Name: live-imaging of mitochondrial system in cultured astrocytes
Uploaded: 2021-11-16T13:00:00
Duration: 6 min 20 s
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この研究は、K.R.とローザンヌ大学病院(CHUV)に授与されたシナプシス財団のフェローシップによって支えられました。著者らはニコンの助け、特にJ.ガネヴァトに感謝している。

本議定書は、倫理委員会(合意VD3602、ローザンヌ、スイス)の承認を得て実施されており、動物の使用に関するヨーロッパのガイドラインに従っています。
1. ラット海馬アストロサイト一次文化
<ol><li>出生後1-2日目に切断して5匹のネズミの子犬(ウィスターIGSラット)を犠牲にする。</li>
	<li>脳を取り除き、新鮮なアストロサイト培地の5 mLを含むペトリ皿に保管してください(1%ペニシリン/ストレプトマイシンと10%新鮮な馬の血清を補充したグルタマックスとDMEM)。</li>
	<li>海馬を分離します。21G針を通る3つの通路と25G針を通る3つの通路によって星状媒体の5 mLで解化する。</li>
	<li>解体細胞を15 mL遠心分離管に移し、ヘミック計で数えます。</li>
	<li>プレート20,000-25,000セル/cm2マルチウェル皿(9.4 mm x 10.7 mm x 9.3 mm)を37°Cで保存し、残りの実験では5%CO2を含む雰囲気の下で保管します。</li>
	<li>インビトロ(DIV3)で3日で完全に培地を交換してください。</li>
	<li>DIV8では、リン酸緩衝生理食塩水(PBS + 0.01%BSA)で希釈したミトコンドリアバイオセンサーミトタイマー(LV-G1-MitoTimer22)のレンチウイルスベクターコードの細胞当たりのp24抗原0.6pgを加える。</li>
	<li>DIV9では、あらかじめ温めた1x滅菌PBS(37°C)で洗浄し、新鮮なアストロサイト培地を加えます。</li>
	<li>DIV11では、あらかじめ温めた1x滅菌PBS(37°C)で2回のスケを行い、フェノールレッドを使わずに新鮮なアストロサイト培地を加えます。 注:コーティングの選択は、意図したアッセイに依存します。アストロサイト一次培養の標準コーティングとして、0.2 mg/mLポリD-リジンまたは8.7 μg/cm2の基部膜マトリックス(例えば、マトリゲル)を使用することが推奨されます。アストロサイトのミトコンドリア系を可視化するには、平坦化・伸伸細胞に取り組む必要があります。この文脈において、IBIDI u-slides上の基膜マトリックスの組み合わせが最も適している。また、光への繰り返し暴露の下で細胞に有毒であるフェノールレッドで動作しないことも重要です。</li>
</ol>ミトコンドリア系の長期モニタリング
<ol><li>LV-G1-MitoTimerによるレンチウイルス感染の後、最低3〜5日後に星状ミトコンドリア系を評価する(ミトコンドリアで十分な蛍光レベルを可能にするため)。</li>
	<li>取得および解析ソフトウェアによって制御される反転顕微鏡と、取得の完全な自動化のためのモジュールを使用して細胞を画像化します。 注: このスタディで使用するソフトウェアとモジュールの詳細については、 資料表 を参照してください。</li>
	<li>実験中に5%CO2および37°Cでアストロサイト培養を維持するために、顕微鏡にケージインキュベーター(材料表を参照)が装備されていることを確認してください。</li>
	<li>緑色(緑チャネルの場合は500-540 nm)と赤色(赤色チャネルの場合は550-600 nm)の蛍光信号を検出して、490 nm(緑チャネル用)と550nm(赤色チャネル用)の順次励起を使用して蛍光画像をキャプチャします。</li>
	<li>40倍の倍率を使用して十分なレベルのLV-G1-MitoTimerを表現するミトコンドリアネットワークを用いて、1井戸あたり5つのアストロサイトを選択します。アストロサイトは、できるだけ平らで大きく、細胞のクラスターに配置されていない(個々の細胞に働くために)選択するように注意してください。</li>
	<li>選択した 5 つのセルの座標を xlm ファイル (map.xlm) に保存します。この map.xlm を使用すると、ユーザーは時間の経過と同時に同じセルに戻ることができます。</li>
	<li>各座標の150x(100x油浸出目的、1.5倍の中間倍率)の倍率を使用して、画像シーケンス(60sの1画像/s)を取得します。</li>
	<li>同じアストロサイトに対して6時間、12時間、24時間の画像取得(60sの1画像/s)を繰り返します。 メモ:高速かつ効率的なオートフォーカスシステムを搭載した顕微鏡を使用してください。このコンテキストでは、パーフェクトフォーカスシステム(PFS)と呼ばれるハードウェアソリューションが使用されました。PFSは、近赤外870nm LEDおよびCCDラインセンサーを使用して、長期のイメージング調査中にリアルタイムで軸方向の焦点変動に対処します。</li>
