग के साथ आने वाली प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के बिना विश्लेषण के दौरान ठीक से ध्यान में रखा जा सकता है।
संस्कृतियों की गुणवत्ता, एलवी-जी1-माइटोटाइमर बायोसेंसर, माइक्रोस्कोप और उद्देश्यों के प्रकार, और उपयुक्त कोशिकाओं का चयन व्यक्त करने वाले वायरल संक्रमणों का स्तर महत्वपूर्ण चर हैं जो इस प्रोटोकॉल में यथासंभव सुसंगत रहना चाहिए। सेल घनत्व, वेक्टर के प्रकार, और वायरल टाइटर्स को प्रश्न के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है। यद्यपि पिछले काम से पता चलता है कि एलवी-जी 1-मिटोटाइमर अभिव्यक्ति में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और गतिशीलता21, 22,26, 27के लिए कोई हानिकारक परिणाम नहीं है, यह सत्यापित करना आवश्यक है कि कोशिकाओं के लिए एकाग्रता विषाक्त नहीं है (उदाहरण के लिए, नियंत्रण में कोशिकाओं की कुल संख्या की जांच अच्छीतरहसे)। जैसा कि एक फोकल प्लेन का उपयोग किया जाता है, एस्ट्रोसाइट्स होना चाहिए: (1) जितना संभव हो उतना सपाट, (2) अन्य लेबल कोशिकाओं से अलग (पकवान में विस्थापन के मामले में विश्लेषण को सरल बनाने के लिए), और (3) उच्च फ्लोरेसेंस स्तर रखते हैं। चूंकि संस्कृति में कोशिकाएं आकृति विज्ञान में अत्यधिक परिवर्तनशील हो सकती हैं, इसलिए माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली अत्यधिक विषम हो सकती है। इस संदर्भ में, आरओआई का विश्लेषण करना (और पूरी कोशिका नहीं) कुछ समस्याग्रस्त क्षेत्रों, जैसे कि पेरिन्यूक्लियर क्षेत्रों के लिए क्षतिपूर्ति करता है, और परिवर्तनशीलता को कम करता है। अपेक्षाकृत समान कोशिकाओं और नमूने पर यथासंभव अधिक से अधिक कोशिकाओं पर आधारभूत करना आवश्यक है। नतीजतन, उच्च सामग्री अधिग्रहण और विश्लेषण माइक्रोस्कोप आदर्श रूप से अनुकूल हैं। इस देशांतर निगरानी के दौरान, बायोसेंसर ब्लीचिंग से बचने के लिए कोशिकाओं को प्रकाश में अधिक नहीं करना भी महत्वपूर्ण है।
यह इमेजिंग विधि इसकी जटिलताओं के बिना नहीं है, और पूरे प्रोटोकॉल में, कई नोट्स शामिल हैं, जो माइक्रोस्कोप के साथ पिछले परीक्षणों के दौरान किए गए समस्या निवारण को ध्यान में रखते हैं। उदाहरण के लिए, इस्तेमाल की गई प्लेट कोटिंग का विकल्प अभीष्ट परख पर निर्भर करता है, लेकिन एस्ट्रोसाइट प्राथमिक संस्कृतियों के लिए सबसे उपयुक्त विकल्पों के लिए सिफारिशों को शामिल किया गया है। इसके अतिरिक्त, अंतरकोशिकीय परिवर्तनशीलता के कारण प्रति शर्त कम से कम 5 कोशिकाओं पर छवि अधिग्रहण किया जाना चाहिए। अधिक विशेष रूप से, बेसलाइन इमेजिंग में चयनित कुछ कोशिकाएं मर जाएंगी, कुछ सौंपे गए छवि अधिग्रहण क्षेत्र के फ्रेम से बाहर निकल जाएंगी, और कुछ अपनी आकृति विज्ञान को बदल देंगे, जिससे माइटोकॉन्ड्रिया विश्लेषण में व्यक्तिगत होना बहुत मुश्किल हो जाएगा। शुरुआत से कई कोशिकाओं इमेजिंग प्रयोग के अंत में विश्लेषण करने के लिए कोशिकाओं के एक बड़े पर्याप्त नमूना आकार की संभावना में वृद्धि। इस इमेजिंग तकनीक के अधिक जटिल पहलुओं के अलावा, जहां तक इमेजिंग और विश्लेषण के इस प्रकार से लाभ हो सकता है, कुछ एकमुश्त सीमाएं हैं। छवि अधिग्रहण के स्वचालितीकरण का पूरा लाभ उठाने के लिए, उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप में एक ऑटोफोकस सिस्टम होना चाहिए जो छवियों के बीच समय अंतराल की गति को संभाल सके (यानी, इस प्रोटोकॉल में हर 3 एस) और प्रत्येक छवि को लेने से पहले लगातार प्रश्न में सेल पर ध्यान केंद्रित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, जॉब्स सॉफ्टवेयर के बिना, जो पूरी छवि अधिग्रहण प्रक्रिया को स्वचालित करता है, यह विधि कोशिकाओं की संख्या के आधार पर दुरूह और संभावित रूप से असंभव हो जाती है क्योंकि इसे उचित समय बिंदु पर प्रत्येक कोशिका को फिर से खोजने और इमेजिंग की आवश्यकता होगी। अंत में, यह इमेजिंग विधि फोटोब्लैचिंग के मुद्दे से प्रतिरक्षा नहीं है। इस कारण से, किसी भी दीर्घकालिक अधिग्रहण विधि के साथ, फ्लोरोसेंट मार्कर चुनना महत्वपूर्ण है जो फोटोब्लैचिंग के लिए कम संवेदनशील हैं और जितना संभव हो इस मुद्दे से बचने के लिए छवि अधिग्रहण दर्जी करते हैं।
