Name: live-imaging of mitochondrial system in cultured astrocytes
Uploaded: 2021-11-16T13:00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes at JoVE.com

Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Fundação Synapsis concedida à K.R. e ao Hospital Universitário de Lausanne (CHUV). Os autores agradecem a ajuda de Nikon, em particular J. Gannevat.

O presente protocolo foi realizado com a aprovação de um comitê de ética (acordo VD3602, Lausanne, Suíça) e segue as diretrizes europeias para o uso de animais.
1. Cultura primária de astrócito hipocampal de ratos
<ol><li>Sacrifique cinco filhotes de rato (Wistar IGS Rat) por decapitação no pós-natal dia 1-2.</li>
	<li>Remova o cérebro e mantenha-o em uma placa de Petri contendo 5 mL de meio astrócito fresco (DMEM com GlutaMAX suplementado com penicilina/estreptomicina 10% fresco).</li>
	<li>Isolar o hipocampo. Dissociar em 5 mL do meio astrócito por três passagens através de uma agulha de 21 G e três passagens através de uma agulha de 25 G.</li>
	<li>Transfira as células dissociadas para um tubo de centrífuga de 15 mL e conte em um hemócito.</li>
	<li>Placa 20.000-25.000 células/cm2 em pratos multiwell (9,4 mm x 10,7 mm x 9,3 mm) e armazená-los a 37 °C sob uma atmosfera contendo 5% de CO2 para o resto do experimento.</li>
	<li>Substitua o meio inteiramente em 3 dias in vitro (DIV3).</li>
	<li>No DIV8, adicione 0,6 pg de antígeno p24 por célula de codificação vetorial lentiviral para mitocondrial biosensor MitoTimer (LV-G1-MitoTimer22) diluído em soro fisáfero tamponado de fosfato (PBS + 0,01% BSA).</li>
	<li>No DIV9, lave com PBS 1x estéril pré-aquecido (37 °C) e adicione meio astrócito fresco.</li>
	<li>No DIV11, realize 2 lavagens com PBS 1x estérei pré-aquecido (37 °C) e adicione meio astrócito fresco sem vermelho fenol. NOTA: A escolha do revestimento depende do ensaio pretendido. Como um revestimento padrão para a cultura primária de astrócito, recomenda-se usar 0,2 mg/mL de poli-D-lysine ou 8,7 μg/cm2 de matriz de membrana de porão (por exemplo, Matrigel). Para visualizar o sistema mitocondrial dos astrócitos, é essencial trabalhar em células achatadas e esticadas. Neste contexto, a combinação de matriz de membrana de porão em u-slides IBIDI é a mais adequada. Também é crucial não trabalhar com fenol vermelho, que é tóxico para a célula sob exposição repetida à luz.</li>
</ol>2. Monitoramento a longo prazo do sistema mitocondrial.
<ol><li>Avalie o sistema mitocondrial astrócito um mínimo de 3-5 dias após as infecções lentivirais com LV-G1-MitoTimer (para permitir um nível suficiente de fluorescência nas mitocôndrias).</li>
	<li>Imagem das células com um microscópio invertido controlado pelo software de aquisição e análise e um módulo para automação completa de aquisição. NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter os detalhes do software e do módulo utilizados neste estudo.</li>
	<li>Certifique-se de que o microscópio esteja equipado com uma incubadora de gaiolas (ver Tabela de Materiais) para manter a cultura astrócito a 5% de CO2 e 37 °C durante todo o experimento.</li>
	<li>Capture imagens de fluorescência usando excitação sequencial a 490 nm (para canal verde) e 550 nm (para canal vermelho) com detecção de sinais de fluorescência verde (500-540 nm para canal verde) e vermelho (550-600 nm para canal vermelho).</li>
	<li>Selecione 5 astrócitos por poço com uma rede mitocondrial expressando níveis suficientes de LV-G1-MitoTimer usando uma ampliação de 40x. Tenha o cuidado de selecionar astrócitos o mais plano e grande possível e não localizados em aglomerados de células (para trabalhar em células individuais).</li>
	<li>Salve as coordenadas das 5 células selecionadas em um arquivo xlm (map.xlm). Este map.xlm permite que o usuário retorne às mesmas células ao longo do tempo.</li>
	<li>Adquirir sequências de imagem (1 imagem/s para 60 s) utilizando uma ampliação de 150x (objetivo de imersão em óleo de 100x, 1,5x de ampliação intermediária) para cada coordenada.</li>
	<li>Reinclua aquisição de imagem (1 imagem/s para 60 s) para os mesmos astrócitos 6h, 12h e 24h após os tratamentos. NOTA: Use um microscópio equipado com um sistema de foco automático rápido e eficiente. Nesse contexto, foi utilizada a solução de hardware chamada Perfect Focus System (PFS). O PFS usa sensores de linha LED e CCD de 870 nm infravermelhos próximos para combater flutuações de foco axial em tempo real durante investigações de imagem de longo prazo.</li>
</ol>3. Análise da morfologia mitocondrial individual e da razão LV-G1-MitoTimer
NOTA: A Análise Geral do NIS 3 (GA3) da Nikon foi utilizada para automatizar a análise morfométrica neste estudo.