</ol>3. 個々のミトコンドリア形態とLV-G1-ミトタイマー比の解析
注:ニコンのNIS一般解析3(GA3)は、本研究で形態測定解析を自動化するために使用されました。
<ol><li>各画像シーケンス(ベースライン、6 h、12 h、24 h)について 、ND処理>選択フレームをクリックして、赤と緑のチャンネルの最初のフレームを選択します。</li>
	<li>[チャンネルの結合] を選択して赤チャンネルと緑 チャンネル>マージします。</li>
	<li>イメージのシェーディングを修正するには、[ 自動シェーディング修正>前処理] を選択します。</li>
	<li>[ロール ボールの前処理] を選択して 、ローリング ボール アルゴリズム>適用します。</li>
	<li>ミトコンドリアごとにバイナリマスクを生成するには、[ セグメンテーション>閾値] を選択します。</li>
	<li>[境界線に触れるバイナリ処理]を選択して、境界線で切り詰められたオブジェクト>削除します。</li>
	<li>サーフェス領域を測定するには、[ オブジェクト領域>測定] を選択します。</li>
	<li>直径を測定するには 、[Eq直径>測定] を選択します。</li>
	<li>長さを測定するには、[ 長さ>を測定] を選択します。</li>
	<li>幅を測定するには、[ 幅]>を選択します。</li>
	<li>粗さを測定するには、[ 粗さ>測定] を選択します。</li>
	<li>循環を測定するには、[ 円形>測定] を選択します。</li>
	<li>伸長を測定するには、[ 伸び>測定] を選択します。</li>
	<li>上記の測定でグループを作成(右クリック)し、MorphoDataという名前に変更します。</li>
	<li>[平均強度] を選択して 、平均値>緑の強度を測定します。</li>
	<li>[平均強度] を選択して 、平均赤の強度>測定します。</li>
	<li>赤/緑比を測定するには、[ 測定>比率] を選択します。</li>
	<li>上記の測定でグループを作成(右クリック)し、比率データとして名前を変更します。</li>
	<li>[CSV への参照>表] を選択して 、テーブルを CSVファイルにエクスポートします。</li>
	<li>[名前を付けて保存] を選択して分析の GA3 スクリプト を保存します。 注 : この手順で使用する基準の完全な一覧は、図1、表 1、および表 2に要約されています。分析 GA3 スクリプト ファイルは補足的に使用できます (補足コーディング ファイル 1および図 2)。使用される閾値は、できるだけ多くのミトコンドリアを個別化するように適応した(可能な場合は大きなミトコンドリアネットワークを除く)。可能な限り、ミトコンドリアネットワークは手動で個別化されるか、分析から除外されます。細胞間変動のため、1つの条件(細胞ごとに50ミトコンドリア以上)の少なくとも20〜25個の細胞に対してこれらの分析を行います。</li>
</ol>4. ミトコンドリア運動の分析
注: ミトコンドリアの動きが複雑であるため、手動運動性解析が推奨されます。ここでは、ニコンのNIS要素システムを使用して、ミトコンドリアを手動で追跡しました。
<ol><li>NIS で追跡モジュールを開き、[ >分析>追跡の表示] を選択します。</li>
	<li>[ 新しい ROIの定義] をクリックします。</li>
	<li>自動検出ツールを使用して、画像シーケンスの最初の画像で25-50ミトコンドリアを選択します。</li>
	<li>[ 自動検出された ROI 分析の追跡] をクリックします。</li>
	<li>必要に応じて、不適切な ROI トラックを削除します。</li>
	<li>テーブルを CSV ファイルにエクスポートします。 注: この手順で使用される基準の完全なリストは、 図 1 と表 3に要約されています。追跡解析は、一般に、すべての追跡対象オブジェクトの中心の動きを示すパスを示します。トラッキング オプションで、さまざまなトラッキング オプションを設定する必要があります。追跡を容易にするために互いに十分に離れている孤立したミトコンドリアの選択を支持する。シーケンス全体で一貫して追跡できるオブジェクトのみを保持します。同じ方法で、不良な品質の追跡による外れ値を削除します。したがって、このセクションで分析されるオブジェクトのセットは、静的形態学的解析のために分析されたものとは異なり、一般的には小さくなります。</li>
</ol>5. データ変換、正規化、統計解析
注: 主にミトコンドリアのヘテロジニア度が高いため、生成されるデータは非正規分布を持つことがよくあります。
<ol><li>手動で、処理前に測定をログ変換します。</li>
	<li>各分析および時間枠について、得られたデータを参照取得で得られた平均で手動で正規化する。</li>
	<li>また、例えば、治療の効果を評価するために、制御条件に対する2回目の二重正規化を検討する。</li>