यह तकनीक वर्तमान में एक महत्वपूर्ण तरीके से उपयोग किए जाने वाले अन्य लोगों से अलग है। अन्य समय-चूक अध्ययनों के विपरीत, इस तकनीक को पूरे समय में एक ही स्थिति पर इमेजिंग की आवश्यकता नहीं होती है, न ही अन्य क्षेत्रों को छवि बनाने के लिए प्लेट के मैनुअल आंदोलन की आवश्यकता होती है। यह शोधकर्ताओं को एक 24 घंटे की समय सीमा में कई स्थितियों में कई कोशिकाओं को छवि करने की क्षमता की अनुमति देता है । नतीजतन, प्रत्येक कुएं में कई कोशिकाओं पर इस इमेजिंग और विश्लेषण को पूरा करने की क्षमता एक ही जनसंख्या जानकारी देती है जो एक ही जनसंख्या जानकारी देती है जो कोशिकाओं के एक बड़े समूह का मोटे तौर पर अध्ययन करने से प्राप्त होती है, जबकि इसके अतिरिक्त प्रत्येक कोशिका से विशिष्ट उपाय प्रदान करती है। जबकि इस विधि के लिए कुछ विशिष्टताएं अन्य छवि अधिग्रहण विधियों (ऊपर उल्लिखित) पर लागू नहीं हो सकती हैं, लाभ अधिग्रहण के बाद संभव विश्लेषण के प्रकार के साथ जटिलताओं से पल्ला झाड़ लेते हैं। यह तकनीक शोधकर्ताओं को माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम पर विभिन्न उपचारों के सटीक असर को देखने की अनुमति देती है, और नतीजतन, सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स पर।
इसके अतिरिक्त, यह विधि विशिष्ट संदर्भों में माइटोकॉन्ड्रियल व्यवहार और भूमिकाओं के बारे में कई अलग-अलग वैज्ञानिक प्रश्नों के लिए अत्यधिक अनुकूलन योग्य है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल विशेष रूप से सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स के साथ सौदों। हालांकि, कई अन्य सेल प्रकारों का उपयोग किया जा सकता है, और जिन उपचारों का परीक्षण किया जा सकता है, वे केवल जांच किए जा रहे प्रश्नों द्वारा सीमित हैं। इमेजिंग के इस प्रकार के सामूहिक ज्ञान और माइटोकॉन्ड्रियल व्यवहार की समझ अग्रिम करने की क्षमता है, अंतर्निहित तंत्र है कि माइटोकॉन्ड्रियल रोग के लिए नेतृत्व, और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में मौजूद सहज गतिशीलता पर कई विकृतियों के प्रभाव।

एस्ट्रोसाइट्स मस्तिष्क हो्योसाइटसिस के रखरखाव में महत्वपूर्ण खिलाड़ी हैं। वे शायद सबसे अच्छी तरह से मस्तिष्क में महत्वपूर्ण संरचनात्मक भूमिकाओं के लिए जाना जाता है, रक्त मस्तिष्क बाधा1 के भाग के रूप में और मस्तिष्क2भर में न्यूरॉन्स और synapses का समर्थन करके । न्यूरॉन्स का एस्ट्रोसाइट समर्थन संरचनात्मक 3 और मेटाबोलिक4 ,5दोनों है , जिसमें एस्ट्रोसाइट्स न्यूरोजेनेसिस और सिंप्टोजेनेसिस को बढ़ावा देते हैं, जबकि सक्रिय न्यूरॉन्स 4 ,6,7को लैक्टेट जैसे प्रमुख मेटाबोलाइट्स भी प्रदान करते हैं। संरचनात्मक समर्थन की भूमिका से परे, एस्ट्रोसाइट्स सक्रिय कोशिकाएं हैं जो सीए2 + सिग्नलिंग और बफरिंग (सहज माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + प्रवाह सहित)8,9,कश्मीर+ बफरिंग10में भाग लेती हैं, और चोट के समय मस्तिष्क की जरूरतों के अनुकूल और प्रतिक्रिया कर सकती हैं11,12 . इस तरह की गतिशील कोशिकाओं होने के नाते, एस्ट्रोसाइट्स में मजबूत ऊर्जा आवश्यकताएं होती हैं, जिनके लिए एक कुशल माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की आवश्यकता होती है। अत्यधिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस)13को बफर करने में भी इन माइटोकॉन्ड्रिया की महत्वपूर्ण भूमिका है । ऊर्जा