이 프로토콜은 긴 획득 기간 동안 개별 세포 내의 미토콘드리아 역학을 추적하는 방법으로 현미경 검사법의 힘을 크게 극대화합니다. 고정된 세포 그룹 또는 한 번에 하나의 셀에 시간 경과와는 달리, 세포 간의 이질성에 대한 각 세포 대조군의 각 측정 기준에 대한 기준선으로 정규화한다. 자동화 된 플랫폼과 적응 된 바이러스 벡터가 장착 된 현미경으로 모든 유형의 세포에 이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.
멀티 웰 요리에 평방 센티미터 당 20, 000 ~ 25, 000 세포를 도금하여 시작하여 실험의 나머지 부분에 대한 5 %의 이산화탄소를 포함하는 대기 하에서 섭씨 37도에 저장합니다. 시험관 내 8일 동안, 인산염 완충식식염에 희석된 미토콘드리아 바이오 센서 미토타임에 대한 렌티바이러스 벡터 코딩의 세포당 P24 항원 0.6 피코 그램을 첨가한다. 11일 체외에서 미리 데워진 멸균 PBS로 두 개의 세시를 수행하고 페놀 레드 없이 신선한 성상세포 배지를 추가합니다.
LV-G1 미토타이머를 가진 렌즈바이러스 감염 후에 적어도 3 5 일 점성세포 미토콘드리아 시스템을 평가합니다. 40배의 배율을 사용하여 충분한 수준의 LV-G1 미토타임을 표현하는 미토콘드리아 네트워크로 잘 5개의 성상세포를 선택하십시오. 가능한 한 평평하고 큰 성상 세포를 선택하고 셀 의 클러스터에 위치하지 않도록주의하십시오.
그런 다음 녹색 채널490 나노미터에서 순차적 흥분을 이용한 형광 영상을 캡처하고 녹색 및 빨간색 형광 신호가 있는 빨간색 채널에 대해 550 나노미터를 사용하고 각 좌표에 대해 150배배배배배를 사용한다. ND 프로세싱을 클릭하여 각 이미지 시퀀스에 대한 빨간색 및 녹색 채널의 첫 번째 프레임을 선택하고 프레임을 선택합니다. 그런 다음 변환을 선택하고 채널을 병합하여 빨간색과 녹색 채널을 병합합니다.
이미지 샤이딩을 수정하려면 사전 처리를 선택한 다음 자동 그늘 보정을 선택합니다. 사전 처리 및 롤링 볼을 선택하여 롤링 볼 알고리즘을 적용합니다. 각 미토콘드리온에 대해 이진 마스크를 생성하려면 세분화 및 임계값을 선택합니다.
이진 처리 및 접기 테두리를 선택하여 테두리에 의해 잘린 객체를 제거합니다. 측정, 다음 객체 영역, EEQ 직경, 길이, 폭, 거칠기, 원형 또는 연신을 선택표면적, 직경, 길이, 폭, 거칠기, 원형, 원형 또는 연신도. 이러한 측정으로 그룹을 구성하고 MOFO 데이터로 이름을 바꿉니다.
그런 다음 측정을 선택한 다음 평균 강도를 선택하여 평균 녹색 및 빨간색 강도를 측정합니다. 그리고 녹색 비율로 빨간색을 측정하는 비율. 이제 이러한 측정을 사용하여 작곡가 그룹을 사용하여 비율 데이터로 이름을 바꿉니다.
마지막으로 참조 및 테이블을 CSV로 선택하여 CSV 파일로 테이블을 내보낸 다음, NIS에서 추적 모듈을 열고 보기, 분석 및 추적을 선택하여 Save As.Begin을 선택하여 GA 3 분석 스크립트를 저장합니다. 새 ROI 정의를 클릭합니다. 자동 검출 도구를 사용하여 이미지 시퀀스의 첫 번째 이미지에서 25~50개의 미토콘드리아를 선택한 다음 자동 감지 된 ROI 분석을 클릭합니다.
필요한 경우 잘못된 ROI 트랙을 삭제하고 테이블을 CSV 파일로 내보냅니다. 수동으로 로그 처리 하기 전에 측정변환. 각 해석 및 기간동안 참조 획득에서 얻은 평균으로 결과 데이터를 수동으로 정규화합니다.
그런 다음 Nova와 일치하는 양방향으로 통계 분석을 수행합니다. LV-G1 미토타이머에 감염된 성상세포의 1차 배양은 서로 다른 수준의 단편화를 통해 균형 잡힌 산화 된 미토콘드리아 네트워크를 감소시켰다. 과산화수소 처리 전에 LV-G1 미토타이머를 발현하는 성상세포는 다양한 녹색 및 적색 형광 강도에서 이질적인 미토콘드리아 크기를 보였다.
성상세포 배양의 미토콘드리아 형태는 과산화수소로 6시간 동안 배양한 후 단편화되었다. 그것은 더욱 명백한 12 구형 감소 이후 그들의 직경 없이 치료 후 시간. 과산화수소 처리 후에 3 시간, 홍선 상태 및 회전에 관하여, 성상세포에서 녹색 미토콘드리아의 비율이 증가했습니다.
치료 후 3 시간 역학 및 이동성에 관한. 모든 기준은 일시적으로 증가했습니다. 이 기술은 다양한 질문에 적합합니다.
예를 들면, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서, 우리는 두뇌에서 분비된 다른 분자의 에스트로세포 독성을 조사하고 있습니다.