	<li>次に、双方向一致型の分散分析を使用して統計解析を実行します。ここでグラフパッドプリズムV8が使用されました。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+An+overview:+Structure,+regulation,+and+clinical+implications.">The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications.</a> Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).</li><li>Allen, N. 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著者らは競合する利益を宣言しない。

ここでは、培養アストロサイトにおけるミトコンドリア系のダイナミクスおよび回転を縦方向に追従する新規の方法が提案されている。固定された細胞群または1つの個々の細胞(最も頻繁に文献で使用される)24、25のタイムラプスアプローチとは異なり、研究者は、同じ個々の細胞上で数日間の間にミトコンドリア系の進化に従うことができます。高レベルの光暴露が必要で、多くの個々の細胞の選択が実現不可能な単一ウェルライブイメージングとは対照的に、提案された方法は、ウェルの異なる領域のいくつかの異なる細胞を画像化し、それらを再画像化するために様々な時点でそれらの同じ細胞に戻ってくるこの顕微鏡の能力を利用する。対象の各細胞の各測定基準に対して行われるベースラインに対する正規化のおかげで、ミトコンドリア系の複雑さを考慮し、それぞれのベースライン画像に対する各細胞に対する処理の効果を調査します。顕微鏡は、このタイプのイメージングを一度に最大16個のウェルで自律的に行う能力(ウェルあたり5細胞をイメージング)することで、異なる日に様々な条件をイメージングすることに伴う実験的変動性なしに、ミトコンドリア系の異質性を分析中に適切に考慮することができます。
培養の質、LV-G1-MitoTimerバイオセンサーを発現するウイルス感染のレベル、顕微鏡と目的の種類、および適切な細胞の選択は、このプロトコルで可能な限り一貫性を保たなければならない重要な変数である。細胞密度、ベクターの種類、およびウイルス性の基線量体は、質問に応じて適合させることができる。これまでの研究では、LV-G1-MitoTimer式はミトコンドリア関数とダイナミクス21、22、26、27に有害な結果を持たないことが示されていますが、濃度が細胞に対して毒性がないことを確認することが不可欠です(例えば、コントロールの細胞の総数をチェックします)。単一の焦点面が使用されるように、アストロサイトは、(1)できるだけ平坦で、(2)他の標識細胞から分離し(皿中の変位の解析を簡素化する)、および(3)高い蛍光レベルを有する。培養中の細胞は形態において非常に可変であり得るため、ミトコンドリア系は非常に不均一であり得る。この文脈では、ROI(および細胞全体ではない)を分析することは、核内領域のようないくつかの問題のある領域を補償し、変動性を減少させる。比較的類似した細胞に対してベースラインを行い、できるだけ多くの細胞をサンプルすることが不可欠です。結果として、高い含有率の取得および分析顕微鏡が理想的に適しています。この縦方向のモニタリングの間、バイオセンサーの漂白を避けるために細胞を光に過度に露出しないことも重要です。
このイメージング方法は、その複雑さなしではならず、プロトコル全体で、顕微鏡での以前のテスト中に行われたトラブルシューティングを考慮に入れたいくつかのノートが含まれています。例えば、使用されるプレートコーティングの選択は、意図したアッセイに依存するが、アストロサイトの一次培養のための最も適した選択肢のための推奨事項が含まれていた。さらに、細胞間変動のために、1つの条件で少なくとも5細胞に対して画像取得を行う必要があります。具体的には、ベースラインイメージングで選択された細胞の中には死んでしまい、割り当てられた画像取得領域の枠から外れる細胞もあれば、形態を変える細胞もあるので、ミトコンドリアを分析で個別化することは非常に困難です。最初から多くの細胞をイメージングすると、実験の最後に分析するのに十分な大きさのサンプルサイズの細胞が発生する可能性が高くなります。このイメージング技術のより複雑な側面に加えて、このタイプのイメージングと分析の恩恵を受けることができる人に関しては、いくつかの完全な制限があります。画像取得の自動化を最大限に活用するためには、使用する顕微鏡は、画像間の時間間隔の速度(すなわち、このプロトコルでは3sごと)を処理できるオートフォーカスシステムを備え、各画像が撮影される前に問題のセルに一貫して焦点を合わせることができる必要があります。さらに、画像取得プロセス全体を自動化するJOBSソフトウェアがなければ、この方法は、適切な時点で再び各セルを手動で見つけてイメージングする必要があり、画像化されるセルの数によっては困難になり、不可能になる可能性があります。最後に、このイメージング法は、光漂白の問題に対して免疫がない。そのため、他の長期取得方法と同様に、光漂白の影響を受けにくい蛍光マーカーを選択し、可能な限りこの問題を回避するために画像取得を調整することが重要です。