उत्पादन और आरओएस बफरिंग की उनकी व्यक्तिगत या स्थानीय भूमिकाओं के अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया एक नेटवर्क14के रूप में कार्य करता है। इस अर्थ में, वे क्रमशः15,नए/कम माइटोकॉन्ड्रिया और पुराने/ऑक्सीकृत माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिनिधित्व करते हुए विखंडन और संलयन माइटोकॉन्ड्रिया के बीच संतुलन बनाए रखते हैं । एक सेल की समग्र रेडॉक्स स्थिति का अंदाजा माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की रेडॉक्स स्थिति से लगाया जा सकता है। पैथोलॉजी में, यह जानकारी का एक महत्वपूर्ण टुकड़ा है जो प्रकाश डाल सकता है जिस पर कोशिकाएं बेहतर ढंग से काम नहीं कर रही हैं।
हाल के वर्षों में, कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया की गतिशीलता और कार्यों का अध्ययन करने के लिए कई सेंसर विकसित किए गए हैं। उदाहरण के लिए, ऊर्जा विनिमय (एटीपी), रेडॉक्स स्टेट (NADH/NAD+,ROS), और एंजाइमेटिक कार्यक्षमता (सीएएएमपी, सीए2 +,जेडएन2 +)को मापने वाले सेंसर वर्तमान में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन16के अध्ययन में उपयोग किए जाते हैं। उनमें से, माइटोटाइमर माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान (आकार, आकार, सतह क्षेत्र), गतिशीलता (गति, विस्थापन), और गतिशीलता (संलयन और विखंडनीय घटनाओं), साथ ही समग्र माइटोकॉन्ड्रियल टर्नओवर दर और रेडॉक्स राज्य में परिवर्तनों का पालन करने की अनुमति देता है। मिटोटाइमर एक उत्परिवर्ती लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, drFP58317है, जिसमें मानव साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेस18, 19के उपइकैण आठवीं से एक माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नलहै, जो हरे (488 एनएम) में नए संश्लेषित माइटोकॉन्ड्रिया और लाल (555 एनएम) में ऑक्सीकृत माइटोकॉन्ड्रिया की कल्पना करने के लिए है। हरे (488 एनएम) और लाल (555 एनएम) फ्लोरेसेंस अनुपात का उपयोग करना व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया, उनके आकृति विज्ञान विश्लेषण, संलयन/विखंडन घटनाओं, और रेडॉक्स राज्य इतिहास20,21के एक साथ मूल्यांकन की अनुमति देता है। इस अनूठी संपत्ति का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया की शारीरिक और रोग भूमिकाओं के बारे में कई वैज्ञानिक सवालों की जांच करने के लिए किया जा सकता है और इसलिए कई अलग-अलग सेल प्रकारों के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता के अंतर्निहित तंत्र का अनावरण करने के लिए बहुत आशाजनक है।
हमने हाल ही में माइटोकॉन्ड्रिया के गतिशील और विशेष रूप से एस्ट्रोसाइट्स इन विट्रो और वीवो22 में कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक नया लेंटीवायरल वेक्टर (एलवी-जी1-मिटोटाइमर-MiR124T, इसके बाद एलवी-जी1-मिटोटाइमर कहाजाताहै) विकसित किया है। एलवी-जी 1-मिंटोटाइमर ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) प्रमोटर gfaABC1D के एक कटे हुए संस्करण का उपयोग करता है, जिसमें B3 एन्हांसर (gfaABC1D (B3) कहा जाता है, इसके बाद पहले वर्णित miR124T न्यूरोनल डिटरगेटिंग सिस्टम23के साथ संयुक्त है। यह एस्ट्रो में एस्ट्रोसाइट्स और वीवो22में माइटोकॉन्ड्रियल बायोसेंसर की अनन्य अभिव्यक्ति की अनुमति देताहै । यहां प्रस्तुत चूहे हिप्पोकैम्पस एस्ट्रोसाइट्स की संस्कृति का प्रदर्शन करने और उन्हें एलवी-जी1-मिटोटाइमर बायोसेंसर से लैस करने के लिए विभिन्न कदम हैं, साथ ही लगातार कई घंटों/दिनों के दौरान एस्ट्रोसाइट माइटोकॉन्ड्रिया के व्यवहार का पालन करने के लिए विभिन्न माइक्रोस्कोपी कदम हैं।

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		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>Plexus SANTE</td>