<ol><li>Para cada sequência de imagem (linha de base, 6h, 12h, 24 h), selecione o primeiro quadro para canais vermelho e verde clicando em ND Processing > Select Frame.</li>
	<li>Mescle os canais vermelho e verde selecionando conversões > Canal de Mesclagem.</li>
	<li>Para corrigir o sombreamento da imagem, selecione Pré-processamento > correção de sombreamento automático.</li>
	<li>Aplique o algoritmo rolling ball selecionando pré-processamento > Rolling Ball.</li>
	<li>Para gerar máscaras binárias para cada mitocôndria, selecione Segmentação > Limiar.</li>
	<li>Remova quaisquer objetos truncados pela fronteira selecionando processamento binário > Borda Tocante.</li>
	<li>Para medir a área da superfície, selecione Medição > Área do Objeto.</li>
	<li>Para medir o diâmetro, selecione Medição > diâmetro do Eq.</li>
	<li>Para medir o comprimento, selecione Medição > Comprimento.</li>
	<li>Para medir a largura, selecione Medir > largura.</li>
	<li>Para medir a rugosidade, selecione Medição > Rugosidade.</li>
	<li>Para medir a circularidade, selecione Medição > Circularidade.</li>
	<li>Para medir o alongamento, selecione Medição > Alongamento.</li>
	<li>Componha um grupo (clique com o botão direito) com a medição acima e renomeie-o como MorphoData.</li>
	<li>Medir intensidade verde média selecionando medição > intensidade média.</li>
	<li>Medir intensidade vermelha média selecionando medição > intensidade média.</li>
	<li>Para medir a razão Vermelho/Verde, selecione Taxa de > de Medição.</li>
	<li>Componha um grupo (clique com o botão direito do mouse) com a medição acima e renomeie-o como RatioData.</li>
	<li>Exporte a tabela para um arquivo CSV selecionando Tabela de > de referência para CSV.</li>
	<li>Salve o script GA3 de análise selecionando Save As NOTA: Uma lista não exaustiva dos critérios utilizados neste procedimento é resumida na Figura 1, Tabela 1e Tabela 2. O arquivo de script GA3 de análise está disponível em suplementar(Arquivo de Codificação Suplementar 1 e Figura 2). Os limiares utilizados foram adaptados para individualizar o maior número possível de mitocôndrias (excluindo grandes redes mitocondriais, sempre que possível). Sempre que possível, as redes mitocondriais são individualizadas manualmente ou excluídas das análises. Devido à variabilidade intercelular, realize essas análises em pelo menos 20-25 células por condição (com um mínimo de 50 mitocôndrias por célula).</li>
</ol>4. Análise da motilidade mitocondrial
NOTA: Devido à alta complexidade dos movimentos mitocondriais, a análise manual de motilidade é preferida. Aqui, o sistema NIS Element da Nikon foi usado para rastrear manualmente mitocôndrias.