この手法は、現在重要な方法で使用されている他の手法とは異なります。他のタイムラプス研究とは異なり、この技術は、ウェル全体の同じ位置でのイメージングを必要とせず、他の領域を画像化するためにプレートを手動で移動する必要もありません。これにより、研究者は1つの24時間の時間枠で多くの条件で多くの細胞を画像化する能力を可能にする。その結果、各ウェル内の多くの細胞に対してこのイメージングと分析を行う能力は、大きな細胞群を広く研究して得るのと同じ集団情報を提供し、さらに各細胞から特定の尺度を提供する。この方法に対する特定の点は、他の画像取得方法(上記で概説)には適用されない場合がありますが、この利点は、取得後に可能な分析の種類の複雑さを上回ります。この技術は、ミトコンドリア系、そしてその結果、培養されたアストロサイトに対する様々な治療法の正確な影響を研究者が見ることを可能にする。
さらに、この方法は、特定の文脈におけるミトコンドリアの行動と役割に関する多くの異なる科学的な質問に高度にカスタマイズ可能です。ここで概説されたプロトコルは、特に培養されたアストロサイトを扱う。しかし、他の多くの細胞タイプを使用することができ、テストできる治療は調査中の質問によってのみ制限されます。このタイプのイメージングは、ミトコンドリア挙動の集合的知識と理解、ミトコンドリア機能不全につながる根本的なメカニズム、および異なるタイプの細胞に存在する先天的なダイナミクスに対する多くの病理の影響を促進する可能性を秘めています。

アストロサイトは、脳恒常性の維持において重要なプレーヤーです。彼らはおそらく脳内に重要な構造的役割を持つことは最もよく知られています, 血液脳関門の一部として 1 脳の脳の神経細胞とシナプスをサポートすることによって2.ニューロンのアストロサイト支持は、構造3と代謝4、5の両方であり、アストロサイトは神経新生およびシナプト生成を促進する一方で、乳酸のような主要な代謝産物を活性ニューロン4、6、7に提供する。構造支援の役割を超えて、アストロサイトはCa2+シグナル伝達および緩衝(自発的なミトコンドリアCa2+流入を含む)8、9、K+バッファリング10に参加する活性細胞であり、傷害時に脳のニーズに適応し、反応することができます11,12.このような動的細胞なので、アストロサイトは堅牢なエネルギー要件を持ち、効率的なミトコンドリアネットワークを必要とします。これらのミトコンドリアは、過剰な活性酸素種(ROS)13を緩衝する上で重要な役割を有する。エネルギー生成とROSバッファリングの個々またはローカルの役割に加えて、ミトコンドリアはネットワーク14として機能します。この意味で、それらは、ミトコンドリアの核分裂と融合との間の平衡を維持し、それぞれ15の新/減少したミトコンドリアおよび古い/酸化されたミトコンドリアを表す。細胞の全体的な酸化還元状態は、ミトコンドリアネットワークの酸化還元状態によって測定することができる。病理では、これは細胞が最適に機能していない可能性のある光を当てることができる重要な情報です。
近年、細胞内のミトコンドリアのダイナミクスと機能を研究するために多くのセンサーが開発されています。例えば、エネルギー交換(ATP)、酸化還元状態(NADH/NAD+、ROS)、および酵素機能(cAMP、Ca2+、Zn2+)を測定するセンサがミトコンドリア機能16の研究に現在使用されている。中でも、ミトコンドリア形態(大きさ、形状、表面積)、移動性(速度、変位)、ダイナミクス(融合・核分裂イベント)、およびミトコンドリアの回転率およびレドックス状態の変化に従うことを可能にする。MitoTimerは変異型赤蛍光タンパク質であるdrFP58317で、ヒトシトクロムcオキシダーゼ18のサブユニットVIIIからのミトコンドリアシグナルを有し、19は新たに合成されたミトコンドリアを緑色(488nm)および酸化ミトコンドリアを赤色(555nm)で可視化する。緑色(488nm)および赤色(555nm)蛍光比を用い、個々のミトコンドリアの同時評価、それらの形態解析、融合/核分裂事象、および酸化還元状態履歴20,21を可能にする。このユニークな特性は、ミトコンドリアの生理学的および病理学的役割に関する多くの科学的な質問を調査するために使用することができ、したがって、多くの異なる細胞タイプ内のミトコンドリアダイナミクスの根本的なメカニズムを明らかにするために非常に有望である。