			<td>PL001213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Plexus SANTE</td>
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		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>Plexus SANTE</td>
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			<td></td>
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		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>LIFE TECH</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>HAMAMATSU</td>
			<td>ORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM)</td>
			<td>THERMOFISHER</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>THERMOFISHER</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16050122</td>
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		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>CFI Plan Fluor 100x Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Engines</td>
			<td>LUMENCOR</td>
			<td>SPECTRA X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear-encoded motorized platine</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module</td>
			<td>OKOLAB</td>
			<td>H201-NIKON-TI-S-ER</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x liquid</td>
			<td>THERMOFISHER</td>
			<td>20012068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mm</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Rats</td>
			<td>CHARLES RIVERS</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Nikon NIS-HC</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>NIS-Elements HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V8.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup 500 mL</td>
			<td>MERCK MILLIPORE</td>
			<td>10412701</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of mitochondrial system in cultured astrocytes

जबकि न्यूरोनल स्तर पर माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तनों पर बहुत ध्यान दिया गया है, हाल के सबूत दर्शाता है कि एस्ट्रोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता और कार्य अनुभूति में फंसाया जाता है। यह लेख एक माइटोकॉन्ड्रियल बायोसेंसर: मिटोटिमर से लैस एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों के समय-चूक इमेजिंग के लिए विधि का वर्णन करता है। माइटोटाइमर माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता, गतिशीलता, आकृति विज्ञान, बायोजेनेसिस और रेडॉक्स राज्य का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली और अनूठा उपकरण है। यहां, संस्कृति, छवि अधिग्रहण और बाद में माइटोकॉन्ड्रियल विश्लेषण के लिए विभिन्न प्रक्रियाएं प्रस्तुत की जाती हैं।

एलवी-जी1-मिटोटाइमर से संक्रमित एस्ट्रोसाइट्स की प्राथमिक संस्कृति ने विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का प्रदर्शन किया। उपचार से पहले, एलवी-जी1-मिटोटाइमर को व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट्स ने विषम माइटोकॉन्ड्रियल आकार और विभिन्न हरे/लाल फ्लोरेसेंस तीव्रता(चित्र 3, चित्र 4और वीडियो 1)को दिखाया। एलवी-जी1-मिटोटाइमर को व्यक्त करने वाली एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों की माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली की निगरानी एच2 0 2 (10माइक्रोन) के साथ इनक्यूबेशन से पहले और बाद में की गई थी। ऊपर वर्णित विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल सुविधाओं की गणना 12 घंटे (हर 3 घंटे) से