<ol><li>Abra o módulo de rastreamento no NIS, selecione Exibir > análise > rastreamento.</li>
	<li>Clique em Definir novo ROI.</li>
	<li>Com a Ferramenta de Detecção Automática,selecione 25-50 mitocôndrias na primeira imagem da sequência de imagem.</li>
	<li>Clique em Rastrear ROIs detectados automaticamente .</li>
	<li>Se necessário, exclua as faixas incorretas do ROI.</li>
	<li>Exporte a tabela para um arquivo CSV. NOTA: Uma lista não exaustiva dos critérios utilizados neste procedimento é resumida na Figura 1 e Na Tabela 3. Uma análise de rastreamento geralmente dá um caminho representando os movimentos do centro de cada objeto rastreado. As diferentes opções de rastreamento devem ser definidas na opção de rastreamento. Favorecer a seleção de mitocôndrias isoladas que estão suficientemente distantes umas das outras para facilitar o rastreamento. Mantenha apenas os objetos que poderiam ser consistentemente rastreados durante toda a sequência. Proceda da mesma maneira para remover outliers devido ao rastreamento de má qualidade. Consequentemente, o conjunto de objetos analisados nesta seção é diferente do analisado para análises morfológicas estáticas e geralmente será menor.</li>
</ol>5. Transformação de dados, normalização e análise estatística
NOTA: Principalmente devido à alta heterogeneidade das mitocôndrias, os dados gerados muitas vezes têm uma distribuição não normal.
<ol><li>Transformar manualmente as medidas antes do processamento.</li>
	<li>Para cada análise e prazo, normalize manualmente os dados resultantes pela média daqueles obtidos na aquisição de referência.</li>
	<li>Além disso, considere uma segunda/dupla normalização para uma condição de controle, por exemplo, para avaliar o efeito de um tratamento.</li>
	<li>Em seguida, realize a análise estatística utilizando um ANOVA bidirecional. Aqui foi usado o GraphPad Prism V8.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não declaram interesses concorrentes.

Aqui, propõe-se um novo método para seguir longitudinalmente a dinâmica e a rotatividade do sistema mitocondrial em um astrócito culto. Ao contrário de uma abordagem de lapso de tempo em um grupo fixo de células ou uma célula individual por vez (mais frequentemente usada na literatura)24,25, os pesquisadores podem acompanhar a evolução do sistema mitocondrial durante vários dias nas mesmas células individuais. Em contraste com a imagem única e viva onde altos níveis de exposição à luz são necessários, e a seleção de muitas células individuais é menos viável, o método proposto aproveita a capacidade deste microscópio de fotografar várias células diferentes em diferentes áreas de um poço e voltar para essas mesmas células em vários pontos de tempo para reexplodê-las. Graças à normalização de uma linha de base realizada para cada critério medido em cada célula de interesse, leva em conta a complexidade do sistema mitocondrial e investiga o efeito do tratamento em cada célula em relação à sua própria imagem de linha de base. A capacidade do microscópio de realizar de forma autônoma esse tipo de imagem em até 16 poços por vez (imagens de 5 células por poço) permite que a heterogeneidade do sistema mitocondrial seja adequadamente levada em conta durante a análise sem a variabilidade experimental que vem com imagens de várias condições em dias diferentes.
A qualidade das culturas, os níveis de infecções virais expressando o biosensor LV-G1-MitoTimer, o tipo de microscópio e objetivos, e a seleção de células adequadas são variáveis críticas que devem permanecer o mais consistentes possível neste protocolo. As densidades celulares, o tipo de vetor e os títulos virais podem ser adaptados de acordo com a pergunta. Embora trabalhos anteriores demonstrem que a expressão LV-G1-MitoTimer não tem consequências deletérios para a função mitocondrial e a dinâmica21,22,26,27, é essencial verificar se a concentração não é tóxica para as células (por exemplo, verificando bem o número total de células em controle). Como um único plano focal é usado, os astrócitos devem ser: (1) o mais plano possível, (2) isolado de outras células rotuladas (para simplificar a análise em caso de deslocamento no prato) e (3) possuir altos níveis de fluorescência. Como as células na cultura podem ser altamente variáveis na morfologia, o sistema mitocondrial pode ser altamente heterogêneo. Nesse contexto, a análise de ROIs (e não toda a célula) compensa algumas regiões problemáticas, como as regiões perinucleares, e diminui a variabilidade. É essencial fazer a linha de base em células relativamente semelhantes e provar o maior número possível de células. Consequentemente, microscópios de aquisição e análise de alto conteúdo são idealmente adequados. Durante esse monitoramento longitudinal, também é importante não expor demais as células à luz para evitar branqueamento biosensor.