我々は最近、ミトコンドリアの動的及び特にインビボおよびインビボ22のアストロサイトにおける機能を研究するために、新しいレンチウイルスベクター(LV-G1-MitoTimer-MiR124T、以下LV-G1-MitoTimerと呼ばれる)を開発した。LV-G1-MitoTimerは、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーターgfaABC1Dの切り捨てられたバージョンを用いて、B3エンハンサー(gfaABC1D(B3)を用いて、以下G1と呼ばれる)先に説明したmiR124T神経細胞脱標的システム23と組み合わせる。それは、インビトロおよびインビボ22におけるアストロサイトにおけるミトコンドリアバイオセンサーの排他的な発現を可能にする。ここでは、ラット海馬アストロサイトの培養を行い、LV-G1-MitoTimerバイオセンサーを装備するためのさまざまなステップと、数回連続した時間/日の間にアストロサイトミトコンドリアの挙動に従うさまざまな顕微鏡ステップを示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>Plexus SANTE</td>
			<td>PL001213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Plexus SANTE</td>
			<td>PL000142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>Plexus SANTE</td>
			<td>PL000133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>LIFE TECH</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>HAMAMATSU</td>
			<td>ORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM)</td>
			<td>THERMOFISHER</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>THERMOFISHER</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>CFI Plan Fluor 100x Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Engines</td>
			<td>LUMENCOR</td>
			<td>SPECTRA X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear-encoded motorized platine</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module</td>
			<td>OKOLAB</td>
			<td>H201-NIKON-TI-S-ER</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x liquid</td>
			<td>THERMOFISHER</td>
			<td>20012068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mm</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Rats</td>
			<td>CHARLES RIVERS</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Nikon NIS-HC</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>NIS-Elements HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V8.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup 500 mL</td>
			<td>MERCK MILLIPORE</td>
			<td>10412701</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of mitochondrial system in cultured astrocytes

ミトコンドリアの神経レベルでの変化に多くの注意が払われているが、最近の証拠は、ミトコンドリアのダイナミクスとアストロサイトの機能が認知に関与していることを示している。本稿ではミトコンドリアバイオセンサーを搭載したアストロサイト培養物のタイムラプスイメージング法について説明する: MitoTimer.ミトタイマーはミトコンドリアダイナミクス、移動性、形態、生物形成、および酸化還元状態を評価するための強力でユニークなツールです。ここでは、培養、画像取得、およびそれ以降のミトコンドリア分析に関する異なる手順を提示する。