अधिक की गई थी और उनकी प्रारंभिक स्थिति में सामान्यीकृत (सेल द्वारा सेल) किया गया था। रूपात्मक स्तर(चित्रा 3 बी)पर, एच2ओ2 का प्रभाव लगभग 6 घंटे पर दिखाई देना शुरू कर देता है। दरअसल, माइटोकॉन्ड्रिया खंडित थे (लंबाई, सतह क्षेत्र और विस्तार कारक की कमी)। यह विखंडन उपचार के बाद और भी स्पष्ट है 12 घंटे। ध्यान रहे कि व्यास, चौड़ाई और स्पिरसिटी को कम नहीं किया गया। एच 2 ओ 2 उपचार के बाद रेडॉक्स राज्य और कारोबार(चित्रा 3 सी),3एच के संबंध में, एस्ट्रोसाइट्स (माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस में तेजी से वृद्धि का परिणाम) में हरे रंग के माइटोकॉन्ड्रिया का अनुपात बढ़ गया। 6 घंटे में, हरे/लाल अनुपात बेसलाइन स्तर पर लौट आए, लेकिन विशुद्ध रूप से लाल माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या बेसल के स्तर से काफी बढ़ गई । 12 एच के बाद, एच2ओ2 के ऑक्सीडेटिव उपचार के परिणाम दिखाई दे रहे थे और इसके परिणामस्वरूप लाल विराम के अनुपात और संख्या में पर्याप्त वृद्धि हुई। उपचार के बाद गतिशीलता और गतिशीलता(चित्रा 3 डी),3 एच के संबंध में, सभी मानदंडों में क्षणिक वृद्धि हुई । लंबी अवधि (12 एच) में, माइटोकॉन्ड्रिया अधिक धीरे-धीरे और कम दूरी पर चला गया।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig01.jpg"> चित्रा 1:एलवी-जी1-माइटोटाइमर बायोसेंसर व्यक्त करने वाली एस्ट्रोसाइट संस्कृति। (ए)एलवी-जी1-मिटोटिमर को व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट्स की कॉन्फोकल तस्वीरें । (ख)विखंडन के विभिन्न स्तरों के साथ कम (हरे) संतुलित (नारंगी) और ऑक्सीकृत (लाल) माइटोकॉन्ड्रिया की कॉन्फोकल तस्वीरों का चयन। (ग)एलवी-जी1-माइटोटाइमर को व्यक्त करते हुए एस्ट्रोसाइट में विश्लेषण के लिए उपलब्ध विभिन्न मानदंडों का सारांश आरेख । स्केल बार: (A)ऊपरी पैनल: 50 माइक्रोन, लोअर पैनल: 10 माइक्रोन,(B)1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig02.jpg"> चित्रा 2:माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और अनुपात विश्लेषण। (A)GA3 स्क्रिप्ट का अवलोकन व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और अनुपात के विश्लेषण के लिए । (ख)एलवी-जी1-माइटोटाइमर को व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट की प्रारंभिक तस्वीरों का GA3 स्क्रिप्ट के साथ विश्लेषण किया गया । (ग)एस्ट्रोसाइट्स की माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम के लिए उत्पन्न बाइनरी मास्क का उदाहरण। स्केल बार: 10 माइक्रोन (बी-सी)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig03.jpg"> चित्रा 3:एस्ट्रोसाइट्स की माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली पर एच2ओ2 का प्रभाव। (A)एस्ट्रोसाइट्स की तस्वीरें एलवी-जी1-मिंटोटाइमर 1 घंटे पहले और 6 घंटे, पीबीएस (सीटीआरएल) के साथ उपचार के बाद 24 घंटे और एच2ओ2के 10 माइक्रोनएम व्यक्त करती हैं । (ख)माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी के रडार चार्ट,(सी)रेडॉक्स स्टेट एंड टर्नओवर, और(डी)गतिशीलता मानदंडों का मूल्यांकन बेसलाइन के दौरान एस्ट्रोसाइट्स पर किया गया और एच 2 ओ 2 उपचार के बाद 3 एच, 6 एच और12घंटे । एसए: सतह क्षेत्र; डी: व्यास; एल: लंबाई; डब्ल्यू: चौड़ाई; आर: गोलाई; एस: स्पिरसिटी; EF: विस्तार कारक (=L/W); G/R: व्यक्तिगत लाल/हरे अनुपात; Gpuncta: हरे समय तक माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिशत; Rpuncta: लाल puncta माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिशत; जिला: विस्थापन; टीआर: ट्रैक की लंबाई; एसपी और एसपीवी: गति और गति विचरण; एसटीआर: सीधापन। स्केल बार: 20 माइक्रोन (ए) और 2.5 माइक्रोन (इनसेट)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig04.jpg"> चित्रा 4:एलवी-जी1-मिंटोटिमर व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट्स की तस्वीरें और बेसलाइन के दौरान एक सजातीय और संतुलित माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क दिखा रही हैं। स्केल बार: 20 माइक्रोन <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