Este método de imagem não é sem suas complexidades, e ao longo do protocolo, várias notas são incluídas, que levam em conta a solução de problemas feitas durante testes anteriores com o microscópio. Por exemplo, a escolha do revestimento de placas utilizada depende do ensaio pretendido, mas foram incluídas recomendações para as escolhas mais adequadas para culturas primárias de astrócito. Além disso, a aquisição de imagens deve ser realizada em pelo menos 5 células por condição devido à variabilidade intercelular. Mais especificamente, algumas células selecionadas na imagem de linha de base morrerão, algumas sairão do quadro da área de aquisição de imagens atribuídas, e algumas mudarão sua morfologia, tornando as mitocôndrias muito difíceis de individualizar na análise. Imagens de muitas células desde o início aumentam a probabilidade de um tamanho amostral grande o suficiente de células para analisar no final do experimento. Além dos aspectos mais complexos desta técnica de imagem, existem algumas limitações absolutas, tanto quanto quem pode se beneficiar desse tipo de imagem e análise. Para aproveitar ao máximo a automatização da aquisição de imagens, o microscópio utilizado deve ter um sistema de foco automático que possa lidar com a velocidade dos intervalos de tempo entre as imagens (ou seja, a cada 3 s neste protocolo) e possa se concentrar consistentemente na célula em questão antes de cada imagem ser tirada. Além disso, sem o software JOBS, que automatiza todo o processo de aquisição de imagens, esse método torna-se árduo e potencialmente impossível dependendo do número de células sendo imagens, pois exigiria encontrar e fotografar manualmente cada célula novamente no momento apropriado. Finalmente, este método de imagem não é imune à questão do fotobleaching. Por essa razão, como em qualquer método de aquisição de longo prazo, é importante escolher marcadores fluorescentes menos suscetíveis à fotobleaching e adaptar a aquisição de imagens para evitar esse problema tanto quanto possível.
Essa técnica difere de outras atualmente utilizadas de forma crucial. Ao contrário de outros estudos de lapso de tempo, esta técnica não requer imagens na mesma posição no poço o tempo todo, nem requer movimento manual da placa para visualizar outras áreas. Isso permite aos pesquisadores a capacidade de imagem de muitas células em muitas condições em um período de 24 horas. Consequentemente, a capacidade de realizar essa imagem e análise em muitas células de cada poço dá à mesma informação populacional que se obteria de estudar amplamente um grande grupo de células, ao mesmo tempo em que fornece medidas específicas de cada célula. Embora algumas especificidades desse método possam não se aplicar a outros métodos de aquisição de imagem (descritos acima), os benefícios superam as complicações com o tipo de análise possível após a aquisição. Essa técnica permite que os pesquisadores vejam as ramificações exatas de vários tratamentos no sistema mitocondrial e, consequentemente, nos astrócitos cultos.
Além disso, este método é altamente personalizável para muitas questões científicas diferentes sobre o comportamento mitocondrial e papéis em contextos específicos. Aqui o protocolo delineado trata especificamente de astrócitos cultos. No entanto, muitos outros tipos de células podem ser usados, e os tratamentos que podem ser testados são limitados apenas pelas questões que estão sendo investigadas. Esse tipo de imagem tem o potencial de avançar o conhecimento coletivo e a compreensão do comportamento mitocondrial, os mecanismos subjacentes que levam à disfunção mitocondrial e os efeitos de muitas patologias sobre a dinâmica inata presente em diferentes tipos de células.

Os astrócitos são atores críticos na manutenção da homeostase cerebral. Eles são talvez mais conhecidos por ter papéis estruturais significativos no cérebro, como parte da barreira hematoencefálica1 e por suportar neurônios e sinapses em todo o cérebro2. O suporte astrócito dos neurônios é estrutural3 e metabólico4,5, com astrócitos promovendo neurogênese e sinápcia, ao mesmo tempo em que fornece metabólitos-chave como lactato aos neurônios ativos4,6,7. Além do papel do suporte estrutural, os astrócitos são células ativas que participam da sinalização e tampão ca2+ (incluindo influxos mitocondriais espontâneos Ca2+) 8,9, K+ tampão10, e podem se adaptar e reagir às necessidades do cérebro em tempos de lesão11,12 . Sendo células tão dinâmicas, os astrócitos possuem requisitos de energia robustos, que necessitam de uma rede mitocondrial eficiente. Essas mitocôndrias também têm um papel crucial no tampão de espécies de oxigênio reativas excessivas (ROS)13. Além de suas funções individuais ou locais de geração de energia e tampão ROS, as mitocôndrias funcionam como uma rede14. Nesse sentido, mantêm o equilíbrio entre mitocôndrias fissionantes e fusão, representando mitocôndrias novas/reduzidas e mitocôndrias mais antigas/oxidadas,respectivamente 15. O estado geral de redox de uma célula pode ser medido pelo estado redox da rede mitocondrial. Na patologia, esta é uma informação crítica que pode lançar luz sobre quais células podem não estar funcionando de forma ideal.