LV-G1-MitoTimerに感染したアストロサイトの原発培養は、典型的なミトコンドリアネットワークを示した。治療前に、LV-G1-MitoTimerを発現するアストロサイトは、異種ミトコンドリアサイズと様々な緑/赤色蛍光強度を示した(図3、図4、およびビデオ1)。LV-G1-ミトタイマーを発現するアストロサイト培養のミトコンドリア系を、H20 2(10μM)でインキュベーション前後にモニタリングした。上述した異なるミトコンドリア特徴を12時間(3時間毎)に計算し、その初期状態に正規化(細胞別)した。形態学的レベル(図3B)では、H2O2の効果が約6時間で見え始める。実際、ミトコンドリアは断片化した(長さ、表面積、伸び係数の減少)。この断片化は、治療後12時間でさらに明白である。直径、幅、および球面性は減少しないことに注意してください。酸化還元状態およびターンオーバー(図3C)に関しては、H2O2処置後3時間、緑色ミトコンドリアの割合がアストロサイトにおいて増加した(ミトコンドリア生物発生の急激な増加の結果)。6時間で、緑/赤の比率はベースラインレベルに戻ったが、純粋に赤いミトコンドリアの数は基底レベルから有意に増加した。12時間後、H2O2の酸化処理の結果が目に見え、赤いパンクタの比率と数の大幅な増加をもたらした。治療後のダイナミクスと移動性(図3D)に関しては、全ての基準が一時的に増加した。より長い期間(12時間)では、ミトコンドリアはよりゆっくりと短い距離を移動しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig01.jpg"> 図1:LV-G1-ミトタイマーバイオセンサを発現するアストロサイト培養物(A)LV-G1-ミトタイマーを発現するアストロサイトの共焦点写真(B) 断片化のレベルが異なる還元(緑色)バランス(オレンジ)と酸化(赤)ミトコンドリアの共焦点写真の選択。(C) LV-G1-MitoTimerを発現するアストロサイトで分析可能な異なる基準の要約図。スケールバー:(A)上部パネル:50μm、下部パネル:10 μm、(B) 1 μm)<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig01large.jpg" target="_blank">をクリックして、この図の大きなバージョンを表示してください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig02.jpg"> 図2:ミトコンドリア形態と比解析 (A) 個々のミトコンドリア形態と比率の解析のための GA3 スクリプトの概要。(B) GA3スクリプトで解析したLV-G1-MitoTimerを発現するアストロサイトの初期写真。(C)ミトコンドリア系のアストロサイト系に対して生成されるバイナリマスクの例スケールバー:10 μm(B-C)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig03.jpg"> 図3:H2O2がアストロサイトのミトコンドリア系に及ぼす影響(A)LV-G1-ミトタイマー1h前及び6時間、24時間のH2O2の処理後のLV-G1-ミトタイマーを発現するアストロサイトの写真。(B)ミトコンドリア形態のレーダーチャート、(C)レドックス状態とターンオーバー、および(D)H2O2治療後のベースラインおよび3時間、6時間、および12時間の間にアストロサイトで評価された移動度基準。SA: 表面積;D: 直径;L: 長さ;W: 幅;R: 丸み;S: 球面性;EF: 伸び係数 (=L/W);G/R: 個々の赤/緑比;Gpuncta: 緑のプンクタ ミトコンドリアの割合;Rpuncta: 赤いプンクタミトコンドリアの割合;ディス: 変位;Tr: トラックの長さ;SpとSpV:速度と速度の分散。Str: 真っ直ぐ。スケールバー:20 μm(A)と2.5 μm(差し込み)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig04.jpg"> 図4:LV-G1-MitoTimerを発現し、ベースライン中に均質でバランスのとれたミトコンドリアネットワークを示すアストロサイトの写真。 スケールバー:20μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ビデオ1:培養アストロサイトのミトコンドリア系に対するH2O2治療の効果。H2O2処置前のアストロサイトーミトコンドリア(ベースライン)、ならびに非処理対照細胞と比較してH2O2処置後6時間および24時間。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/movie.mp4" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>形態の基準</td>
			<td>範囲</td>
			<td colspan="3">備考</td>
		</tr>
<tr>
<td>表面積(SA)</td>
			<td>0.5~4 μm2
</td>
			<td colspan="3" rowspan="7">これらの基準は、ミトコンドリアの細分化された細長い特徴を知らせる。それらは一般的に同じ方向に進化します。断片化したミトコンドリアは表面積、直径、長さ、伸び係数が減少し、丸み、球状、幅は変化しないか、大きくなってもよい。</td>
		</tr>
<tr>
<td>直径 (D)</td>