वीडियो 1: सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स की माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली पर एच2 ओ2 उपचार का प्रभाव। एच 2 ओ2उपचार (बेसलाइन) से पहले एस्ट्रोसाइटिक माइटोकॉन्ड्रिया, साथ ही गैर-उपचारित नियंत्रण कोशिका की तुलना में एच2ओ 2 उपचार के बाद 6 एच और 24 घंटे। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/movie.mp4" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>आकृति विज्ञान मानदंड</td>
			<td>श्रेणी</td>
			<td colspan="3">टिप्पणियां</td>
		</tr>
<tr>
<td>सतह क्षेत्र (एसए)</td>
			<td>0.5-4 माइक्रोन2
</td>
			<td colspan="3" rowspan="7">ये मानदंड माइटोकॉन्ड्रिया की खंडित-लम्बी विशेषताओं पर सूचित करते हैं। वे आम तौर पर एक ही दिशा में विकसित होते हैं। खंडित माइटोकॉन्ड्रिया में सतह क्षेत्र, व्यास, लंबाई और विस्तार कारक में कमी आएगी, जबकि गोलाई, स्पिरसिटी और चौड़ाई अपरिवर्तित या बढ़ सकती है।</td>
		</tr>
<tr>
<td>व्यास (डी)</td>
			<td>0.5-1.5 माइक्रोन</td>
		</tr>
<tr>
<td>लंबाई (एल)</td>
			<td>0.5-5 माइक्रोन</td>
		</tr>
<tr>
<td>चौड़ाई (डब्ल्यू)</td>
			<td>0.5-2 माइक्रोन</td>
		</tr>
<tr>
<td>गोलाई (नि.)</td>
			<td>0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>स्पाइरिसिटी (एस)</td>
			<td>0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>विस्तार कारक (EF = L/W)</td>
			<td>1–10</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के लिए चयनित मापदंडों का सारांश।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>रेडॉक्स राज्य मानदंड</td>
			<td>श्रेणी</td>
			<td colspan="3">टिप्पणियां</td>
		</tr>
<tr>
<td>व्यक्तिगत अनुपात (जी/आर)</td>
			<td>0–10</td>
			<td colspan="3" rowspan="3">अनुपात रेडॉक्स राज्य के परिणाम को इंगित करता है। यह कोशिका में माइटोकॉन्ड्रिया की सामान्य स्थिति और उम्र के बारे में सूचित करता है। यह विचार करना आवश्यक है कि यह अनुपात बायोजेनेसिस और माइटोकॉन्ड्रिया के क्षरण और कम माइटोकॉन्ड्रिया के साथ ऑक्सीडाइज्ड माइटोकॉन्ड्रिया का विखंडन/संलयन है । इसलिए हरे और लाल समय का समय की संख्या का मूल्यांकन शक्तिशाली परिणामों की व्याख्या करने में मदद कर सकता है।  हरे रंग की विराम्ता माइटोकॉन्ड्रिया निर्धारित किया जाता है जब हरे रंग की तीव्रता लाल रंग की 10 गुना होती है। लाल विराम माइटोकॉन्ड्रिया तब निर्धारित होता है जब लाल रंग की तीव्रता हरे रंग की तुलना में 10 गुना अधिक होती है। एस्ट्रोसाइट की रेडॉक्स स्थिति उस कोशिका के सभी माइटोकॉन्ड्रिया अनुपात का औसत है।</td>
		</tr>
<tr>
<td>हरे रंग के समय्टा माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिशत (जीपंचा)</td>
			<td>0%–100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>लाल समय पर माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिशत (आरपंक्चरा)</td>
			<td>0%–100%</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 2: माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स राज्य के लिए चयनित मापदंडों का सारांश।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>गतिशीलता मानदंड</td>
			<td>श्रेणी</td>
			<td colspan="3">टिप्पणियां</td>
		</tr>
<tr>
<td>विस्थापन (डिस)</td>
