Questo protocollo massimizza notevolmente la potenza della microscopia come metodo per tracciare le dinamiche mitocondriali all'interno delle singole cellule per lunghi periodi di acquisizione. A differenza del time-lapse su un gruppo fisso di cellule, o su una cellula alla volta, la normalizzazione a una linea di base per ogni criterio misurato in ogni cella controlla l'eterogeneità tra le cellule. Con un microscopio dotato di piattaforma automatizzata e vettore virale adattato, possiamo utilizzare questo protocollo per ogni tipo di cellule.
Inizia placcando da 20.000 a 25.000 cellule per centimetro quadrato in piatti multi-pozzo e conservale a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica per il resto dell'esperimento. A otto giorni in vitro, aggiungere 0,6 picogrammi di antigene P24 per cellula di vettore lentivirale che codifica per il biosensore mitocondriale MitoTimer diluito in soluzione salina tamponata con fosfato. A 11 giorni in vitro, eseguire due lavaggi con PBS sterile preriscaldato e aggiungere un mezzo astrocitario fresco senza rosso fenolo.
Valutare il sistema mitocondriale astrocitico almeno tre-cinque giorni dopo le infezioni lentivirali con LV-G1 MitoTimer. Selezionare cinque astrociti per pozzo con una rete mitocondriale che esprima livelli sufficienti di mitotimero LV-G1 utilizzando un ingrandimento di 40 volte. Avendo cura di selezionare astrociti piatti e grandi il più possibile e non situati in gruppi di cellule.
Quindi cattura immagini a fluorescenza usando l'eccitazione sequenziale a 490 nanometri per il canale verde e 550 nanometri per il canale rosso con segnali fluorescenti verdi e rossi e utilizzando un ingrandimento di 150 volte per ogni coordinata. Selezionate il primo fotogramma per i canali rosso e verde per ogni sequenza di immagini facendo clic su Elaborazione ND e selezionate cornice. Quindi unisci i canali rosso e verde selezionando le conversioni e unisci il canale.
Per correggere l'ombreggiatura dell'immagine, selezionate Pre-elaborazione e quindi Correzione automatica dell'ombreggiatura. Applicare l'algoritmo rolling ball selezionando la pre-elaborazione e la palla di rotolamento. Per generare maschere binarie per ogni mitocondrio, selezionare segmentazione e soglia.
Rimuovere tutti gli oggetti troncati dal bordo selezionando l'elaborazione binaria e toccando il bordo. Selezionare la misurazione, quindi l'area oggetto, il diametro EEQ, la lunghezza, la larghezza, la rugosità, la circolarità o l'allungamento per misurare rispettivamente l'area della superficie, il diametro, la lunghezza, la larghezza, la rugosità, la circolarità o l'allungamento. Comporre un gruppo con queste misurazioni e rinominarlo come dati MOFO.
Quindi selezionare la misurazione, quindi selezionare l'intensità media per misurare le intensità medie verde e rosso. E rapporto per misurare il rapporto rosso per verde. Ora il compositore raggruppa queste misurazioni e lo rinomina come dati di rapporto.
Infine esporta la tabella in un file CSV selezionando riferimento e tabella in CSV, quindi salva lo script di analisi GA 3 selezionando Salva con nome.Inizia aprendo il modulo di tracciamento in NIS e selezionando vista, analisi e tracciamento. Clicca su definisci nuovo ROI. Con lo strumento di rilevamento automatico, selezionare da 25 a 50 mitocondri nella prima immagine della sequenza di immagini, quindi fare clic su traccia analisi ROI rilevati automaticamente.
Se necessario, eliminare le tracce ROI errate ed esportare la tabella in un file CSV. Registrare manualmente trasformare le misurazioni prima dell'elaborazione. Per ogni analisi e timeframe normalizzare manualmente i dati risultanti con la media ottenuta nell'acquisizione di riferimento.
Quindi eseguire analisi statistiche utilizzando un bidirezionale abbinato a un Nova. La coltura primaria di astrociti infettati da LV-G1 MitoTimer ha mostrato reti mitocondriali bilanciate e ossidate ridotte con diversi livelli di frammentazione. Prima del trattamento con perossido di idrogeno, gli astrociti che esprimono LV-G1 MitoTimer hanno mostrato dimensioni mitocondriali eterogenee in varie intensità di fluorescenza verde e rossa.
La morfologia mitocondriale delle colture di astrociti è stata frammentata dopo sei ore di incubazione con perossido di idrogeno. Era ancora più evidente 12 ore dopo il trattamento senza i loro diametri con conseguente riduzione della sfericità. Per quanto riguarda lo stato redox e il turnover, tre ore dopo un trattamento con perossido di idrogeno, la proporzione di mitocondri verdi è aumentata negli astrociti.
Per quanto riguarda la dinamica e la mobilità tre ore dopo il trattamento. Tutti i criteri sono stati aumentati transitoriamente. Questa tecnica è adatta a molte domande diverse.
Ad esempio, nel contesto della malattia neurodegenerativa, stiamo studiando la tossicità estrocitica di diverse molecole secrete nel cervello.