Nos últimos anos, muitos sensores foram desenvolvidos para estudar a dinâmica e as funções das mitocôndrias nas células. Por exemplo, sensores que medem a troca de energia (ATP), estado redox (NADH/NAD+, ROS) e funcionalidade enzimática (cAMP, Ca2+, Zn2+) são atualmente utilizados no estudo da função mitocondrial16. Entre eles, o MitoTimer permite acompanhar as mudanças na morfologia mitocondrial (tamanho, forma, área da superfície), mobilidade (velocidade, deslocamento) e dinâmica (eventos de fusão e fissionação), bem como a taxa geral de rotatividade mitocondrial e estado redox. MitoTimer é uma proteína fluorescente vermelha mutante, drFP58317, com um sinal mitocondrial da subunidade VIII do citocromo humano c oxidase18,19 para visualizar mitocôndrias recém-sintetizadas em verde (488 nm) e mitocôndrias oxidadas em vermelho (555 nm). O uso da relação fluorescência verde (488 nm) e vermelho (555 nm) permite avaliação simultânea de mitocôndrias individuais, sua análise de morfologia, eventos de fusão/fissão e história do estado de redox20,21. Esta propriedade única pode ser usada para investigar muitas questões científicas sobre os papéis fisiológicos e patológicos das mitocôndrias e, portanto, é muito promissora para desvendar os mecanismos subjacentes da dinâmica mitocondrial dentro de muitos tipos de células diferentes.
Recentemente desenvolvemos um novo vetor lentiviral (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, de agora em diante chamado LV-G1-MitoTimer) para estudar a dinâmica das mitocôndrias e funções especificamente em astrócitos in vitro e in vivo22. O promotor LV-G1-MitoTimer usa uma versão truncada do promotor gfaABC1D (GFAP) da proteína ácida glicênica (GFAP) gfaABC1D, com um enhancer B3 (gfaABC1D(B3), doravante chamado G1) combinado com o sistema de detargeting neuronal miR124T descrito anteriormente23. Permite a expressão exclusiva do biosensor mitocondrial em astrócitos in vitro e in vivo22. Apresentados aqui estão os diferentes passos para realizar uma cultura de astrócitos hipocampais de ratos e equipá-los com o biosensor LV-G1-MitoTimer, bem como os diferentes passos de microscopia para acompanhar o comportamento das mitocôndrias de astrócitos durante várias horas/dias consecutivas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>Plexus SANTE</td>
			<td>PL001213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Plexus SANTE</td>
			<td>PL000142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>Plexus SANTE</td>
			<td>PL000133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>LIFE TECH</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>HAMAMATSU</td>
			<td>ORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM)</td>
			<td>THERMOFISHER</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax Supplement</td>
			<td>THERMOFISHER</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>CFI Plan Fluor 100x Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Engines</td>
			<td>LUMENCOR</td>
			<td>SPECTRA X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear-encoded motorized platine</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module</td>
			<td>OKOLAB</td>
			<td>H201-NIKON-TI-S-ER</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x liquid</td>
			<td>THERMOFISHER</td>
			<td>20012068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mm</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Rats</td>
			<td>CHARLES RIVERS</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Nikon NIS-HC</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>NIS-Elements HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V8.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup 500 mL</td>
			<td>MERCK MILLIPORE</td>
			<td>10412701</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of mitochondrial system in cultured astrocytes

Embora muita atenção tenha sido dada às alterações mitocondriais no nível neuronal, evidências recentes demonstram que a dinâmica mitocondrial e a função nos astrócitos estão implicadas na cognição. Este artigo descreve o método de imagem de lapso de tempo de culturas de astrócitos equipadas com um biosensor mitocondrial: MitoTimer. MitoTimer é uma ferramenta poderosa e única para avaliar a dinâmica mitocondrial, mobilidade, morfologia, biogênese e estado redox. Aqui, são apresentados os diferentes procedimentos de cultura, aquisição de imagens e análise mitocondrial subsequente.