			<td>0-10 माइक्रोन</td>
			<td colspan="3" rowspan="5">साथ में इन सुविधाओं नेटवर्क की सामान्य गतिशीलता गतिशीलता को सूचित करते हैं। स्थिर माइटोकॉन्ड्रिया कम गति के साथ कम विस्थापन और ट्रैक लंबाई प्रदर्शित करता है। दूसरी ओर, दोलनीय कणों को ट्रैक की लंबाई और विस्थापन (जिसके परिणामस्वरूप कम सीधापन) और स्थिर की तुलना में बढ़ी हुई गति के बीच अंतर के साथ विभेदित किया जा सकता है।</td>
		</tr>
<tr>
<td>ट्रैक लंबाई (टीआर)</td>
			<td>0-10 माइक्रोन</td>
		</tr>
<tr>
<td>गति और गति भिन्नता (एसपी और एसपीवी)</td>
			<td>0-1.5 माइक्रोन/एस ± 0.2 μm/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>सहीपन</td>
			<td rowspan="2">0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>(एसटीआर = विस्थापन/ट्रैक लंबाई)</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 3: माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता के लिए चयनित मापदंडों का सारांश।
पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए GA3 स्क्रिप्ट फ़ाइल। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/Mito_Morpho.ga3" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes

यह लेख मिटोटिमर बायोसेंसर से लैस एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों के माइटोकॉन्ड्रियल समय-चूक इमेजिंग और माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता, गतिशीलता, आकृति विज्ञान, बायोजेनेसिस, रेडॉक्स राज्य और टर्नओवर के परिणामस्वरूप मल्टीपैरामेट्रिक विश्लेषण के लिए विधि का वर्णन करता है।

सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम की लाइव इमेजिंग

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and ...

यह प्रोटोकॉल लंबी अधिग्रहण अवधि में व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए एक विधि के रूप में माइक्रोस्कोपी की शक्ति को अधिकतम करता है। कोशिकाओं के एक निश्चित समूह पर समय-चूक के विपरीत, या एक समय में एक कोशिका पर, कोशिकाओं के बीच विषमता के लिए प्रत्येक कोशिका नियंत्रण में प्रत्येक मापा मापदंड के लिए एक आधार रेखा को सामान्यीकरण । स्वचालित मंच और वायरल वेक्टर अनुकूलित से लैस एक माइक्रोस्कोप के साथ, हम हर प्रकार की कोशिकाओं के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं।बहु-वेल व्यंजनों में प्रति वर्ग सेंटीमीटर 20, 000 से 25, 000 कोशिकाओं को चढ़ाना शुरू करें और उन्हें बाकी प्रयोग के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड वाले वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। विट्रो में आठ दिनों में, फॉस्फेट बफर खारा में पतला माइटोकॉन्ड्रियल बायोसेंसर मिटोटिमर मिटोटिमर के लिए लेंटीवायरल वेक्टर कोडिंग के प्रति सेल पी 24 एंटीजन के 0.6 पिको ग्राम जोड़ें। विट्रो में 11 दिनों में, पूर्व-गर्म बाँझ पीबीएस के साथ दो वॉश करें और फिनोल लाल के बिना ताजा एस्ट्रोसाइट माध्यम जोड़ें।एलवी-जी1 मिटोटिमर के साथ लेंटीवायरल संक्रमण के कम से कम तीन से पांच दिन बाद एस्ट्रोसाइटिक माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम का आकलन करें। 40 गुना आवर्धन का उपयोग करके एलवी-जी1 मिटोटाइमर के पर्याप्त स्तर को व्यक्त करने वाले माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के साथ प्रति अच्छी तरह से पांच एस्ट्रोसाइट्स का चयन करें। एस्ट्रोसाइट्स फ्लैट और संभव के रूप में बड़े और कोशिकाओं के समूहों में स्थित नहीं का चयन करने के लिए ध्यान रखना।