			<td>0.5~1.5 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>長さ (L)</td>
			<td>0.5~5 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>幅 (W)</td>
			<td>0.5~2 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>丸み (R)</td>
			<td>0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>球面(S)</td>
			<td>0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>伸び係数 (EF = L/W)</td>
			<td>1–10</td>
		</tr>
</tbody></table>表1 ミトコンドリア形態に関する選択パラメータの概要.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>レドックス州の基準</td>
			<td>範囲</td>
			<td colspan="3">備考</td>
		</tr>
<tr>
<td>個別比(G/R)</td>
			<td>0–10</td>
			<td colspan="3" rowspan="3">比率は、レドックス状態の結果を示す。細胞内のミトコンドリアの一般的な状態と年齢について知らせます。この比率は、ミトコンドリアの生起と分解と、酸化ミトコンドリアとミトコンドリアの分裂/融合のバランスを考慮することが不可欠です。したがって、緑と赤のパンクタの数の評価は、結果を解釈するのに強力に役立ちます。 緑のプンクタミトコンドリアは、緑の強度が赤の10倍であるときに決定されます。赤いパンクタミトコンドリアは、赤の強度が緑の10倍のときに決定されます。アストロサイトのレドックス状態は、その細胞のすべてのミトコンドリア比の平均です。</td>
		</tr>
<tr>
<td>グリーンプンクタミトコンドリアの割合 (Gプンクタ)</td>
			<td>0%–100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>赤いプンクタミトコンドリアの割合 (Rプンクタ)</td>
			<td>0%–100%</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:ミトコンドリア酸化還元状態に関する選択パラメータの概要.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>モビリティ基準</td>
			<td>範囲</td>
			<td colspan="3">備考</td>
		</tr>
<tr>
<td>変位(ディス)</td>
			<td>0~10 μm</td>
			<td colspan="3" rowspan="5">これらの機能を合わせて、ネットワークの一般的な運動性ダイナミクスを知らせます。静止したミトコンドリアは、短い変位と低速のトラック長さを表示します。一方、振動粒子は、トラック長と変位の差(結果として直線性が低い)と、静電気と比較して速度が向上して区別することができます。</td>
		</tr>
<tr>
<td>トラックの長さ (Tr)</td>
			<td>0~10 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>速度と速度の分散(SpとSpV)</td>
			<td>0~1.5 μm/s ± 0.2 μm/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>真 直 度</td>
			<td rowspan="2">0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Str = 変位/トラック長)</td>
		</tr>
</tbody></table>表3:ミトコンドリア移動性に関する選択パラメータの概要
補足符号化ファイル1:個々のミトコンドリア形態の分析のためのGA3スクリプトファイル. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/Mito_Morpho.ga3" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes

本稿では、ミトタイマーバイオセンサーを搭載したアストロサイト培養物のミトコンドリアタイムラプスイメージング法と、ミトコンドリアダイナミクス、移動性、形態、生物形成、酸化還元状態、およびターンオーバーのマルチパラメトリック解析について説明する。

培養アストロサイトにおけるミトコンドリア系の生画像化

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and ...