A cultura primária dos astrócitos infectados com LV-G1-MitoTimer exibiu redes mitocondriais típicas. Antes do tratamento, os astrócitos que expressam LV-G1-MitoTimer mostraram o tamanho mitocondrial heterogêneo e várias intensidades de fluorescência verde/vermelha(Figura 3, Figura 4e Vídeo 1). O sistema mitocondrial de culturas de astrócito expressando LV-G1-MitoTimer foi monitorado antes e depois da incubação com H202 (10 μM). As diferentes características mitocondriais descritas acima foram calculadas acima de 12 h (a cada 3 h) e normalizadas (célula por célula) ao seu estado inicial. No nível morfológico(Figura 3B),os efeitos de H2O2 começam a ser visíveis em cerca de 6 h. De fato, as mitocôndrias foram fragmentadas (diminuição do comprimento, área da superfície e fator de alongamento). Esta fragmentação é ainda mais óbvia 12 h após o tratamento. Note que os diâmetros, larguras e esfericidade não foram reduzidos. Quanto ao estado redox e à rotatividade(Figura 3C), 3 h após o tratamento H2O2, a proporção de mitocôndrias verdes aumentou em astrócitos (consequência de um rápido aumento da biogênese mitocondrial). Às 6h, a relação verde/vermelho voltou aos níveis de linha de base, mas o número de mitocôndrias puramente vermelhas aumentou significativamente dos níveis basais. Após 12 h, as consequências do tratamento oxidativo de H2O2 foram visíveis e resultaram em um aumento substancial na razão e no número de punctas vermelhas. Quanto à dinâmica e mobilidade (Figura 3D),3h após o tratamento, todos os critérios foram efetivamente aumentados. A longo prazo (12 h), as mitocôndrias se moviam mais lentamente e em distâncias mais curtas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig01.jpg"> Figura 1: Cultura astrocito expressando biosensor LV-G1-MitoTimer. (A) Fotografias confocal de astrócitos expressando LV-G1-MitoTimer. (B) Seleção de fotografias confocal de mitocôndrias reduzidas (verdes) balanceadas (laranja) e oxidadas (vermelhas) com diferentes níveis de fragmentação. (C) Diagrama sumário dos diferentes critérios disponíveis para análise em um astrócito expressando LV-G1-MitoTimer. Barra de escala: (A) Painel superior: 50 μm, painel inferior: 10 μm, (B) 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig02.jpg"> Figura 2: Morfologia mitocondrial e análise de razão. (A) Visão geral do script GA3 para a análise da morfologia mitocondrial individual e da razão. (B) Fotografias iniciais de um astrócito expressando LV-G1-MitoTimer analisadas com o script GA3. (C) Exemplo de máscaras binárias geradas para o sistema mitocondrial de astrócitos. Barra de escala: 10 μm (B-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig03.jpg"> Figura 3: Os efeitos de H2O2 no sistema mitocondrial dos astrócitos. (A) Fotografias de astrócitos expressando LV-G1-MitoTimer 1 h antes e 6 h, 24 h após o tratamento com PBS (CTRL) e 10 μM de H2O2. (B) Gráficos de radar de morfologia mitocondrial, (C) estado redox e rotatividade, e (D) critérios de mobilidade avaliados em astrócitos durante a linha de base e 3 h, 6 h e 12 h após o tratamento H2O2. SA: Área de superfície; D: Diâmetro; L: Comprimento; W: Largura; R: Arredondamento; S: Esfericidade; EF: Fator de alongamento (=L/W); G/R: Razão individual vermelho/verde; GPuncta: Percentual de mitocrias de puncta verde; Rpuncta: Percentual de mitocrias puncta vermelhas; Dis: Deslocamento; Tr: Comprimento da faixa; SP e SpV: variância de velocidade e velocidade; Str: Retidão. Barra de escala: 20 μm (A) e 2,5 μm (inset). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62957/62957fig04.jpg"> Figura 4: Fotografias de astrócitos expressando LV-G1-MitoTimer e mostrando uma rede mitocondrial homogênea e equilibrada durante a linha de base. Barra de escala: 20 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/62957fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo 1: Efeito dotratamento H2O2 no sistema mitocondrial de astrócitos cultivados. Mitocôndrias astrócitos antes do tratamento H2O2 (linha de base), bem como 6 h e 24 h após o tratamento H2O2 em comparação com a célula de controle não tratada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/movie.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Critérios de morfologia</td>
			<td>Gama</td>
