Этот протокол значительно максимизирует мощность микроскопии как метода отслеживания митохондриальной динамики в отдельных клетках в течение длительных периодов приобретения. В отличие от покадровой съемки на фиксированной группе клеток или на одной клетке за раз, нормализация до исходного уровня для каждого измеренного критерия в каждой клетке контролирует гетерогенность между клетками. С помощью микроскопа, оснащенного автоматизированной платформой и адаптированным вирусным вектором, мы можем использовать этот протокол для любого типа клеток.
Начните с покрытия от 20 000 до 25 000 клеток на квадратный сантиметр в многолуночной посуде и храните их при 37 градусах Цельсия в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа до конца эксперимента. Через восемь дней in vitro добавьте 0,6 пикограмма антигена P24 на клетку лентивирусного вектора, кодирующего митохондриальный биосенсор MitoTimer, разбавленный в фосфатном буферном физиологическом растворе. Через 11 дней in vitro выполните две промывки предварительно подогретым стерильным PBS и добавьте свежую астроцитарную среду без фенолового красного цвета.
Оцените астроцитарную митохондриальную систему по крайней мере через три-пять дней после лентивирусных инфекций LV-G1 MitoTimer. Выберите пять астроцитов на лунку с митохондриальной сетью, экспрессирующей достаточные уровни LV-G1 MitoTimer, используя увеличение в 40 раз. Позаботьтесь о том, чтобы выделить астроциты плоскими и крупными как можно больше и не расположенными в скоплениях клеток.
Затем захватывайте флуоресцентные изображения, используя последовательное возбуждение на 490 нанометров для зеленого канала и 550 нанометров для красного канала с зелеными и красными флуоресцентными сигналами и используя увеличение в 150 раз для каждой координаты. Выберите первый кадр для красного и зеленого каналов для каждой последовательности изображений, щелкнув ND Processing и выбрав кадр. Затем объедините красный и зеленый каналы, выбрав конверсии и объединив канал.
Чтобы исправить затенение изображения, выберите предварительную обработку, а затем автоматическую коррекцию затенения. Примените алгоритм прокатки шара, выбрав предварительную обработку и прокатку шара. Чтобы создать двоичные маски для каждой митохондрии, выберите сегментацию и пороговое значение.
Удалите все объекты, усеченные границей, выбрав двоичную обработку и коснувшись границы. Выберите измерение, а затем площадь объекта, диаметр EEQ, длину, ширину, шероховатость, окружность или относительное удлинение, чтобы измерить площадь поверхности, диаметр, длину, ширину, шероховатость, окружность или относительное удлинение соответственно. Составьте группу с этими измерениями и переименуйте ее в данные MOFO.
Затем выберите измерение, а затем выберите среднюю интенсивность, чтобы измерить среднюю зеленую и красную интенсивности. И соотношение для измерения красного по зеленому соотношению. Теперь композитор группируется с этими измерениями и переименовывает его в данные соотношения.
Наконец, экспортируйте таблицу в CSV-файл, выбрав ссылку и таблицу в CSV, а затем сохраните скрипт анализа GA 3, выбрав Сохранить как.Начните с открытия модуля отслеживания в NIS и выбора просмотра, анализа и отслеживания. Нажмите на определение новой рентабельности инвестиций. С помощью инструмента автоматического обнаружения выберите от 25 до 50 митохондрий на первом изображении последовательности изображений, а затем нажмите на треке автоматического анализа ROI.
При необходимости удалите неправильные дорожки ROI и экспортируйте таблицу в CSV-файл. Вручную регистрируйте преобразования измерений перед обработкой. Для каждого анализа и таймфрейма вручную нормализуйте полученные данные по среднему значению, полученному при эталонном сборе.
Затем выполните статистический анализ, используя двухстороннюю согласованную Nova. Первичная культура астроцитов, инфицированных LV-G1 MitoTimer, демонстрировала сниженные сбалансированные и окисленные митохондриальные сети с различными уровнями фрагментации. До лечения перекисью водорода астроциты, экспрессирующие LV-G1 MitoTimer, демонстрировали гетерогенный размер митохондрий в различных зеленых и красных интенсивностях флуоресценции.
Митохондриальная морфология культур астроцитов была фрагментирована после шести часов инкубации с перекисью водорода. Это было еще более очевидно через 12 часов после обработки без их диаметров с момента уменьшения сферичности. Что касается окислительно-восстановительного состояния и оборота, через три часа после обработки перекисью водорода доля зеленых митохондрий увеличилась в астроцитах.
Относительно динамики и подвижности через три часа после лечения. Все критерии были временно повышены. Эта техника подходит для многих различных вопросов.
Например, в контексте нейродегенеративных заболеваний мы исследуем эстроцитарную токсичность различных молекул, секретируемых в мозге.
