यह प्रोटोकॉल लंबी अधिग्रहण अवधि में व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए एक विधि के रूप में माइक्रोस्कोपी की शक्ति को अधिकतम करता है। कोशिकाओं के एक निश्चित समूह पर समय-चूक के विपरीत, या एक समय में एक कोशिका पर, कोशिकाओं के बीच विषमता के लिए प्रत्येक कोशिका नियंत्रण में प्रत्येक मापा मापदंड के लिए एक आधार रेखा को सामान्यीकरण । स्वचालित मंच और वायरल वेक्टर अनुकूलित से लैस एक माइक्रोस्कोप के साथ, हम हर प्रकार की कोशिकाओं के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं।
बहु-वेल व्यंजनों में प्रति वर्ग सेंटीमीटर 20, 000 से 25, 000 कोशिकाओं को चढ़ाना शुरू करें और उन्हें बाकी प्रयोग के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड वाले वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। विट्रो में आठ दिनों में, फॉस्फेट बफर खारा में पतला माइटोकॉन्ड्रियल बायोसेंसर मिटोटिमर मिटोटिमर के लिए लेंटीवायरल वेक्टर कोडिंग के प्रति सेल पी 24 एंटीजन के 0.6 पिको ग्राम जोड़ें। विट्रो में 11 दिनों में, पूर्व-गर्म बाँझ पीबीएस के साथ दो वॉश करें और फिनोल लाल के बिना ताजा एस्ट्रोसाइट माध्यम जोड़ें।
एलवी-जी1 मिटोटिमर के साथ लेंटीवायरल संक्रमण के कम से कम तीन से पांच दिन बाद एस्ट्रोसाइटिक माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम का आकलन करें। 40 गुना आवर्धन का उपयोग करके एलवी-जी1 मिटोटाइमर के पर्याप्त स्तर को व्यक्त करने वाले माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के साथ प्रति अच्छी तरह से पांच एस्ट्रोसाइट्स का चयन करें। एस्ट्रोसाइट्स फ्लैट और संभव के रूप में बड़े और कोशिकाओं के समूहों में स्थित नहीं का चयन करने के लिए ध्यान रखना।
फिर हरे चैनल के लिए 490 नैनोमीटर पर अनुक्रमिक उत्तेजन और हरे और लाल फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ लाल चैनल के लिए 550 नैनोमीटर का उपयोग करके फ्लोरेसेंस छवियों को कैप्चर करें और प्रत्येक समन्वय के लिए 150 बार की आवर्धन का उपयोग करें। एनडी प्रोसेसिंग और सेलेक्ट फ्रेम पर क्लिक करके प्रत्येक इमेज सीक्वेंस के लिए रेड और ग्रीन चैनल्स के लिए पहला फ्रेम चुनें। फिर रूपांतरण ों का चयन करके लाल और हरे चैनलों को मर्ज करें और चैनल मर्ज करें।
इमेज शेडिंग को सही करने के लिए, प्री-प्रोसेसिंग का चयन करें, और फिर ऑटो छायांकन सुधार करें। प्री-प्रोसेसिंग और रोलिंग बॉल का चयन करके रोलिंग बॉल एल्गोरिदम लागू करें। प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियन के लिए बाइनरी मास्क उत्पन्न करने के लिए, विभाजन और सीमा का चयन करें।
बाइनरी प्रोसेसिंग और टचिंग बॉर्डर का चयन करके सीमा से काटी गई किसी भी वस्तु को हटा दें। माप का चयन करें, और फिर वस्तु क्षेत्र, EEQ व्यास, लंबाई, चौड़ाई, खुरदरापन, गोलाकारता, या क्रमशः सतह क्षेत्र, व्यास, लंबाई, चौड़ाई, खुरदरापन, गोलाकारता, या विस्तार को मापने के लिए। इन मापों के साथ एक समूह की रचना करें और इसे MOFO डेटा के रूप में बदलें।
फिर माप का चयन करें, और फिर मतलब हरे और लाल तीव्रता को मापने के लिए मतलब तीव्रता का चयन करें। और हरे अनुपात से लाल को मापने के लिए अनुपात। अब इन मापों के साथ संगीतकार समूह और अनुपात डेटा के रूप में इसका नाम बदलें।
अंत में सीएसवी को संदर्भ और तालिका का चयन करके सीएसवी फ़ाइल को टेबल निर्यात करें, और फिर एनआईएस में ट्रैकिंग मॉड्यूल खोलकर और दृश्य, विश्लेषण और ट्रैकिंग का चयन करके सेव आसॅ्डे का चयन करके विश्लेषण की GA 3 स्क्रिप्ट को बचाएं। नए आरओआई को परिभाषित करने पर क्लिक करें। स्वचालित डिटेक्शन टूल के साथ, इमेज सीक्वेंस की पहली छवि पर 25 से 50 माइटोकॉन्ड्रिया का चयन करें, और फिर ट्रैक ऑटो पर क्लिक करें आरओआई विश्लेषण का पता लगाया।
यदि आवश्यक हो, तो गलत आरओआई ट्रैक को हटा दें और टेबल को सीएसवी फ़ाइल में निर्यात करें। मैन्युअल रूप से लॉग प्रोसेसिंग से पहले माप को बदलना। प्रत्येक विश्लेषण और समय सीमा के लिए संदर्भ अधिग्रहण में प्राप्त मतलब द्वारा परिणामी डेटा को मैन्युअल रूप से सामान्य करें।
फिर एक नोवा मिलान दो तरह का उपयोग कर सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं। एलवी-जी1 मिटोटाइमर से संक्रमित एस्ट्रोसाइट्स की प्राथमिक संस्कृति ने विखंडन के विभिन्न स्तरों के साथ कम संतुलित और ऑक्सीकृत माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का प्रदर्शन किया। हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार से पहले, एलवी-जी1 मिटोटाइमर को व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट्स ने विभिन्न हरे और लाल फ्लोरेसेंस तीव्रता में विषम माइटोकॉन्ड्रियल आकार दिखाया।
एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों की माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ इनक्यूबेशन के छह घंटे बाद खंडित हो गई थी। यह और भी स्पष्ट था 12 घंटे के बाद से sphericity कमी के साथ उनके व्यास के बिना उपचार के बाद । रेडॉक्स राज्य और कारोबार के संबंध में, हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार के तीन घंटे बाद, एस्ट्रोसाइट्स में हरे माइटोकॉन्ड्रिया का अनुपात बढ़ गया।
उपचार के तीन घंटे बाद गतिशीलता और गतिशीलता के संबंध में। सभी मानदंडों को क्षणिक रूप से बढ़ाया गया था । यह तकनीक कई अलग-अलग सवालों के लिए उपयुक्त है।
उदाहरण के लिए, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के संदर्भ में, हम मस्तिष्क में स्रावित विभिन्न अणुओं की एस्ट्रोसाइटिक विषाक्तता की जांच कर रहे हैं।