			<td colspan="3">Observações</td>
		</tr>
<tr>
<td>Área de superfície (SA)</td>
			<td>0,5-4 μm2
</td>
			<td colspan="3" rowspan="7">Esses critérios informam sobre as características fragmentadas alongadas das mitocôndrias. Eles geralmente evoluem na mesma direção. Mitocôndrias fragmentadas terão diminuição da área da superfície, diâmetro, comprimento e fator de alongamento, enquanto a arredondamento, a esférico e a largura podem ser inalteradas ou aumentadas.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Diâmetro (D)</td>
			<td>0,5-1,5 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Comprimento (L)</td>
			<td>0,5-5 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Largura (W)</td>
			<td>0,5-2 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Arredondamento (R)</td>
			<td>0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Esfericidade (S)</td>
			<td>0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fator de alongamento (EF = L/W)</td>
			<td>1–10</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Resumo dos parâmetros selecionados para morfologia mitocondrial.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Critérios do Estado de Redox</td>
			<td>Gama</td>
			<td colspan="3">Observações</td>
		</tr>
<tr>
<td>Razão individual (G/R)</td>
			<td>0–10</td>
			<td colspan="3" rowspan="3">A razão indica o resultado do estado redox. Informa sobre o estado geral e a idade das mitocôndrias na célula. É essencial considerar que essa razão é o equilíbrio da biogênese e da degradação das mitocôndrias e a fissão/fusão de mitocôndrias oxidadas com mitocôndrias reduzidas. Portanto, a avaliação do número de punctas verdes e vermelhas pode ajudar fortemente a interpretar os resultados.  Mitocrias puncta verdes são determinadas quando a intensidade do verde é 10 vezes maior que a do vermelho. Mitocrias puncta vermelhas são determinadas quando a intensidade do vermelho é 10 vezes maior que a do verde. O estado redox de um astrócito é a média de todas as proporções de mitocôndrias dessa célula.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Percentual de mitocrias puncta verde (Gpuncta)</td>
			<td>0%–100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Porcentagem de mitocrias puncta vermelhas (Rpuncta)</td>
			<td>0%–100%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Resumo dos parâmetros selecionados para o estado de redox mitocondrial.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Critérios de mobilidade</td>
			<td>Gama</td>
			<td colspan="3">Observações</td>
		</tr>
<tr>
<td>Deslocamento (Dis)</td>
			<td>0-10 μm</td>
			<td colspan="3" rowspan="5">Juntos, essas características informam a dinâmica geral de motilidade da rede. Mitocôndrias estacionárias exibem deslocamento curto e comprimento de faixa com baixa velocidade. Por outro lado, as partículas oscilatórias podem ser diferenciadas com uma diferença entre o comprimento da pista e o deslocamento (resultando em baixa retidão) e uma velocidade aumentada em comparação com a estática.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Comprimento da faixa (Tr)</td>
			<td>0-10 μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Variância de velocidade e velocidade (Sp e SpV)</td>
			<td>0-1,5 μm/s ± 0,2 μm/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Linearidade</td>
			<td rowspan="2">0–1</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Str = comprimento de deslocamento/faixa)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Resumo dos parâmetros selecionados para mobilidade mitocondrial.
Arquivo de codificação suplementar 1: arquivo de script GA3 para análise da morfologia mitocondrial individual. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62957/Mito_Morpho.ga3" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>

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Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes

Este artigo descreve o método de imagem mitocondrial time-lapse de culturas de astrócito equipadas com biosensor MitoTimer e a análise multiparamétrica resultante da dinâmica mitocondrial, mobilidade, morfologia, biogênese, estado redox e rotatividade.

Imagem ao vivo do Sistema Mitocondrial em Astrócitos Cultivados

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and ...

