このプロトコルは、長い獲得期間にわたって個々の細胞内のミトコンドリアダイナミクスを追跡する方法として顕微鏡の力を大幅に最大化します。細胞の固定グループ上のタイムラプスとは異なり、または一度に1つの細胞上で、細胞間の不均一性について各細胞コントロールの各測定基準のベースラインに正規化する。自動化プラットフォームとウイルスベクターを搭載した顕微鏡を使用すると、あらゆるタイプの細胞にこのプロトコルを使用できます。
マルチウェル皿で1平方センチメートル当たり20,000〜25,000個の細胞をメッキし、残りの実験では5%の二酸化炭素を含む大気中で摂氏37度で保存します。インビトロで8日間で、リン酸緩衝生理食塩水で希釈されたミトコンドリアバイオセンサーMitoTimer用のレンチウイルスベクターコードの細胞当たりのP24抗原の0.6ピコグラムを加える。11日間インビトロで、事前に温めた滅菌PBSで2回のスリングを行い、フェノールレッドなしで新鮮なアストロサイト培地を加えます。
LV-G1 MitoTimerによるレンチウイルス感染の少なくとも3〜5日後に、アストロサイトのミトコンドリア系を評価する。40倍の倍率を使用して十分なレベルのLV-G1 MitoTimerを表現するミトコンドリアネットワークを用いて、1回のアストロサイトを選択します。細胞のクラスターに位置しない、平らで大きなアストロサイトを選択するように注意してください。
次に、緑色チャンネルの490ナノメートル、赤色チャンネルの550ナノメートルで緑色と赤色の蛍光信号を用い、各座標に150倍の倍率を使用して、連続励起を使用して蛍光画像をキャプチャします。ND処理をクリックして、各画像シーケンスの赤と緑のチャンネルの最初のフレームを選択し、フレームを選択します。次に、コンバージョンを選択して赤と緑のチャンネルをマージし、チャンネルをマージします。
画像のシェーディングを修正するには、前処理を選択し、自動シェーディング補正を選択します。前処理とローリングボールを選択して、ローリングボールアルゴリズムを適用します。ミトコンドリアごとにバイナリマスクを生成するには、セグメンテーションと閾値を選択します。
2 進処理を選択し、境界線をタッチすることで、境界線で切り詰められたオブジェクトを削除します。測定を選択し、次にオブジェクト面積、EEQ直径、長さ、幅、粗さ、円形度、または伸びを選択して、それぞれ表面積、直径、長さ、幅、粗さ、円形度、または伸びを測定します。これらの測定値を含むグループを作成し、MOFO データとして名前を変更します。
次に、測定値を選択し、平均強度を選択して、平均緑と赤の強度を測定します。赤を緑色比で測定する比率とを示す。これで、これらの測定値を使用してコンポーザーグループ化し、比率データとして名前を変更します。
最後に、参照とテーブルを CSV に選択してテーブルを CSV ファイルにエクスポートし、NIS で追跡モジュールを開き、ビュー、分析、および追跡を選択して [名前を付けて保存] を選択して分析の GA 3 スクリプトを保存します。[新しい ROI の定義] をクリックします。自動検出ツールを使用して、画像シーケンスの最初の画像で25~50ミトコンドリアを選択し、追跡自動検出ROI分析をクリックします。
必要に応じて、不適切な ROI トラックを削除し、CSV ファイルにテーブルをエクスポートします。手動で処理する前に測定値を変換ログ。各分析および時間枠について、得られたデータを参照取得で得られた平均によって手動で正規化する。
その後、Novaと一致する2つの方法を使用して統計解析を実行します。LV-G1 MitoTimerに感染したアストロサイトの原発培養は、断片化の異なるレベルを有するバランスおよび酸化ミトコンドリアネットワークの減少を示した。過酸化水素処理の前に、LV-G1ミトタイマーを発現するアストロサイトは、様々な緑色および赤色の蛍光強度で異種ミトコンドリアサイズを示した。
アストロサイト培養のミトコンドリア形態は、過酸化水素による6時間のインキュベーションの後に断片化した。それは、球状度減少以来、その直径なしで処理の12時間後にさらに明白であった。酸化還元状態とターンオーバーに関しては、過酸化水素処理の3時間後に、緑色のミトコンドリアの割合がアストロサイトで増加した。
治療後3時間のダイナミクスと移動性について。すべての基準は一時的に増加しました。このテクニックは、多くの異なる質問に適しています。
例えば、神経変性疾患の文脈では、脳に分泌される異なる分子の毒性を調査しています。
