Denne protokollen maksimerer effekten av mikroskopi som en metode for å spore mitokondriedynamikk i individuelle celler over lange oppkjøpsperioder. I motsetning til tidsforløp på en fast gruppe celler, eller på én celle om gangen, normaliseres normalisering til en grunnlinje for hvert målte vilkår i hver cellekontroll for heterogeniteten mellom celler. Med et mikroskop utstyrt med automatisert plattform og viral vektortilpasset, kan vi bruke denne protokollen for alle typer celler.
Begynn med å plating 20.000 til 25.000 celler per kvadratcentimeter i flerbrønnsretter og lagre dem på 37 grader celsius under en atmosfære som inneholder 5% karbondioksid for resten av eksperimentet. På åtte dager in vitro, tilsett 0,6 pico gram P24 antigen per celle av lentiviral vektorkoding for mitokondriebiosensor MitoTimer fortynnet i fosfatbufret saltvann. Ved 11 dagers in vitro, utfør to vasker med forvarmet steril PBS og tilsett frisk astrocyttmedium uten fenolrød.
Vurder det astrocytiske mitokondriesystemet minst tre til fem dager etter lentivirale infeksjoner med LV-G1 MitoTimer. Velg fem astrocytter per brønn med et mitokondrienettverk som uttrykker tilstrekkelige nivåer av LV-G1 MitoTimer ved hjelp av en forstørrelse på 40 ganger. Pass på å velge astrocytter flate og store som mulig og ikke plassert i klynger av celler.
Ta deretter fluorescensbilder ved hjelp av sekvensiell eksitasjon ved 490 nanometer for den grønne kanalen og 550 nanometer for den røde kanalen med grønne og røde fluorescerende signaler og bruk en forstørrelse på 150 ganger for hver koordinat. Velg den første rammen for røde og grønne kanaler for hver bildesekvens ved å klikke på ND Processing og velge ramme. Slå deretter sammen de røde og grønne kanalene ved å velge konverteringer og slå sammen kanalen.
Hvis du vil rette bildeskygge, velger du forhåndsbehandling og deretter automatisk skyggeleggingskorrigering. Påfør rullekulealgoritmen ved å velge forbehandling og rullende ball. Hvis du vil generere binære masker for hver mitokondridrier, velger du segmentering og terskelverdi.
Fjern alle objekter som er avkortet av kantlinjen, ved å merke binær behandling og berøringskantlinje. Velg mål, og deretter objektområde, EEQ-diameter, lengde, bredde, grovhet, sirkularitet eller forlengelse for å måle henholdsvis overflateareal, diameter, lengde, bredde, grovhet, sirkularitet eller forlengelse. Skriv en gruppe med disse målene, og gi den nytt navn som MOFO-data.
Velg deretter måling, og velg deretter gjennomsnittsintensitet for å måle gjennomsnittlige grønne og røde intensiteter. Og forhold for å måle det røde med grønt forhold. Nå komponistgruppe med disse målingene og gi den nytt navn som forholdsdata.
Eksporter til slutt tabellen til en CSV-fil ved å velge referanse og tabell til CSV, og lagre deretter GA 3-analyseskriptet ved å velge Lagre som.Begynn ved å åpne sporingsmodulen i NIS og velge visning, analyse og sporing. Klikk på definer ny avkastning. Med det automatiske deteksjonsverktøyet velger du 25 til 50 mitokondrier på det første bildet av bildesekvensen, og deretter klikker du på spor automatisk oppdagede ROIer analysere.
Hvis det er nødvendig, sletter du feil avkastningsspor og eksporterer tabellen til en CSV-fil. Logg om målene manuelt før behandling. For hver analyse og tidsramme normaliseres de resulterende dataene manuelt med gjennomsnittet oppnådd i referanseanskaffelsen.
Utfør deretter statistisk analyse ved hjelp av en toveis matchet en Nova. Primærkulturen av astrocytter infisert med LV-G1 MitoTimer viste redusert balansert og oksidert mitokondrienettverk med forskjellige fragmenteringsnivåer. Før hydrogenperoksidbehandling viste astrocytter som uttrykte LV-G1 MitoTimer heterogen mitokondriestørrelse i ulike grønne og røde fluorescensintensiteter.
Mitokondriemorfologien til astrocyttkulturer ble fragmentert etter seks timers inkubasjon med hydrogenperoksid. Det var enda tydeligere 12 timer etter behandlingen uten diameter med siden sfæriskhetsreduksjon. Når det gjelder redokstilstand og omsetning, tre timer etter en hydrogenperoksidbehandling, økte andelen grønne mitokondrier i astrocytter.
Om dynamikken og mobiliteten tre timer etter behandling. Alle kriteriene ble midlertidig økt. Denne teknikken er egnet for mange forskjellige spørsmål.
For eksempel, i sammenheng med nevrodegenerativ sykdom, undersøker vi den estrocytiske toksisiteten til forskjellige molekyler utskilt i hjernen.