फिर हरे चैनल के लिए 490 नैनोमीटर पर अनुक्रमिक उत्तेजन और हरे और लाल फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ लाल चैनल के लिए 550 नैनोमीटर का उपयोग करके फ्लोरेसेंस छवियों को कैप्चर करें और प्रत्येक समन्वय के लिए 150 बार की आवर्धन का उपयोग करें। एनडी प्रोसेसिंग और सेलेक्ट फ्रेम पर क्लिक करके प्रत्येक इमेज सीक्वेंस के लिए रेड और ग्रीन चैनल्स के लिए पहला फ्रेम चुनें। फिर रूपांतरण ों का चयन करके लाल और हरे चैनलों को मर्ज करें और चैनल मर्ज करें।इमेज शेडिंग को सही करने के लिए, प्री-प्रोसेसिंग का चयन करें, और फिर ऑटो छायांकन सुधार करें। प्री-प्रोसेसिंग और रोलिंग बॉल का चयन करके रोलिंग बॉल एल्गोरिदम लागू करें। प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियन के लिए बाइनरी मास्क उत्पन्न करने के लिए, विभाजन और सीमा का चयन करें।बाइनरी प्रोसेसिंग और टचिंग बॉर्डर का चयन करके सीमा से काटी गई किसी भी वस्तु को हटा दें। माप का चयन करें, और फिर वस्तु क्षेत्र, EEQ व्यास, लंबाई, चौड़ाई, खुरदरापन, गोलाकारता, या क्रमशः सतह क्षेत्र, व्यास, लंबाई, चौड़ाई, खुरदरापन, गोलाकारता, या विस्तार को मापने के लिए। इन मापों के साथ एक समूह की रचना करें और इसे MOFO डेटा के रूप में बदलें।फिर माप का चयन करें, और फिर मतलब हरे और लाल तीव्रता को मापने के लिए मतलब तीव्रता का चयन करें। और हरे अनुपात से लाल को मापने के लिए अनुपात। अब इन मापों के साथ संगीतकार समूह और अनुपात डेटा के रूप में इसका नाम बदलें।अंत में सीएसवी को संदर्भ और तालिका का चयन करके सीएसवी फ़ाइल को टेबल निर्यात करें, और फिर एनआईएस में ट्रैकिंग मॉड्यूल खोलकर और दृश्य, विश्लेषण और ट्रैकिंग का चयन करके सेव आसॅ्डे का चयन करके विश्लेषण की GA 3 स्क्रिप्ट को बचाएं। नए आरओआई को परिभाषित करने पर क्लिक करें। स्वचालित डिटेक्शन टूल के साथ, इमेज सीक्वेंस की पहली छवि पर 25 से 50 माइटोकॉन्ड्रिया का चयन करें, और फिर ट्रैक ऑटो पर क्लिक करें आरओआई विश्लेषण का पता लगाया।यदि आवश्यक हो, तो गलत आरओआई ट्रैक को हटा दें और टेबल को सीएसवी फ़ाइल में निर्यात करें। मैन्युअल रूप से लॉग प्रोसेसिंग से पहले माप को बदलना। प्रत्येक विश्लेषण और समय सीमा के लिए संदर्भ अधिग्रहण में प्राप्त मतलब द्वारा परिणामी डेटा को मैन्युअल रूप से सामान्य करें।फिर एक नोवा मिलान दो तरह का उपयोग कर सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं। एलवी-जी1 मिटोटाइमर से संक्रमित एस्ट्रोसाइट्स की प्राथमिक संस्कृति ने विखंडन के विभिन्न स्तरों के साथ कम संतुलित और ऑक्सीकृत माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का प्रदर्शन किया। हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार से पहले, एलवी-जी1 मिटोटाइमर को व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट्स ने विभिन्न हरे और लाल फ्लोरेसेंस तीव्रता में विषम माइटोकॉन्ड्रियल आकार दिखाया।एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों की माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ इनक्यूबेशन के छह घंटे बाद खंडित हो गई थी। यह और भी स्पष्ट था 12 घंटे के बाद से sphericity कमी के साथ उनके व्यास के बिना उपचार के बाद । रेडॉक्स राज्य और कारोबार के संबंध में, हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार के तीन घंटे बाद, एस्ट्रोसाइट्स में हरे माइटोकॉन्ड्रिया का अनुपात बढ़ गया।उपचार के तीन घंटे बाद गतिशीलता और गतिशीलता के संबंध में। सभी मानदंडों को क्षणिक रूप से बढ़ाया गया था । यह तकनीक कई अलग-अलग सवालों के लिए उपयुक्त है।उदाहरण के लिए, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के संदर्भ में, हम मस्तिष्क में स्रावित विभिन्न अणुओं की एस्ट्रोसाइटिक विषाक्तता की जांच कर रहे हैं।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग के संवर्धित न्यूरॉन्स में एंडोसोम और लियोसोम की क्षमताओं का मात्रा

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