Este protocolo maximiza muito o poder da microscopia como um método para rastrear a dinâmica mitocondrial dentro de células individuais durante longos períodos de aquisição. Ao contrário do lapso de tempo em um grupo fixo de células, ou em uma célula de cada vez, a normalização para uma linha de base para cada critério medido em cada célula controla a heterogeneidade entre as células. Com um microscópio equipado com plataforma automatizada e vetor viral adaptado, podemos usar este protocolo para cada tipo de células.Comece emplacando de 20.000 a 25.000 células por centímetro quadrado em pratos multi-poços e armazene-os a 37 graus celsius sob uma atmosfera que contém 5% de dióxido de carbono para o resto do experimento. Em oito dias in vitro, adicione 0,6 gramas de pico de antígeno P24 por célula de codificação vetorial lentiviral para biosensor mitocondrial MitoTimer diluído em soro fisáfero tamponado fosfato. Aos 11 dias in vitro, realize duas lavagens com PBS estéril pré-aquecido e adicione meio de astrócito fresco sem fenol vermelho.Avalie o sistema mitocondrial astrocítico pelo menos três a cinco dias após as infecções lentivirais com LV-G1 MitoTimer. Selecione cinco astrócitos por poço com uma rede mitocondrial expressando níveis suficientes de LV-G1 MitoTimer usando uma ampliação de 40 vezes. Tendo o cuidado de selecionar astrócitos planos e grandes o mais possível e não localizados em aglomerados de células.Em seguida, capture imagens de fluorescência usando excitação sequencial em 490 nanômetros para o canal verde e 550 nanômetros para o canal vermelho com sinais fluorescentes verdes e vermelhos e usando uma ampliação de 150 vezes para cada coordenada. Selecione o primeiro quadro para canais vermelhos e verdes para cada sequência de imagem clicando em ND Processing e selecione quadro. Em seguida, mescle os canais vermelho e verde selecionando conversões e mesclando canal.Para corrigir o sombreamento da imagem, selecione o pré-processamento e, em seguida, a correção de sombreamento automático. Aplique o algoritmo da bola rolando selecionando pré-processamento e bola rolando. Para gerar máscaras binárias para cada mitocôndria, selecione segmentação e limiar.Remova todos os objetos truncados pela fronteira selecionando o processamento binário e tocando a borda. Selecione a medição e, em seguida, a área do objeto, o diâmetro do EEQ, o comprimento, a largura, a rugosidade, a circularidade ou o alongamento para medir a área da superfície, diâmetro, comprimento, largura, rugosidade, circularidade ou alongamento, respectivamente. Componha um grupo com essas medidas e renomeie-o como dados MOFO.Em seguida, selecione a medição e selecione a intensidade média para medir as intensidades médias verde e vermelha. E proporção para medir o vermelho por razão verde. Agora, o grupo de compositores com essas medidas e renomeá-lo como dados de razão.Por fim, exporte a tabela para um arquivo CSV selecionando referência e tabela para CSV e, em seguida, salve o script GA 3 de análise selecionando Save As.Begin abrindo o módulo de rastreamento no NIS e selecionando exibição, análise e rastreamento. Clique em definir novo ROI. Com a ferramenta de detecção automática, selecione 25 a 50 mitocôndrias na primeira imagem da sequência de imagem e, em seguida, clique na análise de ROIs detectados automaticamente.Se necessário, exclua as faixas de ROI incorretas e exporte a tabela para um arquivo CSV. O registro manual transforma as medidas antes do processamento. Para cada análise e prazo normalizar manualmente os dados resultantes pela média obtida na aquisição de referência.Em seguida, realize a análise estatística usando uma via de duas maneiras combinada com uma Nova. A cultura primária dos astrócitos infectados pelo LV-G1 MitoTimer exibiu redes mitocondriais equilibradas e oxidadas reduzidas com diferentes níveis de fragmentação. Antes do tratamento de peróxido de hidrogênio, os astrócitos que expressavam LV-G1 MitoTimer mostraram tamanho mitocondrial heterogêneo em várias intensidades de fluorescência verde e vermelha.A morfologia mitocondrial das culturas de astrócito foi fragmentada após seis horas de incubação com peróxido de hidrogênio. Ficou ainda mais evidente 12 horas após o tratamento sem seus diâmetros com a redução da esfericidade. Quanto ao estado redox e à rotatividade, três horas após um tratamento de peróxido de hidrogênio, a proporção de mitocôndrias verdes aumentou em astrócitos.Quanto à dinâmica e mobilidade três horas após o tratamento. Todos os critérios foram aumentou transitoriamente. Esta técnica é adequada para muitas questões diferentes.Por exemplo, no contexto da doença neurodegenerativa, estamos investigando a toxicidade estrocítica de diferentes moléculas secretadas no cérebro.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-imagem de translocação da PKC em células Sf9 e em neurônios sensoriais Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Neurociência

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Imagens ao vivo de axônios da raiz dorsal após rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

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Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

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Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...