このプロトコルは、長い獲得期間にわたって個々の細胞内のミトコンドリアダイナミクスを追跡する方法として顕微鏡の力を大幅に最大化します。細胞の固定グループ上のタイムラプスとは異なり、または一度に1つの細胞上で、細胞間の不均一性について各細胞コントロールの各測定基準のベースラインに正規化する。自動化プラットフォームとウイルスベクターを搭載した顕微鏡を使用すると、あらゆるタイプの細胞にこのプロトコルを使用できます。マルチウェル皿で1平方センチメートル当たり20,000〜25,000個の細胞をメッキし、残りの実験では5%の二酸化炭素を含む大気中で摂氏37度で保存します。インビトロで8日間で、リン酸緩衝生理食塩水で希釈されたミトコンドリアバイオセンサーMitoTimer用のレンチウイルスベクターコードの細胞当たりのP24抗原の0.6ピコグラムを加える。11日間インビトロで、事前に温めた滅菌PBSで2回のスリングを行い、フェノールレッドなしで新鮮なアストロサイト培地を加えます。LV-G1 MitoTimerによるレンチウイルス感染の少なくとも3〜5日後に、アストロサイトのミトコンドリア系を評価する。40倍の倍率を使用して十分なレベルのLV-G1 MitoTimerを表現するミトコンドリアネットワークを用いて、1回のアストロサイトを選択します。細胞のクラスターに位置しない、平らで大きなアストロサイトを選択するように注意してください。次に、緑色チャンネルの490ナノメートル、赤色チャンネルの550ナノメートルで緑色と赤色の蛍光信号を用い、各座標に150倍の倍率を使用して、連続励起を使用して蛍光画像をキャプチャします。ND処理をクリックして、各画像シーケンスの赤と緑のチャンネルの最初のフレームを選択し、フレームを選択します。次に、コンバージョンを選択して赤と緑のチャンネルをマージし、チャンネルをマージします。画像のシェーディングを修正するには、前処理を選択し、自動シェーディング補正を選択します。前処理とローリングボールを選択して、ローリングボールアルゴリズムを適用します。ミトコンドリアごとにバイナリマスクを生成するには、セグメンテーションと閾値を選択します。2 進処理を選択し、境界線をタッチすることで、境界線で切り詰められたオブジェクトを削除します。測定を選択し、次にオブジェクト面積、EEQ直径、長さ、幅、粗さ、円形度、または伸びを選択して、それぞれ表面積、直径、長さ、幅、粗さ、円形度、または伸びを測定します。これらの測定値を含むグループを作成し、MOFO データとして名前を変更します。次に、測定値を選択し、平均強度を選択して、平均緑と赤の強度を測定します。赤を緑色比で測定する比率とを示す。これで、これらの測定値を使用してコンポーザーグループ化し、比率データとして名前を変更します。最後に、参照とテーブルを CSV に選択してテーブルを CSV ファイルにエクスポートし、NIS で追跡モジュールを開き、ビュー、分析、および追跡を選択して [名前を付けて保存] を選択して分析の GA 3 スクリプトを保存します。[新しい ROI の定義] をクリックします。自動検出ツールを使用して、画像シーケンスの最初の画像で25~50ミトコンドリアを選択し、追跡自動検出ROI分析をクリックします。必要に応じて、不適切な ROI トラックを削除し、CSV ファイルにテーブルをエクスポートします。手動で処理する前に測定値を変換ログ。各分析および時間枠について、得られたデータを参照取得で得られた平均によって手動で正規化する。その後、Novaと一致する2つの方法を使用して統計解析を実行します。LV-G1 MitoTimerに感染したアストロサイトの原発培養は、断片化の異なるレベルを有するバランスおよび酸化ミトコンドリアネットワークの減少を示した。過酸化水素処理の前に、LV-G1ミトタイマーを発現するアストロサイトは、様々な緑色および赤色の蛍光強度で異種ミトコンドリアサイズを示した。アストロサイト培養のミトコンドリア形態は、過酸化水素による6時間のインキュベーションの後に断片化した。それは、球状度減少以来、その直径なしで処理の12時間後にさらに明白であった。酸化還元状態とターンオーバーに関しては、過酸化水素処理の3時間後に、緑色のミトコンドリアの割合がアストロサイトで増加した。治療後3時間のダイナミクスと移動性について。すべての基準は一時的に増加しました。このテクニックは、多くの異なる質問に適しています。例えば、神経変性疾患の文脈では、脳に分泌される異なる分子の毒性を調査しています。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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